p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞Connexin 43表达影响.pdf

第5 9卷 第3期2 0 2 3年0 6月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.3J u n e 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-1 1-0 6;修订日期2 0 2 3-0 6-1 0 基金项目山东省自然科学基金重大基础研究项目(Z R 2 0 1 9-Z D 3 1);山东省自然科学基金面上项目(Z R 2 0 2 0 MC 0 7 2)第一作者李建港(1 9 9 7-),男,硕士研究生。通信作 者 姜 宏(1 9 7 3-),女,博 士,教 授,博 士 生 导 师。E-m a i l:h o n g j i a n g q d u.e d u.c n。焦倩(1 9 8 5-),女,博士,副教授,硕士生导师。E-m a i l:j i a o q i a n q d u.e d u.c n。p 5 3基因突变对胶质母细胞瘤细胞C o n n e x i n4 3表达影响李建港,郇雪洁,焦倩,姜宏(青岛大学国家生理学重点(培育)学科,山东 青岛 2 6 6 0 7 1)摘要 目的 探究p 5 3基因突变对胶质母细胞瘤细胞连接蛋白4 3(C o n n e x i n4 3)表达的影响。方法 培养胶质母细胞瘤U 8 7细胞(p 5 3野生型)与U 2 5 1细胞(p 5 3突变型),采用W e s t e r nb l o t t i n g方法分别检测两种细胞中p 5 3蛋白与C o n n e x i n4 3蛋白的表达水平。结果 胶质母细胞瘤U 2 5 1细胞中p 5 3基因发生突变,与U 8 7细胞相比,p 5 3蛋白表达水平降低(t=2.9 4 8,P0.0 5);U 2 5 1细胞中C o n n e x i n4 3蛋白的表达水平显著高于U 8 7细胞(t=2.7 7 1,P0.0 5)。结论 在胶质母细胞瘤细胞中,p 5 3基因突变可能会提高C o n n e x i n4 3蛋白的表达量。关键词 基因,p 5 3;胶质母细胞瘤;细胞系,肿瘤;连接蛋白4 3 中图分类号 R 3 3 8.2 文献标志码 A 文章编号 2 0 9 6-5 5 3 2(2 0 2 3)0 3-0 3 6 1-0 3d o i:1 0.1 1 7 1 2/j m s.2 0 9 6-5 5 3 2.2 0 2 3.5 9.0 9 1 开放科学(资源服务)标识码(O S I D)网络出版 h t t p s:/l i n k.c n k i.n e t/u r l i d/3 7.1 5 1 7.R.2 0 2 3 0 8 0 2.0 9 0 1.0 0 1;2 0 2 3-0 8-0 2 1 3:0 7:3 4E F F E C T SO Fp 5 3G E N E MU T A T I O NO NC O N N E X I N4 3E X P R E S S I O NI NG L I O B L A S T OMAC E L L S L IJ i a n g a n g,HU ANX u e j i e,J I A OQ i a n,J I ANGH o n g(S t a t eK e yD i s c i p l i n e s:P h y s i o l o g y(I n c u b a t i o n),D e p a r t m e n t o fP h y s i o l o g y,Q i n g d a oU n i-v e r s i t y,Q i n g d a o2 6 6 0 7 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so fp 5 3g e n em u t a t i o no nt h ee x p r e s s i o no fC o n n e x i n4 3i ng l i o b l a s t o m ac e l l s.M e t h o d s I nc u l t u r e dg l i o b l a s t o m aU 8 7c e l l s(w i l d-t y p ep 5 3g e n e)a n dU 2 5 1c e l l s(m u t a n tp 5 3g e n e),t h ee x p r e s s i o no fp 5 3p r o t e i na n dC o n n e x i n4 3p r o t e i nw a sm e a s u r e db yW e s t e r nb l o t.R e s u l t s T h ep 5 3p r o t e i n l e v e lw a s s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d i nU 2 5 1c e l l sc o m p a r e dw i t hU 8 7c e l l s(t=2.9 4 8,P0.0 5).T h ee x p r e s s i o nl e v e lo fC o n n e x i n4 3p r o t e i ni nU 2 5 1c e l l sw a ss i g n i f i-c a n t l y i n c r e a s e dt h a nt h a to fU 8 7c e l l s(t=2.7 7 1,P0.0 5).C o n c l u s i o n T h em u t a t i o no f t h ep 5 3g e n em a yi n c r e a s et h ee x-p r e s s i o no fC o n n e x i n4 3p r o t e i n i ng l i o b l a s t o m ac e l l s.K E Y WO R D S g e n e s,p 5 3;g l i o b l a s t o m a;c e l l l i n e,t u m o r;C o n n e x i n4 3 弥漫性胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,占中枢神经系统恶性肿瘤的8 0%1。世界卫生组织(WHO)根据其组织学和分子特征将它们归类为级2。级胶质母细胞瘤(G BM)最具侵袭性,且中位生存期较差3。p 5 3被认为是一个关键的肿瘤抑制基因,其功能障碍对肿瘤发生具有重要影响4。p 5 3基因发生突变的肿瘤约占人类肿瘤的5 0%,一些p 5 3突变体具有促进肿瘤发生发展的特性5。缝隙连接由连接蛋白组成,连接蛋白是一种跨膜蛋白,可组装成质膜中的通道6。缝隙连接信号负责相当大比例的细胞通讯,通过与相邻细胞形成的缝隙连接,可向邻近细胞递送和交换小分子肽、离子、内源核酸和其他细胞代谢物。因此,缝隙连接的异常表达可以改变细胞的新陈代谢,影响肿瘤的发生和进展7。连接蛋白4 3(C o n n e x i n4 3)是目前发现细胞膜上表达最丰富的连接蛋白8。它能调节包括增殖在内的多种细胞功能活动9,其表达异常会引起癌症等多种病理变化1 0。有研究表明,C o n n e x i n4 3可以促进胶质母细胞瘤的侵袭1 1。但胶质母细胞瘤中p 5 3突变和C o n n e x i n4 3的调节关系目前尚不明确。本实验选用p 5 3野生型的U 8 7细胞1 2和p 5 3突变型的U 2 5 1细胞1 3,检测C o n-n e x i n4 3的表达,旨在探讨p 5 3基因突变对胶质母细胞瘤细胞C o n n e x i n4 3表达的影响。1 材料与方法1.1 实验材料本实验所用细胞为人胶质母细胞瘤U 8 7细胞与U 2 5 1细胞,均为贴壁生长的细胞,其中U 8 7细胞为p 5 3野生型细胞,而U 2 5 1细胞则为p 5 3突变型细胞。高糖DMEM细胞培养液购于以色列B i o l o-3 6 2青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷g i c a l I n d u s t r i e s公司,胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司,青链霉素合剂购于北京索莱宝公司,p 5 3抗体、C o n n e x i n4 3抗体和GA P DH抗体均购于美国C S T公司,羊抗兔I g G-HR P购于上海爱必信生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养 将U 8 7与U 2 5 1细胞分别接种于含体积分数0.0 1青链霉素合剂和体积分数0.1 0胎牛血清的高糖DMEM培养液中,置于3 7、含体积分数0.0 5C O2的培养箱中培养,待细胞融合度达8 0%9 0%时,用胰酶消化23m i n,加入等量的完全培养液终止消化,收集到1 5m L的离心管中,以10 0 0r/m i n离心5m i n后丢弃上清液,加入新的完全培养液,用吸管轻轻吹打5 08 0次后充分悬浮细胞,转移到新的培养瓶中进行培养。1.2.2 W e s t e r nb l o t t i n g检测p 5 3和C o n n e x i n4 3蛋白的表达 将U 8 7细胞和U 2 5 1细胞悬液按照每孔11 08/L的密度分别接种于6孔板中,待细胞融合度达到8 0%左右时将6孔板从培养箱中取出,每孔加入1 0 0L裂解液在冰上裂解3 0m i n后提取两种细胞的蛋白。加入5L o a d i n gB u f f e r,在水中煮沸1 0m i n变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P AG E)。每个凝胶孔的蛋白上样量为2 0g,用9 0V的稳定电压进行电泳,用3 0 0mA的稳定电流转膜9 0m i n,根据所需目的蛋白的分子量对P V D F膜进行剪裁,然后以1 0g/L的脱脂奶粉封闭9 0m i n,分别加入p 5 3抗体(110 0 0)、C o n-n e x i n4 3抗体(110 0 0)以及GA P DH抗体(11 00 0 0)4孵育过夜。用T B S T溶液漂洗3次(每次1 0 m i n)之后加入二抗(11 00 0 0)室温孵 育6 0m i n,再用T B S T溶液漂洗3次。用E C L化学发光液进行显影并拍照。使用I m a g e J软件分析p 5 3、C o n n e x i n4 3和GA P DH条带的灰度值,目的蛋白的表达水平以p 5 3、C o n n e x i n4 3与GA P DH的比值表示。1.3 统计学方法利用G r a p h P a dP r i s m软件对数据进行统计学分析,计量资料以xs表示,两组比较采用两独立样本t检验,P0.0 5认为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 两种细胞中p 5 3蛋白表达的比较W e s t e r nb l o t t i n g结果显示,U 8 7和U 2 5 1细胞中p 5 3蛋白的相对表达水平分别为1.2 8 00.2 2 7和0.5 7 00.0 8 0(n=6)。与U 8 7细胞相比较,U 2 5 1细胞中p 5 3蛋白的表达水平明显降低,差异具有统计学意义(t=2.9 4 8,P0.0 5)。见图1。2.2 两种细胞中C o n n e x i n4 3蛋白表达的比较W e s t e r nb l o t t i n g检测结果显示,U 8 7细胞和U 2 5 1细胞中C o n n e x i n4 3蛋白的相对表达水平分别为0.3 7 00.0 9 6和0.8 2 00.1 3 1(n=6)。与U 8 7细胞相比较,U 2 5 1细胞中C o n n e x i n4 3蛋白的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(t=2.7 7 1,P0.0 5)。见图2。图1 W e s t e r nb l o t t i n g检测两种细胞内p 5 3蛋白的表达图2 W e s t e r nb l o t t i n g检测两种细胞内C o n n e x i n4 3蛋白的表达3 讨 论胶质母细胞瘤是目前最常见和最具侵袭性的成人脑肿瘤,容易复发而且预后较差,5年生存率仅为5%1 4,主要原因是由于肿瘤的广泛浸润、细胞异质性以及放化疗抗性1 5-1 7。p 5 3是如今研究最广泛的肿瘤抑制因子之一,它能调节各种细胞过程,包括细胞的侵袭与增殖1 8。在正常情况下,p 5 3的活性维持在基础水平,但这种活性可能会在不同的应激条件下增加,例如不同类型的D NA损伤和致癌性损伤1 9。所以p 5 3通路的失调被认为是肿瘤发生中的关键事件,在大多数的人类癌症中,p 5 3出现下调或突变5。有研究表明,在人类前列腺癌细胞中,C o n n e x i n4 3蛋白的表达随着肿瘤细胞恶性程度的增加而升高,其在肿瘤内的分布发生变化,并与细胞侵袭之间存在相关性2 0。但也有研究发现,在胰腺导管腺癌细胞中,p 5 3突变体可以通过促进C o n n e x i n4 3蛋白的降解来增强细胞的迁移侵袭能力2 1。而在胶质母细胞瘤细胞中,C o n n e x i n4 3的表达增加可以增强细胞的侵袭能力,敲除U 8 7细胞中的C o n n e x i n 3期李建港,等.p 5 3基因突变对胶质母细胞瘤细胞C o n n e x i n4 3表达影响3 6 34 3则会显著降低细胞的侵袭能力2 2。因此,胶质母细胞瘤细胞中依赖于C o n n e x i n4 3的细胞通讯,可能是促进胶质母细胞瘤侵袭的一个重要因素。本实验结果显示,与U 8 7细胞相比,U 2 5 1细胞中C o n-n e x i n4 3蛋白的表达显著升高,表明p 5 3基因的突变可能会导致胶质母细胞瘤细胞中C o n n e x i n4 3蛋白的表达升高。有研究显示,U 2 5 1细胞在体内比U 8 7细胞具有更强的侵袭性和浸润性2 3,该特性是否与C o n n e x i n4 3表达上调有关有待进一步研究。本研究后续将探讨p 5 3突变调控C o n n e x i n4 3的机制及与胶质瘤发展的关系,以期为靶向治疗胶质母细胞瘤提供实验数据。参考文献1O S T R OM QT,G I T T L EMANH,F U L O PJ,e t a l.C B T RU Ss t a t i s t i c a lr e p o r t:p r i m a r yb r a i na n dc e n t r a ln e r v o u ss y s t e mt u m o r sd i a g n o s e d i n t h eU n i t e dS t a t e s i n2 0 0 82 0 1 2J.N e u-r o-o n c o l o g y,2 0 1 5,1 7(S u p p l 4):i v 1-i v 6 2.2L OU I SD N,P E R R Y A,R E I F E N B E R G E R G,e ta l.T h e2 0 1 6W o r l dH e a l t hO r g a n i z a t i o nc l a s s i f i c a t i o no f t u m o r so f t h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e m:as u mm a r yJ.A c t aN e u r o p a t h o l o g i-c a,2 0 1 6,1 3 1(6):8 0 3-8 2 0.3B L E E K E RFE,MO L E NAA R RJ,L E E N S T R AS.R e c e n ta d v a n c e si nt h em o l e c u l a ru n d e r s t a n d i n go fg l i o b l a s t o m aJ.J o u r n a l o fN e u r o-O n c o l o g y,2 0 1 2,1 0 8(1):1 1-2 7.4A S C HAU E RL,MU L L E RPAJ.N o v e l t a r g e t sa n di n t e r a c-t i o np a r t n e r so fm u t a n tp 5 3G a i n-O f-F u n c t i o nJ.B i o c h e m i c a lS o c i e t yT r a n s a c t i o n s,2 0 1 6,4 4(2):4 6 0-4 6 6.5MU L L E RPAJ,VOU S D E N K H.p 5 3m u t a t i o n s i nc a n c e rJ.N a t u r eC e l lB i o l o g y,2 0 1 3,1 5(1):2-8.6HE R V JC,B OURME Y S T E RN,S A R R OU I L HED,e ta l.G a p j u n c t i o n a l c o m p l e x e s:f r o mp a r t n e r s t o f u n c t i o n sJ.P r o-g r e s s i nB i o p h y s i c sa n dM o l e c u l a rB i o l o g y,2 0 0 7,9 4(1-2):2 9-6 5.7P OY E TC,B U S E RL,R OUD N I C KYF,e ta l.C o n n e x i n4 3e x p r e s s i o np r e d i c t sp o o rp r o g r e s s i o n-f r e es u r v i v a li np a t i e n t sw i t hn o n-m u s c l e i n v a s i v eu r o t h e l i a lb l a d d e r c a n c e rJ.J o u r n a lo fC l i n i c a lP a t h o l o g y,2 0 1 5,6 8(1 0):8 1 9-8 2 4.8GOO D E NOUGH D A,P AU LDL.G a pj u n c t i o n sJ.C o l dS p r i n gH a r b o rP e r s p e c t i v e s i nB i o l o g y,2 0 0 9,1(1):a 0 0 2 5 7 6.9P O I N T I SG,G I L L E R ONJ,C A R E T T ED,e t a l.P h y s i o l o g i-c a l a n dp h y s i o p a t h o l o g i c a l a s p e c t so fc o n n e x i n sa n dc o mm u n i-c a t i n gg a pj u n c t i o n si n s p e r m a t o g e n e s i sJ.P h i l o s o p h i c a lT r a n s a c t i o n so f t h eR o y a l S o c i e t yo fL o n d o nS e r i e sB,B i o l o g i-c a lS c i e n c e s,2 0 1 0,3 6 5(1 5 4 6):1 6 0 7-1 6 2 0.1 0I S MA I LR,R A S H I DR,AN D R A B IK,e t a l.P a t h o l o g i c a l i m-p l i c a t i o n so fC x 4 3d o w n-r e g u l a t i o ni nh u m a nc o l o nc a n c e rJ.A s i a nP a c i f i c J o u r n a l o fC a n c e rP r e v e n t i o n,2 0 1 4,1 5(7):2 9 8 7-2 9 9 1.1 1L I NJHC,T AKANOT,C O T R I NAML,e t a l.C o n n e x i n4 3e n h a n c e s t h e a d h e s i v i t ya n dm e d i a t e s t h e i n v a s i o no fm a l i g n a n tg l i o m ac e l l sJ.T h eJ o u r n a lo fN e u r o s c i e n c e:t h e O f f i c i a lJ o u r n a l o f t h eS o c i e t yf o rN e u r o s c i e n c e,2 0 0 2,2 2(1 1):4 3 0 2-4 3 1 1.1 2L E ESW,K I M H K,L E EN H,e t a l.T h es y n e r g i s t i ce f f e c to f c o m b i n a t i o nt e m o z o l o m i d ea n dc h l o r o q u i n et r e a t m e n t i sd e-p e n d e n to na u t o p h a g yf o r m a t i o na n dp 5 3s t a t u s i ng l i o m ac e l l sJ.C a n c e rL e t t e r s,2 0 1 5,3 6 0(2):1 9 5-2 0 4.1 3B R Z D OV M,QUANT E,T G E LL,e t a l.M o d u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n i nU 2 5 1g l i o b l a s t o m ac e l l sb yb i n d i n go fm u-t a n tp 5 3R 2 7 3 Ht oi n t r o n i ca n di n t e r g e n i cs e q u e n c e sJ.N u-c l e i cA c i d sR e s e a r c h,2 0 0 9,3 7(5):1 4 8 6-1 5 0 0.1 4B A T A S H R,A S NA N,S C HA F F E RP,e ta l.G l i o b l a s t o m am u l t i f o r m e,d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n t;r e c e n t l i t e r a t u r er e v i e wJ.C u r r e n tM e d i c i n a lC h e m i s t r y,2 0 1 7,2 4(2 7):3 0 0 2-3 0 0 9.1 5D EGOO I J E R MC,GU I L L NNAVA R R O M,B E R NA R D SR,e ta l.A ne x p e r i m e n t e rsg u i d et og l i o b l a s t o m ai n v a s i o np a t h w a y sJ.T r e n d si n M o l e c u l a r M e d i c i n e,2 0 1 8,2 4(9):7 6 3-7 8 0.1 6W I C K W,K E S S L E R T.N e w g l i o b l a s t o m a h e t e r o g e n e i t ya t l a s-as h a r e dr e s o u r c eJ.N a t u r e R e v i e w s N e u r o l o g y,2 0 1 8,1 4(8):4 5 3-4 5 4.1 7K I M Y,K I M KH,L E EJ,e t a l.W n t a c t i v a t i o n i s i m p l i c a t e di ng l i o b l a s t o m ar a d i o r e s i s t a n c eJ.L a b o r a t o r yI n v e s t i g a t i o n,2 0 1 2,9 2(3):4 6 6-4 7 3.1 8WAWR Y K-GAWD A E,C HY L I S KA-WR Z O SP,L I S-S O-C HO C KA M,e ta l.P 5 3p r o t e i ni np r o l i f e r a t i o n,r e p a i ra n da p o p t o s i so f c e l l sJ.P r o t o p l a s m a,2 0 1 4,2 5 1(3):5 2 5-5 3 3.1 9L OWES W.A c t i v a t i o no fp 5 3b yo n c o g e n e sJ.E n d o c r i n e-R e l a t e dC a n c e r,1 9 9 9,6(1):4 5-4 8.2 0Z HAN GA,H I T OM IM,B A R-S HA I NN,e t a l.C o n n e x i n4 3e x p r e s s i o n i sa s s o c i a t e dw i t hi n c r e a s e dm a l i g n a n c yi np r o s t a t ec a n c e r c e l l l i n e sa n d f u n c t i o n s t op r o m o t em i g r a t i o nJ.O n c o-t a r g e t,2 0 1 5,6(1 3):1 1 6 4 0-1 1 6 5 1.2 1MUKHE R J E ES,MA D D A L E NA M,L Y Q,e ta l.C r o s s-t a l kb e t w e e nm u t a n tp 5 3a n dp 6 2/S Q S TM 1a u g m e n t sc a n c e rc e l lm i g r a t i o nb yp r o m o t i n gt h ed e g r a d a t i o no fc e l la d h e s i o np r o t e i n sJ.P r o c e e d i n g so f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i c a,2 0 2 2,1 1 9(1 7):e 2 1 1 9 6 4 4 1 1 9.2 2MC C UT C HE ONS,S P R AYDC.G l i o b l a s t o m a-a s t r o c y t e c o n-n e x i n4 3g a p j u n c t i o n sp r o m o t et u m o r i n v a s i o nJ.M o l e c u l a rC a n c e rR e s e a r c h:MC R,2 0 2 2,2 0(2):3 1 9-3 3 1.2 3S C HU L ZJA,R O D G E R SLT,K R Y S C I ORJ,e t a l.C h a r a c-t e r i z a t i o na n dc o m p a r i s o no fh u m a ng l i o b l a s t o m am o d e l sJ.BMCC a n c e r,2 0 2 2,2 2(1):8 4 4.(本文编辑 马伟平)