HPLC法同时测定泽菊降脂片中绿原酸和橙黄决明素的含量.pdf

基金项目:军队医疗机构制剂标准提高科研专项课题,N o.1 4 Z J Z 0 2作者简介:刘 栋,硕士,副主任药师。研究方向:新制剂研发与制剂质量控制。E-m a i l:l i u d o n g 1 3 6 7 3 5 4 6 6 5 01 6 3.c o m作者单 位:4 5 0 0 4 2 河 南 郑 州,联 勤 保 障 部 队 第 九 八 八 医 院;2 6 6 0 7 1 山东青岛,海军第九七一医院通信作者:王晓燕,副主任药师。E-m a i l:4 0 5 7 6 7 0 0q q.c o mH P L C法同时测定泽菊降脂片中绿原酸和橙黄决明素的含量刘 栋,张中华,张 娜,王丽军,李明春,王晓燕 摘 要 目的 建立同时测定泽菊降脂片中绿原酸和橙黄决明素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱:W o n d a s i lTM C1 8(4.6 mm2 5 0 mm,5 m);流动相:0.4%磷酸水溶液-乙腈(梯度洗脱);体积流量:1.0 m lm i n-1;检测波长:01 5.0 m i n,3 2 7 n m(绿原酸);1 5.04 0.0 m i n,2 8 6 n m(橙黄决明素);柱温:3 0,进样量:1 0 l。结果 绿原酸和橙黄决明素检测质量浓度线性范围分别为7.6 17 6.0 8 gm l-1(r=0.9 9 9 9)、3.1 23 1.1 6 gm l-1(r=0.9 9 9 9);加样回收率分别为9 8.3 7%1 0 1.3 7%(R S D=1.0 2%,n=9)、9 7.8 2%1 0 1.2 0%(R S D=1.1 0%,n=9)。结论 该方法简单准确、重复性好,适用于同时测定泽菊降脂片中绿原酸和橙黄决明素的含量。关键词 泽菊降脂片;高效液相色谱法;绿原酸;橙黄决明素;含量测定 中图分类号 R 9 1 7 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 8-9 9 2 6(2 0 2 3)4-0 2 9 5-0 3 D O I 1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 8-9 9 2 6.2 0 2 3.0 4.0 0 3S i m u l t a n e o u s D e t e r m i n a t i o n o f C h l o r o g e n i c A c i d a n d A u r a n t i o-o b t u s i n i nZ e j u J i a n g z h i T a b l e t s b y H P L CL I U D o n g,Z HANG Z h o n g-h u a,Z HANG N a,WANG L i-j u n,L I M i n g-c h u n,WANG X i a o-y a nT h e 9 8 8 t h H o s p i t a l o f t h e J o i n t L o g i s t i c s S u p p o r t F o r c e o f P L A,Z h e n g z h o u 4 5 0 0 4 2,C h i n a;H o s p i t a l 9 7 1 o f P L A N a v y,Q i n g d a o 2 6 6 0 7 1,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a n H P L C m e t h o d f o r s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f c o n t e n t s o f c h l o r o-g e n i c a c i d a n d a u r a n t i o-o b t u s i n i n Z e j u J i a n g z h i t a b l e t s.M e t h o d s T h e H P L C m e t h o d w a s a d o p t e d o n a W o n d a s i lTM C1 8 c o l u m n(4.6 mm 2 5 0 mm,5 m)w i t h a m o b i l e p h a s e c o m p o s e d o f a c e t o n i t r i l e-0.4%p h o s p h o r i c a c i d i n a g r a d i e n t e l u t i o n m a n n e r a t t h e f l o w r a t e o f 1.0 m lm i n-1.T h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s s e t a t 3 2 7 n m f o r c h l o r o g e n i c a c i d i n 0-1 5.0 m i n,a n d a t 2 8 6 n m f o r a u r a n t i o-o b t u s i n i n 1 5.0-4 0.0 m i n.T h e c o l u m n t e m p e r a-t u r e w a s 3 0 a n d i n j e c t i o n v o l u m e w a s 1 0 l.R e s u l t s T h e l i n e a r r a n g e s o f c h l o r o g e n i c a c i d a n d a u r a n t i o-o b t u s i n w e r e 7.6 1-7 6.0 8 gm l-1(r=0.9 9 9 9)a n d 3.1 2-3 1.1 6 gm l-1(r=0.9 9 9 9),r e s p e c t i v e l y.T h e r e c o v e r-i e s w e r e 9 8.3 7%-1 0 1.3 7%(R S D=1.0 2%,n=9)a n d 9 7.8 2%-1 0 1.2 0%(R S D=1.1 0%,n=9),r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n T h i s m e t h o d i s s i m p l e,a c c u r a t e a n d r e p r o d u c i b l e,a n d c a n b e u s e d f o r c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n o f c h l o r o-g e n i c a c i d a n d a u r a n t i o-o b t u s i n i n Z e j u J i a n g z h i t a b l e t s.K e y w o r d s Z e j u J i a n g z h i t a b l e t s;H P L C;c h l o r o g e n i c a c i d;a u r a n t i o-o b t u s i n;c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n 泽菊降脂片(曾用名降脂片)为某医院制剂,具有活血化瘀、通脉养心之功效,广泛用于治疗高脂血症、动脉粥样硬化等疾病1。方中决明子清热明目、润肠通便,其主要有效成分橙黄决明素具有明确的调脂作用2;山楂消食健胃、行气散瘀、化浊降脂,菊花散风清热、平肝明目、清热解毒,二者共有成分绿原酸作用广泛,特别是调节糖脂代谢作用更具重要意义3。考虑到中药复方制剂具有多成分多靶点多功效的作用特点4,在本课题组前期研究的基础上5,本研究采用H P L C法同时测定该制剂中绿原酸和橙黄决明素的含量。1 仪器与试药1.1 仪器 岛津L C-1 0 A高效液相色谱仪(日本岛津公司);B T 1 2 5 D型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);A S 3 1 2 0 A型超声592 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。1.2 试药 对照品:绿原酸(含量9 6.1%,批号1 1 0 7 5 3-2 0 2 0 1 8)、橙 黄 决 明 素(含 量9 8.3%,批 号1 1 1 9 0 0-2 0 1 6 0 5)均购自中国食品药品检定研究院。样品:泽菊降脂片(批号:1 9 0 9 1 6、1 9 1 0 1 0、2 0 0 3 2 6)及阴性样品由某医院制剂室提供。试剂:色谱乙腈购自天津市四友精细化学品有限公司;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱:W o n d a s i lTM C1 8(4.6 mm2 5 0 mm,5 m);流动相:0.4%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯 度 洗 脱(01 5 m i n,1 2%2 5%B;1 52 7 m i n,2 5%4 0%B;2 74 0 m i n,4 0%5 0%B);体积流量:1.0 m lm i n-1;检测波长:01 5.0 m i n,3 2 7 n m(绿 原 酸);1 5.04 0.0 m i n,2 8 6 n m(橙黄决明素);柱温:3 0;进样量:1 0 l。2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸、橙黄决明素对照品各适量,加8 0%甲醇制成绿原酸、橙黄决明素质量浓度分别为7 6.0 8、3 1.1 6 gm l-1的对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 m l,置5 m l棕色量瓶中,用8 0%甲醇溶液定容,摇匀,即得(绿原酸和橙黄决明素浓度分别为3 0.4 3、1 2.4 6 gm l-1)。2.2.2 供试品溶液 精密称取样品细粉0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入8 0%甲醇溶液2 5 m l,称量,超声(功率1 2 0 W,频率4 0 k H z)处理4 0 m i n,放冷,再次称量,用8 0%甲醇溶液补足减失质量,摇匀,静置,取上清液,经0.4 5 m微孔滤膜过滤,即得。2.2.3 阴性对照溶液 按泽菊降脂片的处方分别制备不含山楂和菊花的阴性样品1、不含决明子的阴性样品2,再按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。2.3 系统适用性与专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1 0 l,在上述色谱条件下进样测定,所得色谱图见图1。结果显示,绿原酸、橙黄决明素均与相邻成分分离度良好(1.5);两种指标成分的理论板数均大于1 0 0 0 0;阴性对照图谱显示无其他成分干扰测定,专属性良好。2.4 线性关系考察 取对照品储备液适量,用8 0%甲醇溶液稀释成系列浓度的对照品溶液,分别在上述色谱条件下进样测定。以对照品溶液的质量浓度(C,gm l-1)为横坐标,相应的峰面积(A)为纵坐标,进行线性回归,得到绿原酸、橙黄决明素的回归方程、相关系数(r)和线性范围分别为:A=3 3 4 7 0.8 9 C+1 1 9 9 8.0 7,A:对照品溶液;B:供试品溶液;C:阴性对照溶液1;D:阴性对照溶液2;1:绿原酸;2:橙黄决明素。图1 泽菊降脂片系统适用性H P L C图r=0.9 9 9 9,7.6 1 7 6.0 8 gm l-1;A=8 4 7 9 1.0 8 C+1 1 6 6 5.0 1,r=0.9 9 9 9,3.1 2 3 1.1 6 gm l-1。2.5 精密度试验 在上述色谱条件下,将混合对照品溶液重复进样6次,计算绿原酸、橙黄决明素峰面积的R S D值分别为0.8 6%、0.7 3%。结果表明仪器精密度良好。2.6 重 复 性 试 验 取 泽 菊 降 脂 片 样 品(批 号:2 0 0 3 2 6)细粉,按上述方法平行制备6份供试品溶液,然后进样测定峰面积并计算含量。结果样品中绿原酸、橙黄决明素含量的平均值分别为1.4 7 2 6、0.5 9 9 4 m gg-1,计 算R S D值 分 别 为0.9 3%、1.1 5%,表明重复性良好。2.7 稳 定 性 试 验 取 制 备 好 的 供 试 品(批 号:2 0 0 3 2 6)溶液,在上述色谱条件下,分别于0、2、4、8、1 2、2 4 h时进样,计算绿原酸、橙黄决明素峰面积的R S D值分别为1.2 8%、0.9 5%。结果表明,供试品溶液在配制后2 4 h内比较稳定。692 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 2.8 加样回收率试验 精密称取已测定含量的样品(批号:2 0 0 3 2 6)细粉0.2 5 g,共取9份,分3组,分别精密加入混合对照品储备液(绿原酸和橙黄决明素浓度分别为7 6.0 8、3 1.1 6 gm l-1)2.5、5.0、7.5 m l,然后按上述方法制成供试品溶液,再测定含量并计算回收率,见表1。表1 绿原酸和橙黄决明素含量测定加样回收率试验结果成分取样量/g样品含量/m g加入量/m g测得量/m g回收率/%平均回收率/%R S D/%绿原酸0.2 5 2 6 0.3 7 2 0 0.1 9 0 2 0.5 5 9 5 9 8.5 89 9.6 41.0 20.2 4 8 1 0.3 6 5 4 0.1 9 0 2 0.5 5 2 5 9 8.3 70.2 5 6 7 0.3 7 8 0 0.1 9 0 2 0.5 6 7 1 9 9.4 20.2 4 6 8 0.3 6 3 4 0.3 8 0 4 0.7 3 8 9 9 8.7 10.2 5 0 9 0.3 6 9 5 0.3 8 0 4 0.7 5 5 11 0 1.3 70.2 5 3 7 0.3 7 3 6 0.3 8 0 4 0.7 5 2 9 9 9.7 10.2 4 6 6 0.3 6 3 1 0.5 7 0 6 0.9 3 7 11 0 0.6 00.2 5 2 9 0.3 7 2 4 0.5 7 0 6 0.9 4 5 51 0 0.4 40.2 4 7 9 0.3 6 5 1 0.5 7 0 6 0.9 3 3 0 9 9.5 3橙黄决明素0.2 5 2 6 0.1 5 1 4 0.0 7 7 9 0.2 2 8 0 9 8.3 39 9.1 81.1 00.2 4 8 1 0.1 4 8 7 0.0 7 7 9 0.2 2 5 1 9 8.0 70.2 5 6 7 0.1 5 3 9 0.0 7 7 9 0.2 3 0 1 9 7.8 20.2 4 6 8 0.1 4 7 9 0.1 5 5 8 0.3 0 1 6 9 8.6 50.2 5 0 9 0.1 5 0 4 0.1 5 5 8 0.3 0 5 5 9 9.5 50.2 5 3 7 0.1 5 2 1 0.1 5 5 8 0.3 0 7 2 9 9.5 50.2 4 6 6 0.1 4 7 8 0.2 3 3 7 0.3 7 9 5 9 9.1 40.2 5 2 9 0.1 5 1 6 0.2 3 3 7 0.3 8 8 11 0 1.2 00.2 4 7 9 0.1 4 8 6 0.2 3 3 7 0.3 8 2 91 0 0.2 62.9 样品含量测定 取泽菊降脂片样品(批号:1 9 0 9 1 6、1 9 1 0 1 0、2 0 0 3 2 6)细粉,按上述方法制备供试品溶液,并按外标法测定样品中绿原酸和橙黄决明素的含量,结果见表2。根据制剂质量标准提高要求,按3批制剂测定结果均值的8 0%作为含量限值,暂 定 本 品 每 片 含 山 楂 和 菊 花 以 绿 原 酸(C1 6H1 8O9)计,不得少于0.3 1 m g;本品每片含决明子以橙黄决明素(C1 7H1 4O7)计,不得少于0.1 2 m g。表2 绿原酸和橙黄决明素含量测定结果(n=3)批号绿原酸平均含量/m gR S D/%橙黄决明素平均含量/m gR S D/%1 9 0 9 1 60.3 9 2 21.2 20.1 4 7 91.3 51 9 1 0 1 00.3 8 5 51.4 60.1 5 0 61.2 92 0 0 3 2 60.3 8 2 91.3 30.1 5 5 91.0 73 讨论3.1 检测成分的选择 本课题组前期试验5研究了决明子中2种有效成分含量测定方法,但近几年多个批次的测定结果显示制剂中大黄酚的含量比较低,推测原因,一是该制剂采用水提取决明子等药材,大黄酚转移率低;二是检测指标是制剂中的游离大黄酚(结合型大黄酚未水解);三是不同产地、不同炒制工艺6也造成含量差异较大,故将大黄酚作为控制指标还有待进一步研究。橙黄决明素和绿原酸不但在调节血脂方面功效明确7,并且多个批次显示含量稳定,故本研究选择一种检测方法同时测定橙黄决明素(炒决明子)和绿原酸(菊花、山楂)的含量。3.2 色谱条件的优化 采用乙腈-0.1%磷酸溶液8作为流动相进行梯度洗脱检测,结果绿原酸与邻近色谱峰分离度差,橙黄决明素峰拖尾,后将磷酸溶液的浓度调至0.4%,指标色谱峰峰型对称、基线分离。由于2种指标成分极性差别较大,梯度洗脱是必要的。为了缩短检测时间,曾尝试进一步增大洗脱的梯度,但基线出现较大波动,故本研究采用2.1项下的梯度洗脱程序。由全波长扫描图谱可知绿原酸、橙黄决明素分别在3 2 7、2 8 6 n m波长处有最大吸收,采用波长转换法,既能保证各待测成分在相应的保留时间处有最大吸收,又能提高检测的灵敏度,减少干扰9。3.3 供试品溶液制备方法的选择 试验中考察了提取溶剂(甲醇、8 0%甲醇、5 0%甲醇)、提取方式(回流、超声)、提取时间(2 0、4 0、6 0 m i n)对2种成分提取效率的影响,在确保提取率的基础上,综合考虑成本、操作难易等因素,最终确定为2.2.2项下供试品溶液制备方法。参考文献1 王丽军,刘 栋,申 雷.降脂片治疗高脂血症疗效观察J.药学实践杂志,2 0 1 3,3 1(1):5 1-5 2,6 3.2 余 胜,邓 楠,刘 文,等.基于代谢组学研究橙黄决明素对高脂血症大鼠的调脂作用J.分析科学学报,2 0 1 6,3 2(2):1 7 8-1 8 2.3 庞美蓉,刘零怡,高汪磊,等.绿原酸调节糖脂代谢的作用机制研究进展J.中草药,2 0 1 5,4 6(2):3 0 5-3 1 2.4 陈 丹,李 柯,卢茂芳,等.H P L C法同时测定活血促愈胶囊中5个主要活性成分的含量J.药物分析杂志,2 0 1 7,3 7(1 2):2 1 8 5-2 1 9 0.5 刘 栋,宋晓红,王丽军,等.泽菊降脂片中橙黄决明素和大黄酚的定性鉴别和含量测定J.中国药师,2 0 1 7,2 0(1):1 6 3-1 6 5.6 张 杰,张振秋,米宝丽,等.山菊降压片中生决明子代替炒决明子有效成分变化J.中成药,2 0 1 4,3 6(2):3 4 8-3 5 2.7 朱日然,韩相宁,张亚楠,等.菊花-决明子不同比例配伍有效成分含量变化研究J.辽宁中医药大学学报,2 0 1 8,2 0(6):4 9-5 2.8 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京:中国医药科技出版社,2 0 2 0:1 5 1,3 2 3.9 王玉林,崔俊凤,王建强.H P L C法同时测定一清颗粒中5种成分含量J.解放军药学学报,2 0 1 7,3 3(4):3 3 0-3 3 2.(收稿日期:2 0 2 3-0 5-0 8;修回日期:2 0 2 3-0 6-3 0)(本文编辑 吴 艳)792 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3