补肾调经汤对PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响.pdf

实用中医药杂志 2023年6月 第39卷6期（总第365期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.61051 论著 基金项目江西省中医药管理局立项课题（2019B045）多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄期女性常见的妇科内分泌紊乱疾病。流行病学调查显示，我国PCOS的患病率约为5.6%1。PCOS发病机制复杂，是一种涉及内分泌、代谢和遗传等多种因素的内分泌与代谢紊乱的疾病。临床表现以排卵障碍、高雄激素表现或高雄激素血症（Hyperandrogenism，HA）、卵巢多囊泡改变为主要特征，且具有多种疾病的发病风险，包括肥胖、胰岛素抵抗、心血管疾病、子宫内膜癌、甲状腺疾病以及心理疾患等1。PCOS近期治疗目标是调整月经周期、改善高雄激素体征、控制体质量及促进生育，远期目标是保护子宫内膜、降低心血管疾病和2型糖尿病风险。西医主要采用对症治疗，如降低雄激素、改善胰岛素抵抗、促进生育、改变生活方式、手术治疗以及辅助生殖技术。补肾调经汤以景岳全书中归肾丸为基础方加减而成。有研究发现，补肾调经汤使PCOS模型大鼠血清AMH含量及卵巢组织中AMHR的表达降低，并有效改善卵巢组织原始卵泡的发育及排卵状况。为深入研究补肾调经汤对PCOS的作用机制，笔者用补肾调经汤对PCOS模型大鼠进行干预，观察中药干预前后PCOS模型大鼠卵巢中t-PA、PA-1水平的表达，探索补肾调经汤对PCOS模型大鼠的作用及可能的机制，现报道如下。1材料与仪器 1.1主要药物选用70日龄左右（平均体质量270.562.13g）的SPF级SD雌性大鼠40只，购于南昌大学医学部实验动物中心，动物许可证号SYXK（赣）2010-0002。1.2主要药物炔雌醇环丙孕酮片（达英-35，拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20100003）。补肾调经汤药用炒菟丝子10g，当归10g，党参15g，黄芪15g，山茱萸10g，生地10g，怀牛膝10g，土鳖虫10g，补肾调经汤对PCOS模型 大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响王巧，祝佩，陈晓勇（江西省妇幼保健院/江西省中西医结合女性生殖重点研究室/江西省中西医结合妇科病诊疗中心中医科，江西 南昌 330006）中图分类号R271.9 文献标识码B 文章编号1004-2814（2023）06-1051-03摘要目的：观察补肾调经汤对PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响。方法：用来曲唑造模法建立雌性大鼠PCOS模型，设置正常对照组、模型组、西药组、中药组。通过阴道涂片观察大鼠动情周期，ELISA法检测大鼠血清T水平，电镜观察卵巢形态，Western blot检测测定大鼠卵巢t-PA、PAI-1蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠血清T水平升高，窦卵泡数增多，颗粒细胞层数减少，卵巢组织t-PA表达降低、PAI-1表达升高（P0.01）；与模型组比较，中药组和西药组血清T水平下降，窦卵泡数减少，颗粒细胞层数增多，卵巢组织 t-PA 表达升高、PAI-1 表达降低（P0.01）。结论：PCOS的发病可能与卵巢t-PA、PAI-1的异常表达有关，补肾调经汤可能能够通过调节t-PA、PAI-1的表达恢复卵巢正常生殖功能，维持生殖内分泌稳态，达到治疗PCOS的作用。关键词多囊卵巢综合征；补肾调经汤；t-PA、PAI-1；影响AbstractObjective：ToobservetheeffectofBushenTiaojingDecoctionontheexpressionoft-PAandPAI-1inovaryofPCOSmodelrats.Methods:ThePCOSmodeloffemaleratswasestablishedbyusingthemethodoftrazolmodeling,andthenormalcontrolgroup,modelgroup,westernmedicinegroupandChinesemedicinegroupweresetup.Theestrouscycleofratswasobservedbyvaginalsmear.TheserumTlevelwasdetectedbyELISA.Theovarianmorphologywasobservedbyelectronmicroscope,andtheexpressionoft-PAandPAI-1proteininratovarywasdetectedbyWesternblot.Results:Comparedwiththenormalcontrolgroup,theserumTlevelofratsinthemodelgroupincreased,thenumberofsinusfolliclesincreased,thenumberofgranulosacellsdecreased,andthet-PAexpressioninovariantissuedecreasedwhilethePAI-1expressionincreased(P0.01).Comparedwiththemodelgroup,theserumTleveldecreased,thenumberofsinusfolliclesdecreased,thenumberofgranulosacellsincreased,andthet-PAexpressioninovariantissueincreasedwhilethePAI-1expressiondecreasedintheChinesemedicinegroupandtheWesternmedicinegroup(P0.01).Conclusion:ThepathogenesisofPCOSmayberelatedtotheabnormalexpressionoft-PAandPAI-1inovary.BushenTiaojingDecoctionmayrestorethenormalreproductivefunctionofovarybyregulatingtheexpressionoft-PAandPAI-1,maintainthereproductiveendocrinehomeostasis,andachievetheeffectoftreatingPCOS.KeywordsPolycysticovarysyndrome；BushenTiaojingDecoction；t-PA,PAI-1；Effect实用中医药杂志 2023年6月 第39卷6期（总第365期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.61052皂刺片10g，山慈姑10g，仙茅3g。中药材购于江西省妇幼保健院，将所得药液用水浴锅浓缩至生药含量为1.13g/mL的中药药液，装于无菌小瓶内，冰箱4保存。1.3试剂与仪器RatTELISA试剂盒，Cusabio公司；Anti-PLATAntibody，产品批号A02965-1，武汉博士德生物工程有限公司；Anti-SERPINE1Antibody，产品批号：A00637-2，武汉博士德生物工程有限公司；普通光学倒置显微镜（TS100-F型），日本Nikon公司。2方法2.1PCOS大鼠模型制备采用来曲唑造模法建立雌性大鼠PCOS模型。2.2动物分组与给药方法随机将大鼠分为正常对照组、模型组、西药组和中药组各10只。各组大鼠都以相同标准的饲料饲养，除空白组外其余组大鼠均按上述方法造模。按照大鼠与人之间的用药剂量公式进行换算，得出中药组每只大鼠给药剂0.012g/（gd）；西药组每只大鼠给药剂量0.0002mg/（gd）。2.3观察指标与检测方法造模21d，剖开大鼠胸腔穿刺心脏采血，ELISA法检测大鼠血清T水平，完整留取卵巢组织，福尔马林固定、常规石蜡包埋切片、苏木精染色、酒精梯度脱水、中封片胶封片，电镜观察卵巢内卵泡形态，Westernblot测定t-PA、PAI-1表达。2.4统计学方法用SPSS17.0统计软件进行统计，计量资料以（xs）表示；多组间均数的比较，方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用KruskalWallisH法。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1大鼠一般情况造模后的大鼠均出现体态肥胖，行动较为迟缓，倦怠嗜睡，活动少，毛色灰暗无光泽，且偶有脱毛等。而正常大鼠精神、摄食、活动等一般情况均较好，对外界刺激反应敏捷。空白组大鼠阴道涂片结果显示有规则的动情周期变化，周期为45d。模型组大鼠阴道涂片结果显示动情周期不规律，以动情周期为主，阴道涂片显示分泌物减少，偶尔可见少量无核角化细胞和有核上皮细胞，较多的白细胞持续存在。西药组和中药组给药处理后，紊乱的动情周期有所改善，表现为动情周期、动情间期逐步恢复，趋于正常。3.2大鼠血清激素水平比较模型组大鼠血清T水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.05）；与模型组比较，治疗大鼠血清T水平均有下降趋势，但差异无统计学意义（P0.05）；中药组大鼠血清T水平低于西药组，差异无统计学意义（P0.05）。见表1。表1各组大鼠血清T水平比较（xs）组别鼠数T（ng/L）正常对照组 模型组西药组中药组101010102.5730.3133.0170.2362.8700.1122.8940.1743.3各组大鼠卵巢组织卵泡形态的比较窦卵泡数不同组别组间比较，正常对照组与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）；模型组与治疗组比较差异有统计学意义（P0.05）；中药组、西药组组间比较差异无统计学意义（P0.05）。颗粒细胞层数不同组别组间比较，正常对照组与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）；模型组与治疗组比较差异有统计学意义（P0.05）；中药组、西药组组间比较差异无统计学意义（P0.05）。见表2。表2各组大鼠卵巢组织窦卵泡数及颗粒细胞层数的比较（xs）组别鼠数窦卵泡数（个）颗粒细胞层数（层）正常对照组模型组西药组中药组101010108.602.5715.373.239.893.789.883.638.300.671.750.717.890.788.130.833.4各组大鼠卵巢组织t-PA、PAI-1表达比较与正常对照组比较，模型组大鼠卵巢组织t-PA表达降低，差异有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠卵巢组织t-PA表达增高，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与正常组比较，治疗组大鼠卵巢组织t-PA表达稍低，差异无统计学意义（P0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠卵巢组织PAI-1表达升高，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠卵巢组织PAI-1表达降低，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与正常组比较，治疗组大鼠卵巢组织PAI-1表达增加，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表3。T-PA62kdgapdh36kd正常对照组模型组中药组西药组PAI-144kdgapdh36kD正常对照组模型组中药组西药组表3各组PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达比较（xs）组别鼠数t-PAPAI-1正常对照组模型组西药组中药组1010101013449.803257.625321.601111.4010349.602496.3210395.602858.258429.00707.5425209.60779.6216473.581029.0416196.001081.254讨论多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄妇女常见的代谢及内分泌紊乱性疾病，以雄激素过多、持续无排卵和卵巢多囊表现为临床主要特征。近期研究表明PCOS存在轻中度纤溶状态，其肥胖、IR、早期自然流产及患心血管疾病（CVD）及静脉血栓栓塞（VTE）的危险因素增加，与纤溶系统之间存在一定的关系3-4。实用中医药杂志 2023年6月 第39卷6期（总第365期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.61053组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是机体纤溶系统的主要成分。前者主要由血管内皮细胞合成及分泌，与纤维蛋白有高度亲和力，可启动纤溶系统，使纤溶酶原转化成有活性的纤溶酶，使已经形成的血栓溶解；PAI-1是纤溶系统的主要生理抑制剂，是丝氨酸蛋白酶抑制剂加重的一种单链糖蛋白，人类所有组织如血管内皮细胞、脂肪组织、血小板、单核细胞、血管平滑肌细胞及肾脏系膜细胞等均可表达。是PCOS研究的广泛的血液因素和纤溶系统中重要的抑制剂，PAI-1活性增高，血液处于低纤溶状态，容易形成血栓5。研究表明，PAI-1基因启动子区4G/5G基因多态性可通过升高血浆PAI-1水平及活性影响胰岛素的敏感性，参与胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）的形成。PAI-1基因启动子区4G/5G基因多态性与PCOS的发生、发展可能有着密切的关系5。动物模型研究表明，卵泡破裂是通过纤溶酶原激活物（PA）表达增加、纤溶酶原抑制物（PAI-1）表达降低实现的6。在卵泡破裂时纤溶酶原转变为具有活性的纤溶酶，而升高的PAI-1通过抑制纤溶酶原转化为纤溶酶而抑制排卵。在排卵前，PAI-1水平在未成熟卵泡所在的卵巢位置达高表达，而t-PA在排卵前卵泡的位置表达最高7。有综述认为，t-PA和PAI-1在排卵过程中起着最重要的作用，在卵母细胞成熟过程中也有作用8。研究显示，对稳定分泌活性人PAI-1的转基因雌性小鼠进行研究，小鼠卵巢内含有许多大的囊性结构，血浆睾酮水平几乎是对照小鼠的2倍9，研究认为PAI-1的过度表达促进了卵巢多囊样改变的发展，但他们没有评估这些小鼠的代谢指标及纤溶系统其它因子。有动物研究发现，小鼠缺乏PAI-1，可防止肥胖发生，提示PAI-1可能与肥胖存在直接的因果关系10。Ambekar等11对多囊卵巢综合征（PCOS）妇女的卵泡液进行了蛋白质组学分析，并与健康的年龄相当的非PCOS妇女进行了比较。其发现与非PCOS妇女比较，PCOS妇女的卵巢卵泡液中纤溶酶原被降解。多囊卵巢综合征属中医“月经后期”“闭经”“月经过少”“崩漏”“不孕”“癥瘕”等范畴。傅青主女科云：“经水出诸肾。”肾藏精，精化血，精血同源，肾精充足，血海满盈，月经才能如时而下。中医对于PCOS的治疗，以补肾为根本大法，以活血化瘀、健脾化痰、活血调经等辅助治疗。补肾调经汤以景岳全书中“归肾丸”为基础方加减而成，由炒菟丝子、当归、党参、黄芪、山茱萸、生地、怀牛膝、土鳖虫、皂刺片、山慈姑、仙茅组成。笔者课题组前期的研究发现补肾调经汤使PCOS模型大鼠血清AMH含量及卵巢组织中AMHR的表达降低，并有效改善卵巢组织原始卵泡的发育及排卵状况12。研究观察到，给予补肾调经汤及炔雌醇环丙孕酮片灌胃治疗后，与模型组比较，补肾调经汤组及炔雌醇环丙孕酮片组，T水平降低，窦卵泡数减少，颗粒细胞层数增多，卵巢组织t-PA表达升高、PAI-1表达降低。提示，补肾调经汤可能能够通过调节t-PA、PAI-1的表达恢复卵巢正常生殖功能，维持生殖内分泌稳态，达到治疗PCOS的作用。参考文献1 PALOmBA S（1），SAnTAgnI S（1），et al.Complications and challenges associated with polycystic ovary syndrome：current perspectives.Int J Womens Health.2015 Jul 31；7：745-63.2 刘馨竹.补肾调经汤对PCOS模型大鼠血清AmH水平及卵巢AmHR表达的影响D.南昌大学，2017.3 BuRCHALL gF，PIvA TJ，LInDEn mD，gIBSOn-HELm mE，RAnASInHA S，TEEDE HJ.Comprehensive assessment of the hemostatic system in polycystic ovarian syndrome.Semin Thromb Hemost.2016；42（1）：5562.4 刘元伟，邓妙，岑加萍，等.PAI-1基因启动子区4g/5g基因多态性与多囊卵巢综合征J.国际妇产科学杂志，2015，42（03）：298-305.5 EL-mAZnY A，ABOu-SALEm n，EL-SHERBInY W，et ai.Insulin，dyslipidemia，and metabolic syndrome in women with polycystic ovary syndromeJ.Int J gynaecol Obstet，2010，109：239-241.6 POLITIS I，SRIkAnDAkumAR A，TuRnER JD，TSAng Bk，AInSWORTH L，DOWnEY BR.Changes in and partial identification of the plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor systems during ovarian follicular maturation in the pig.Biol Reprod.1990；43（4）：63642.7 DEvIn Jk，JOHnSOn JE，EREn m，gLEAvES LA，BRADHAm WS，BLOODWORTH JR JR，et al.Transgenic 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