miR-27a通过Wnt_β-catenin通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果及机制研究.pdf

Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期 论著 miR-miR-2727a a通过通过Wnt/Wnt/-catenin-catenin通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的通路对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果及机制研究修复效果及机制研究*王茜余炜伟李光辉【摘要】目的：探讨miR-27a对骨质疏松小鼠颅骨缺损的修复效果以及对Wnt/-catenin通路的调节作用。方法：40只小鼠建立骨质疏松颅骨缺损模型，随机分为模型组、miR-27a NC组、miR-27a mimic组和miR-27ainhibitor组，另外10只骨质疏松小鼠作为对照组。对照组和模型组小鼠尾静脉注射10 L生理盐水，其余组小鼠分别尾静脉注射10 L miR-27a 阴性对照质粒、miR-27a 过表达慢病毒质粒和miR-27a 沉默慢病毒质粒，1次/周，连续4周。micro-CT检测颅骨愈合情况，ELISA检测血清中碱性磷酸酶（ALP）、钙和磷水平，qRT-PCR法和蛋白印迹法检测骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）基因和蛋白表达量，蛋白印迹法检测细胞核和细胞质中-catenin蛋白表达情况。结果：与对照组比较，模型组小鼠ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN mRNA和蛋白水平均降低（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度，ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN基因和蛋白水平均升高，miR-27a inhibitor组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度，ALP活性、钙和磷水平，OCN和OPN 基因和蛋白水平均降低（P0.05）；与对照组比较，模型组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组细胞质中-catenin蛋白表达低于细胞核，而miR-27a inhibitor 组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核（P0.05）。结论：miR-27a可诱导骨质疏松小鼠颅骨缺损内新骨形成，其可能是通过激活Wnt/-catenin信号通路发挥作用。关键词：骨质疏松；颅骨缺损；miR-27a；Wnt/-catenin信号通路中国图书分类号 R780.2 文献标识码 ADOI:10.19748/.kqxf.1009-3761.2023.4.003Repair effect and mechanism of miR-27a on calvarial defects in osteoporotic mice via Wnt/-catenin pathwayWANG Qian,YU Wei-wei,LI Guang-hui*.(Stomatological Center,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)【Abstract】Objective:To investigate the repair effect of miR-27a on calvarial defects in osteoporotic mice and theregulating effect of miR-27a on Wnt/-catenin pathway.Methods:The osteoporotic skull defect model was establishedin 40 mice,then were randomly divided into the control group,the model group,the miR-27a NC group,the miR-27a mimicgroup and the miR-27a inhibitor group,another 10 osteoporosis mice served as a control group.Mice in the control groupand the model group were injected with 10 L normal saline through tail vein.Mice in the other groups were injected with10 L miR-27a negative control plasmid,miR-27a over expressing lentivirus plasmid and miR-27a silencing lentivirusplasmid by tail vein,once a week for 4 weeks.The skull healing was detected by micro-CT,the serum alkaline phosphatase(ALP),calcium and phosphorus levels were detected by ELISA,the gene and protein expressions of osteocalcin(OCN)and osteopontin(OPN)were detected by qRT-PCR and western blotting.The expression of-catenin in the nucleus andcytoplasm was detected by western blotting.Results:Compared with the control group,ALP activity,calcium andphosphorus levels,OCN and OPN mRNA and protein levels were decreased in the model group(P0.05).Compared withthe miR-27a NC group,BV/TV,bone trabecular number,bone trabecular thickness,ALP activity,calcium and phosphoruslevels,OCN and OPN mRNA and protein levels were increased in the miR-27a mimic group.BV/TV,bone trabecularnumber and bone trabecular thickness,ALP activity,calcium and phosphorus levels,OCN and OPN mRNA and proteinlevels were decreased in the miR-27a inhibitor group(P0.05).Compared with the control group,-catenin proteinexpression in the cytoplasm of the model group was higher than that in the nucleus(P0.05).Compared with the miR-27aNC group,the expression of-catenin in the cytoplasm of the miR-27a mimic group was lower than that of the nucleus,while that of the miR-27a inhibitor group was higher than that of the nucleus(P0.05).Conclusion:miR-27a can induce 基金项目基金项目：河南省医学科技攻关计划（联合共建）项目（项目编号：LHGJ20190272）王茜郑州大学第一附属医院口腔医学中心副主任医师郑州450000余炜伟郑州大学第一附属医院口腔医学中心主任医师郑州450000李光辉通讯作者郑州大学第一附属医院口腔医学中心副主任医师郑州450000253口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4new bone formation in osteoporotic mice skull defects,possibly through activation of Wnt/-catenin signaling pathway.Key words:osteoporosis;calvarial defect;miR-27a;Wnt/-catenin signaling pathway骨质疏松症好发于中老年人群，是一种全身代谢性骨病1。骨质疏松症患者由于骨代谢异常，常发生骨折延迟愈合、骨不连和骨缺损等临床症状，目前仍是临床工作者面临的医学难题。研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）-27a-3p可改善骨质疏松临床症状，诱导成骨细胞分化2。此外，骨髓间充质干细胞来源的富含miR-27a-3p的外泌体可促进骨质疏松大鼠成骨能力3。Wnt/-catenin信号通路与成骨分化、骨形成以及骨质疏松等骨性疾病密切相关，研究表明，Wnt/-catenin信号通路激活在促进骨再生过程中发挥重要作用4。适当的机械负荷通过激活Wnt/-catenin信号通路可逆转核苷酸类似物逆转录酶抑制剂TDF对骨质丢失、骨损伤修复的负面影响5。基于以上研究，本研究主要探讨miR-27a在骨质疏松小鼠颅骨缺损修复中的效果及其具体机制。1.材料和方法1.1 实验动物 SPF级雌性C57BL/6小鼠60只，12周龄，体质量2225 g，购自北京科兴中维生物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2020-0054。该研究经本院动物伦理委员会审核批准，伦理审批号为：ZZDXDYFSYY78542。1.2 试剂和仪器 GenBank用于查找序列并获得基因序列，构建miR-27a过表达、沉默以及阴性对照质粒，慢病毒滴度为1109TU/mL；胎牛血清和培养基购自美国 Gibco 公司；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、血钙和血磷试剂盒购自南京建成生物工程研究所；骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和-catenin 引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成；兔抗OCN、OPN和-catenin抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的IgG购自美国Sigma公司；DYCZ-MINI2型双板垂直电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；Varioskan LUX 多功能酶标仪购自美国 ThermoFisher公司；DHP-9162恒温培养箱购自武汉诺瑞德科技有限公司；Applied Biosystems PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。1.3 骨质疏松模型制备6随机取10只小鼠作为假手术组，另外50只小鼠作为去卵巢组，所有小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）麻醉。麻醉成功后取俯卧位固定于鼠板上，去卵巢组小鼠在背部脊柱两侧腹腔部位约0.5 cm处分别做一切口，剪开肌肉层和腹膜层，找到粉红色“菜花样”组织即为卵巢组织，眼科剪剪除，分层缝合切口，假手术组小鼠打开腹腔，仅切除卵巢周围与卵巢大小相同的脂肪组织。饲养8周后，假手术组和去卵巢组小鼠进行股骨影像学检查，确定模型是否制备成功。1.4 骨质疏松小鼠颅骨极限缺损模型制备和干预方式 将造模成功的 50只小鼠随机分为对照组、模型组、miR-27a 过表达组（miR-27a mimic组）、miR-27a 抑制剂组（miR-27a inhibitor 组）以及 miR-27a阴性对照组（miR-27a NC 组），每组10只。除对照组小鼠外，其余组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）麻醉，无菌条件下，沿颅骨正中做一切口，利用环钻在小鼠颅骨parietal 区 做 出 5mm 圆 形 骨 缺 损7，4-0 号Braided Absorbable Suture可吸收线缝合皮肤切口。对照组小鼠仅切开全层皮肤并缝合，不造成骨缺损。miR-27a mimic组小鼠尾静脉注射10 LmiR-27a过表达慢病毒悬液，miR-27a inhibitor组小鼠尾静脉注射10 L miR-27a沉默慢病毒悬液，miR-27a NC组小鼠尾静脉注射10 L阴性对照质粒，对照组和模型组小鼠尾静脉注射等量生理盐水，1次/周，连续4周。1.5 影像学检查 micro-CT 扫描，设置参数为：分辨率10 m；曝光时间300 ms；电压70 kV；电流200 A；计算骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目以及骨小梁厚度。1.6 ELISA检测血清中ALP活性以及钙磷水平 影像学检查完成后，打开小鼠腹腔，取腹主动脉血，室温静置30 min，3000 r/min离心10 min，收集上清液，根据ELISA试剂盒测定血清中ALP活性以及钙、磷水平。1.7 qRT-PCR 检测骨组织中 OCN 和 OPNmRNA水平 取小鼠缺损部位的新生骨组织，Trizol法提取组织中总RNA，将RNA逆转录成cDNA，进行PCR扩增，2-CT法计算OCN和OPN mRNA表254Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期达水平，引物序列见表1。表1 引物序列基因OCNOPNGAPDH引物序列F:5-GGCGCTACCTGTATCAATGG-3R:5-GTGGTCAGCCAACTCGTCA-3F:5-AGCAAGAAACTCTTCCAAGCAA-3R:5-GTGAGATTCGTCAGATTCATCCG-3F:5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3R:5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-31.8 蛋白印迹法检测 OCN 和 OPN 蛋白相对表达量 取小鼠缺损部位的新生骨组织，液氮中研磨，裂解液冰上裂解30 min，离心取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白煮沸变性。120 V电泳 2 h，0.3 A 湿转 2 h，室温封闭 1 h，GAPDH、OCN、OPN 抗体（1:1000）4孵育过夜，二抗（1:5000）室温孵育2 h，洗膜，ECL法显色，Image J分析条带灰度值。1.9 蛋白印迹法检测细胞核和细胞质中-catenin蛋白相对表达量细胞质蛋白提取：取小鼠缺损部位新生骨组织，研磨，加生理盐水洗涤一次后离心，弃上清，加入500 L细胞质蛋白提取缓冲液，使其静置30 min，加细胞裂解液，振荡10 s，4 12000 r/min离心10 min，将上清移入新的EP管中，即得到细胞质蛋白。细胞核蛋白提取：骨组织研磨离心后，加入细胞核蛋白提取缓冲液，其余操作同上。-catenin蛋白表达测定：取细胞质（核）蛋白上清液，按照1.8中的方法测定蛋白浓度。1.10 统计学分析 采用 SPSS 21.0统计学软件分析数据，定量资料均以（x s）表示，多组进行比较用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1 骨质疏松小鼠影像学检测结果 与假手术组比较，去卵巢组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度均降低（P0.05）；说明本实验中骨质疏松模型制备成功。见表2，图1。表2 骨质疏松小鼠BV/TV、骨小梁数量和骨小梁厚度（x s）组别假手术组去卵巢组n1050BV/TV0.180.030.070.01a骨小梁数量3.800.632.400.49a骨小梁厚度（mm）0.0890.0050.0540.002a注:与假手术组比，aP0.05图1 骨质疏松小鼠股骨micro-CT扫描图像2.2 颅骨缺损小鼠影像学检查 模型组和miR-27a NC 组仅有少量新生骨形成，miR-27amimic组新生骨组织明显多于miR-27a NC组，而表3 各组小鼠颅骨组织BV/TV、骨小梁数量和骨小梁厚度比较（x s）组别模型组miR-27a NC组miR-27a mimic组miR-27a inhibitor组n10101010BV/TV0.090.020.080.020.140.01ab0.050.02abc骨小梁数量1.300.021.340.032.170.04ab1.220.03abc骨小梁厚度（mm）0.0860.0210.0810.0370.1270.044ab0.0510.014abc注：与模型组比，aP0.05；与miR-27a NC组比，bP0.05；与miR-27a mimic组比，cP0.05表4 各组小鼠血清中ALP活性、钙和磷水平比较（x s）注：与对照组比，aP0.05；与模型组比，bP0.05；与miR-27a NC组比，cP0.05；与miR-27a mimic组比，dP0.05组别对照组模型组miR-27a NC组miR-27a mimic组miR-27a inhibitor组n1010101010ALP活性（U/L）37.054.288.362.09a10.472.89a29.784.06bc6.591.04bcd血钙（mmol/L）5.071.222.100.55a2.330.74a3.790.84bc1.530.41bcd血磷（mmol/L）4.950.471.480.52a1.610.54a3.750.50bc1.020.21bcd255口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4miR-27a inhibitor组新生骨组织明显少于miR-27a NC组。见图2。图2 各组小鼠颅骨缺损部位micro-CT影像学检查与 miR-27a NC 组比较，miR-27a mimic组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度均升高，miR-27a inhibitor 组小鼠 BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度均降低（P0.05）。见表3。2.3 血清学指标检测结果 与对照组比较，模型组 ALP 活性、钙和磷水平均降低（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组ALP活性、钙和磷水平均升高，miR-27a inhibitor 组ALP活性、钙和磷水平均降低（P0.05）；模型组和miR-27a NC组ALP活性、钙和磷水平比较，差异无统计学意义（P0.05）。见表4。2.4 qRT-PCR检测结果 与对照组比较，模型组OCN和OPN mRNA水平均降低（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组OCN和OPN mRNA 水平均升高，miR-27a inhibitor 组OCN和OPN mRNA水平均降低（P0.05）；模型组和miR-27a NC组OCN和OPN mRNA水平比较，差异无统计学意义（P0.05）。见表5。表5 各组小鼠OCN和OPN mRNA水平比较（x s）组别对照组模型组miR-27a NC组miR-27a mimic组miR-27a inhibitor组n1010101010OCN8.470.392.550.41a2.730.45a6.590.61bc1.580.33bcdOPN6.830.442.470.30a2.350.33a5.770.42bc2.020.20bcd注：与对照组比，aP0.05；与模型组比，bP0.05；与miR-27aNC组比，cP0.05；与miR-27a mimic组比，dP0.052.5 OCN和OPN蛋白表达情况 与对照组比较，模型组 OCN 和 OPN 蛋白相对表达量均降低（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组OCN 和 OPN 蛋白相对表达量均升高，miR-27ainhibitor组OCN和OPN蛋白相对表达量均降低（P0.05）。见表6，图3。表6 各组小鼠OCN和OPN蛋白相对表达量比较（x s）组别对照组模型组miR-27a NC组miR-27a mimic组miR-27a inhibitor组n1010101010OCN0.910.040.160.01a0.150.01a0.680.03bc0.060.01bcdOPN0.890.030.110.04a0.100.02a0.710.03bc0.050.01bcd注：与对照组比，aP0.05；与模型组比，bP0.05；与miR-27aNC组比，cP0.05；与miR-27a mimic组比，dP0.05图3 蛋白印迹法检测OCN和OPN蛋白表达水平（A 对照组；B 模型组；C miR-27a NC组；D miR-27a mimic组；E miR-27ainhibitor组）2.6 细胞核和细胞质中-catenin 蛋白表达情况 与对照组比较，模型组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核（P0.05）；与miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组细胞质中-catenin蛋白表达低于细胞核，而miR-27a inhibitor组细胞质中-catenin 蛋白表达高于细胞核（P0.05）。见表7，图4。表7 细胞核和细胞质中-catenin蛋白表达水平比较（x s）组别对照组模型组miR-27a NC组miR-27a mimic组miR-27a inhibitor组n1010101010-catenin（细胞核）0.110.040.340.05a0.280.05a0.930.03bc0.380.04bcd-catenin（细胞质）0.930.020.820.04a0.810.05a0.080.02bc0.890.04bcd注：与对照组比，aP0.05；与模型组比，bP0.05；与miR-27aNC组比，cP0.05；与miR-27a mimic组比，dP0.05图4 细胞质和细胞核中-catenin蛋白表达水平（A 对照组；B 模型组；C miR-27a NC组；D miR-27a mimic组；E miR-27ainhibitor组）256Chin J Prosthodont,July 2023,Vol.24,No.4口腔颌面修复学杂志2023年7月第24卷第4期3.讨论骨质疏松患者由于骨密度降低极易发生骨折及继发性骨缺损，且难愈合，严重降低了患者的生活质量8。目前临床上主要通过天然骨组织或人工骨移植替代材料进行骨缺损重建，骨缺损是一个由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞共同作用的复杂而精细的过程9。Tang等10研究表明，miR-27a通过靶向PI3K促进糖皮质激素处理的人骨髓间充质干细胞的成骨分化。Xu等11研究表明，成肌细胞C2C12产生的外泌体中富含大量miR-27a，其可促进前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化。本研究通过摘取小鼠卵巢组织，降低雌激素合成建立骨质疏松模型，在此基础上，通过颅骨上钻孔的方式造成颅骨损伤，探讨miR-27a在骨质疏松小鼠颅骨损伤中的作用。首先本研究通过去卵巢建立骨质疏松模型小鼠，通过CT检测计算发现：去卵巢组小鼠BV/TV、骨小梁数量和骨小梁厚度均低于假手术组，该实验结果说明骨质疏松模型制备成功。之后，通过尾静脉注射慢病毒使miR-27a过表达或敲降miR-27a，影像学检测到模型组小鼠BV/TV、骨小梁数量和骨小梁厚度均低于对照组；miR-27a mimic组小鼠BV/TV、骨小梁数量和骨小梁厚度均高于miR-27a NC组，而miR-27a inhibitor组小鼠BV/TV、骨小梁数量以及骨小梁厚度均低于miR-27a NC组。ELISA检测血清中ALP活性和钙磷水平，结果发现，模型组小鼠ALP活性、钙磷水平低于对照组；miR-27a mimic组小鼠ALP活性、钙磷水平高于miR-27a NC组，而miR-27a inhibitor组ALP活性、钙和磷水平低于miR-27a NC组。说明miR-27a上调可促进颅骨缺损部位新生骨生成。本研究结果与蒋益忠等12的研究结果相一致。Wnts是一种分泌性蛋白，在GSK-3作用下将信号向下游传递，该信号通路在细胞增殖、分化过程中具有重要作用，GSK-3通过激活下游-catenin信号发挥作用13,14。Yang等15研究发现，样淀粉酶通过激活Wnt/-catenin信号通路可促进成骨细胞分化。Liu等16研究表明富含亮氨酸重复序列的g蛋白偶联受体6（LGR6）缺陷小鼠表现出指甲和骨再生障碍，成骨前细胞MC3T3-E1通过过表达LGR6稳定-catenin来增强MC3T3-E1细胞中Wnt/-catenin信号通路，从而促进成骨分化和矿化。在本研究中，与对照组比较，模型组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核；与 miR-27a NC 组比较，miR-27amimic组细胞质中-catenin蛋白表达低于细胞核，而miR-27a inhibitor 组细胞质中-catenin蛋白表达高于细胞核，说明miR-27a上调可激活Wnt/-catenin信号通路。OCN和OPN是成骨分化的标志物，因此本研究通过qRT-PCR和蛋白印迹法检测OCN和OPN mRNA和蛋白水平发现：模型组OCN和OPN mRNA和蛋白水平均低于对照组；与模型组和miR-27a NC组比较，miR-27a mimic组OCN和OPN mRNA和蛋白水平均升高，而miR-27a in-hibitor组OCN和OPN mRNA和蛋白水平均降低，说明miR-27a可促进骨质疏松小鼠颅骨缺损部位修复。综上所述，miR-27a表达上调可促进骨质疏松小鼠颅骨缺损部位修复，其可能与Wnt/-catenin信号通路具有相关性。但是本研究仍存在不足，对机制的研究不够深入，因此下一步将重点探讨-catenin发挥的具体作用。参 考 文 献1 McClungMR,ClarkAL.Osteoanabolictherapyforosteoporosis in womenJ.Climacteric,2022,25(1):60-662 RenLR,YaoRB,WangSY,etal.miR-27a-3ppromotestheosteogenicdifferentiationbyactivatingCRY2/ERK1/2 axisJ.Mol 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