3D打印技术制备β-TCP仿生骨支架的形态结构特点及其成骨性能分析.pdf

Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期183口腔材料器械杂志 基础与临床研究 3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架的形态结构特点及其成骨性能分析牛建华易敏许卫星（上海市黄浦区牙病防治所，上海200020）【摘要】目的分析 3D 打印技术制备-磷酸三钙（-TCP）仿生骨支架的形态结构特点及其成骨性能。方法随机选取 24 只新西兰兔，建立股骨髁部缺损模型。采用 3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架，将实验兔随机分为 2 组，每组 12 只。其中对照组未植入任何材料；实验组植入-TCP 仿生骨支架，观察4 周、8 周和 12 周后的两组骨修复结果，评价其成骨性能。结果实验组术后第 4 周、8 周、12 周时的骨组织学评分均高于对照组，骨小梁厚度、数目、骨小梁体积/总体积均高于对照组（P0.05）。结论3D 打印技术制备的-TCP 仿生骨支架，可促进骨缺损的修复，支架形态学结构及成骨性能与松质骨相近。【关键词】-TCP仿生骨支架3D 打印技术骨修复DOI：10.11752/j.kqcl.2023.03.06Prepared using 3D printing technology-morphological and structural characteristicsof TCP biomimetic bone scaffold and its osteogenic performance analysisNiu JianhuaYi MinXu Weixing（Shanghai Huangpu District Dental Disease Prevention and control Institute,Shanghai 200020）【Abstract】ObjectiveOur study analyzed the morphostructual characteristics and osteogenic properties of-Tricalcium phosphate（-TCP）biomimetic bone scaffold frbricated by 3D printing technology.MethodsRandomly select 24 experimental white rabbits and establish models of femoral condylar bone defects.Prepared using 3D printing technology-TCP biomimetic bone scaffold was randomly divided into 2 groups of 12 rabbits in each group.The control group was not implanted with any materials;Experimental group was implanted with-TCP biomimetic bone scaffold.After 4,8 and 12 weeks of observation,the bone repair results of the two groups were compared to evaluate the osteogenic performance.ResultsThe bone histological scores of the experimen-tal group were higher than those of the control group at weeks 4,8,and 12 after surgery.The thickness,number,and volume/total volume of bone trabeculae in the experimental group were higher than those in the control group(P0.05).Conclusions3D printing technology preparation-TCP biomimetic bone scaffold can promote the repair of bone defects,and its morphological struc-ture and osteogenic performance are similar to those of cancellous bone.【key words】-TCPBiomimetic bone scaffold3D printing technologyBone repair基金项目：上海市黄浦区科委科技项目基金(编号：HKM201727)通信作者：许卫星，Email:Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期184口腔材料器械杂志骨缺损是骨科及口腔科的常见症状，主要是因骨髓炎、创伤、肿瘤、牙周炎等因素导致，而关于骨缺损的修复一直是临床重点关注问题。目前，治疗骨缺损的常用方法为自体骨或者同种异体骨移植1,2，自体骨是目前公认的修复骨缺损的最佳方法，主要原因在于其具有良好的骨传导性、骨诱导性和生物相容性等，但由于可获得性有限、有创的取骨过程和较高的供骨部位并发症，使自体骨移植的应用受到限制3。同种异体骨虽然来源丰富，较易获得，但相对于自体骨，其缺乏良好的骨诱导性，成骨效果欠佳，并存在疾病传播和免疫排斥的风险4。随着组织工程学和材料学的迅速发展，为骨缺损修复提供了新的策略和方法。-磷酸三钙（Tricalcium phos-phate，-TCP）是骨修复的常用材料，其生物化学与无机骨相似，生物相容性高，骨传导能力强，随着骨缺损的愈合，-TCP 可逐渐降解，使其应用日益广泛5，6。3D 打印技术的发展，实现模型从二维到三维的快速打印，可用于大尺寸、高精度、多领域的产品打印，用于骨修复领域，可以制备具备骨诱导潜能的组织支架7,8。因此将 3D 打印技术用于-TCP 仿生骨支架的制备工程中，可精准控制支架的孔隙大小及连通情况，使孔径分布均匀，连接紧密。本文通过研究采用 3D 打印技术制备的-TCP仿生骨支架的形态结构特点及其成骨性能，为骨修复技术及材料应用提供参考依据。1材料和方法1.1主要试剂及仪器 戊巴比妥钠（德国 Sigma 公司），-TCP 粉剂（杭州慧搏科技有限公司），磷酸氢二钾、氧化锌、二氧化硅（自备）。FDM 3D 打印机（螺壳科技有限公司），螺旋 CT 机（美国 GE），离心机（湖南凯达，KL05A），扫描电子显微镜（日本 Hitatch公司），原位纳米力学测量系统（美国 Hysitron 公司），游标卡尺（精确度 0.05 mm）,电子力学测试机（中国深圳 SUNS 公司 UTM6503），多动能酶标仪(M200，TECAN 公司，瑞士)。1.2实验动物 1.2.1动物随机选取 24 只实验新西兰兔（北京维通利华实验动物技术有限公司提供），雌雄不限，雌性未孕，兔龄 56 个月，体重为 2.02.8 kg，且动物实验经动物伦理委员会批准。饲养环境干净、清洁，饮食、光照等正常。1.2.2动物骨缺损模型建立按 25 mg/kg 剂量配置 3%戊巴比妥那，耳缘静脉麻醉后，于左侧股骨下端做一切口，长约 2.0 cm，充分显露股骨远端，在侧副、腓侧韧带的中点处，用环钻（内径为 5 mm）垂直股骨进行钻孔，直径为 5.0 mm，长度为10.0 mm。股骨髁部缺损模型建立后，用生理盐水冲洗该部位的组织碎屑、凝血块。其中对照组12只，无需植入材料，依次缝合创口及皮肤。松质骨块保留，并进行生物学性能检测。1.2.3-TCP 仿生骨支架制备及骨缺损修复取-TCP 粉剂，按照 1:0.35 的固液比例，添加 20%柠檬酸，均匀混合，调制成稀糊状，再依次添加磷酸二氢钾、氧化锌、二氧化硅、石蜡，添加完成后予以搅拌，使其形成胶浆状，内部无晶体颗粒，将其置于 37、湿度为 100%环境内，时间为 72 h，使其固化。建立股骨髁部缺损的兔模型经过显微镜 CT 扫描，获取股骨髁部解剖结构的影像学图像及相关参数，将相关参数设置为 Dicom 格式后，导入计算机 Mimics 15.01 软件内，制作出与股骨髁部解剖结构相符合的空间结构模型，即用三维重建模式，对骨骼内骨小梁仿真结构进行重建。即制作直径为 5.0 mm，长度为 10.0 mm 的圆柱体，内部是由仿生骨小梁、孔隙组成，孔隙率为 65%。3D打印机：10 m 喷头，平面分辨率为 60 m，像素为 19201080，层厚设置为 25 m，曝光时间设置为 1 s，打印速率为 100 mm/h。将制备后的-TCP打印墨水置入料筒，根据已设计完成的形态，开启喷涂程序，打印出半成品骨支架。再对骨支架进行烧结，时间为 2 h，保持温度为 100。烧结完成后，将致孔剂石蜡微球去除，完成骨支架制作后采用伽马射线进行消毒处理。共制备出 24 枚-TCP 仿生骨支架，其中 12 枚用于实验组 12 只大白兔的骨缺损修复试验，其他 12 枚进行生物学性能检测。实验组分别于骨缺损（直径为 5.0 mm，长度为 10.0 mm）处植入 1 枚-TCP 仿生骨支架（直径为 5.0 mm，长度为 10.0 mm），活动关节，见Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期185口腔材料器械杂志植入物卡压牢固、紧密，逐层缝合切口，无菌敷料覆盖。对照组未植入任何材料，切口逐层缝合。两组动物均在术后常规臀肌注射青霉素 80104 U，庆大霉素 8104 U，切口敷料每天更换 1 次，连续3 d，并给予分笼饲养。1.3观察指标 1.3.1组织学观察分别在术后 4 周、8 周和 12周时每组随机选择 4 只兔子，气栓法处死，取骨缺损部位的标本。采用 micro CT 扫描，记录骨缺损处的骨小梁厚度、数量、间隙及骨小梁体积/总体积。然后对标本以 10%甲醛溶液固定，脱钙、脱水，石蜡包埋，连续切片，HE 染色，在显微镜下观察标本切片。按照 Lane-Sandhu 组织学评分9观察骨状态，骨连接评分如下：0 分为无骨连接；1 分为骨连接呈纤维状态；2 分为骨与类骨相连接；3 分为骨已连接；4 分为骨缺损处已完全再生骨干；松质骨评分如下：0 分为未有骨细胞；1 分为早期有新骨生成；2 分为有活性新骨生成；3 分为松质骨已逐渐形成；4 分为已完全形成松质骨；皮质骨评分如下：0 分为无皮质骨生成；1 分为有皮质骨生长的早期表现；2 分为皮质骨逐渐形成；3 分为皮质骨已大部分覆盖；4 分为皮质骨完全覆盖。1.3.2-TCP 仿生骨支架形态结构12 枚支架用于形态结构、力学性能检测，使用游标尺对每个支架的高度、直径进行测量，与松质骨标本的测量结果进行比较。将-TCP 仿生骨支架的二等分处予以横断切开，有效固定后，扫描电子显微镜下观察支架的具体形态，选择超过 10 个孔径层面，层面完整、清晰，对每个孔径的直径进行测量，计算其孔径值；并在建立三维结构后，采用计算机测定支架结构内部的孔隙率，与松质骨标本的测量结构进行比较。1.3.3生物力学性能应用电子力学测试机，准确测量骨支架的抗压强度和弹性模量，即对骨支架进行轴向加压，压力设为 0 kN，速度为 1 mm/min，使其压缩到 2%10%应变度，由计算机自动生成支架的压力-应变曲线，计算其弹性模量，为应力/应变程度。1.4统计学分析采用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布经（s）表示，采取 t 检验；多组数据用重复方差 F 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1组织学观察 动物在建立骨缺损模型后无死亡，均在术后第 2 天恢复饮食，切口无红肿、炎症感染等表现，切口一期愈合。经组织切片观察，术后第 48 周实验组植骨部位已有骨组织生长覆盖，骨小梁、骨髓组织增加 50%以上，植骨材料的表面已有新生骨逐渐覆盖，材料周围有成骨细胞生成。支架存在降解情况；术后 12 周骨小梁、骨髓组织形成，新生骨量多，支架已大部分降解，随着时间延长，新生骨及纤维组织生长均明显增加，见图 1。图 1组织学观察（200）注：a.对照组 4 w，b.对照组 8 w，c.对照组 12 w，d.实验组 4 w，e.实验组 8 w，f.实验组 12 w。Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期186口腔材料器械杂志对照组：术后第 48 周，骨缺损部位的骨组织生长较少，但存在大量的成纤维细胞、脂肪组织，缺乏成骨细胞，未观察到骨小梁结构；术后 12 周见缺损处有骨组织生长，但大部分缺损部位被成纤维细胞、脂肪细胞充填。实验组：术后第 4 周、8 周、12 周时的骨组织学评分均高于对照组（P0.05），见图 2。图 2两组组织学评分比较2.2比较不同组别骨小梁参数 实验组术后 4 周、8 周、12 周的骨小梁厚度、数目、骨小梁体积/总体积均高于对照组（P0.05），见表 2、图 3。3讨论骨组织具有一定的再生能力，但对于大面积骨缺损者，其修复能力较弱，缺损程度高于骨自身的修复能力，故而多需要采用临床干预治疗促使骨组织修复10。由于自体骨来源有限，同种异体骨有着排斥反应、感染风险，故而以最大程度促进骨组织修复的仿生骨支架制备一直是临床医学和材料学领域的研究热点11。骨组织工程的目的主要是促进具有功能的骨组织修复，其中支架可模拟骨骼形状、结构及功能，为骨细胞粘附、血管生成提供必要场所，并与骨细胞外基质特性相仿，促进骨细胞的附着、增殖和生长；并且支架内相互连通的孔隙可使骨组织生长，利于营养物质进入支架内，促使毒素排出，使其血管化12,13。-TCP 是一种磷酸钙基生物陶瓷，具有良好的生物相容性及骨传导能力，其降解速率快，安全性高14。因此采用 3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架，可根据骨缺损的结构、形态等制备三维骨支架，在制备过程中，支架的形状可控、规则，多孔结构相互连通，能满足临床特定的骨缺损修复需要15,16。本研究经动物实验发现，实验组术后第 4 周、8 周、12 周时的骨组织学评分均高于对照组，骨小梁厚度、数目、骨小梁体积/总体积均高于对表 1比较不同组别骨小梁参数（n=4,s）组别时间骨小梁厚度（m）骨小梁厚度数目（个/mm）骨小梁体积/总体积（%）实验组术后 4 周0.150.08a2.120.08a28.532.36a术后 8 周0.180.05a2.280.09a31.143.52a术后 12 周0.210.06a2.720.10a35.583.41a对照组术后 4 周0.080.061.050.0516.581.51术后 8 周0.110.041.100.0418.583.09术后 12 周0.130.051.150.0921.362.89F时间/P25.263/0.00128.432/0.00131.250/0.001F组间/P32.168/0.00142.105/0.00152.435/0.001F交互/P48.863/0.00168.513/0.00172.846/0.001注：与对照组比较，a 为 P0.05表 2-TCP 仿生骨支架形态结构与松质骨比较（s）组别直径（mm）高度（mm）孔隙率（%）抗压强度（MPa）弹性模量（MPa）-TCP 支架（n=12）5.100.899.950.0875.821.6863.824.1578.893.12松质骨（n=12）5.080.869.960.0776.041.7164.124.2080.043.28t0.0560.3260.3180.1760.880P0.9560.7480.7540.8620.388Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期187口腔材料器械杂志图 3扫描电镜观察-TCP 支架的形态结构 注：a.支架的孔隙直径约为 240400 m，结构规整，互相连通（10）；b.支架的表面形态（1000）照组（P0.05）。对照组术后第 4 周骨缺损部位存在大量的成纤维细胞，第 8 周骨缺损部位见大量脂肪组织，缺乏成骨细胞，未观察到骨小梁结构，第 12 周骨缺损处有骨组织生长，但大部分缺损部位被成纤维细胞充填。实验组术后第 8 周、12 周见新生骨长入支架材料内，新生骨小梁显著增多，新生骨较成熟。其结果与段钢等17的研究相一致，说明采用 3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架，能够促进骨修复效果，利于骨组织修复。根据骨缺损的形态、结构，采用 3D 打印技术制备出骨缺损结构、形态相符合的-TCP 仿生骨支架，可为骨缺损部位提供必要的支架，并促进与周围组织及时建立有效的血液循环，利于骨缺损的修复18。-TCP 植入后，支架内部的孔隙利于骨组织、血管生长，促进内皮细胞增殖、生长，以此能提高骨缺损的修复效果19。制备仿生骨支架必须要满足骨组织生长的要求，合适的孔径结构既能确保良好、稳定的机械结构，同时也能为骨细胞的迁移、粘附及增殖等提供良好场所，以此促进骨组织修复20,21。孔径大小是仿生骨支架的重要特性之一，采用 3D 打印技术可定制较为合适的孔径，一般孔径直径在100300 m 之间，能够允许细胞的运输、穿透、迁移及生长，促使良好的组织血管生成，从而能提高支架生物特性22,23。此外仿生骨支架必须要具备良好的机械强度，植入时能够起到良好的支撑作用，预防骨塌陷，促使骨组织修复24,25。本研究发现-TCP 仿生骨支架的直径、高度、孔隙率以及抗压强度、弹性模量均能达到接近正常的松质骨。说明 3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架具有良好的机械强度、生物学特性及形态结构，可为骨缺损的修复提供良好的支撑作用，并为骨细胞迁移及血管生长提供有利场所。采用 3D 打印技术，可制备出标准工艺的个体化仿生骨支架，精准、可控，以此满足骨缺损修复的需求26；同时-TCP 的主要成分为钙、磷等成分，降解后也可为新骨生成提供钙磷离子，为骨组织修复提供营养成分，促进骨愈合27。成骨细胞可以通过 30 m 孔隙，当孔隙率达到 30%以上，孔隙间可相互连通，当其孔径超过 50 m 时，利于骨单元形成28。采用 3D 打印技术，支架的表面、内部分布均匀的孔隙，大小相似，侧壁布满微孔，可以促进骨生长。支架对应的弹性模量与人体松质骨相近，为骨组织的修复提供适当的支撑。4结论综上所述，3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架与松质骨相似，形态结构能利于成骨细胞的附着、增殖及血管生成，避免骨塌陷，进一步为骨缺损的修复提供良好的支持。3D 打印技术制备-TCP 仿生骨支架可促进骨缺损的修复，支架形态学结构及成骨性能与松质骨相近。可作为一种骨缺损修复材料的选择。参考文献1 Clements JR,Carpenter BB,Pourciau JK.Treating segmental bone defects:a new techniqueJ.Foot Ankle Surg,2008,47(4):350-3562 Paderni S,Terzi S,Amendola L.Major bone defect treatment with anosteo conductive bone substituteJ.Musculoskelet Surg,Chin J Dent Mater Dev 2023年第32卷第3期188口腔材料器械杂志2009,93(2):89-963 Virk MS,conduah A,Park SH,et al.Influence of short-term adenoviral vector and porlonged lentiviral vector mediated bone morphogenetic protein-2 expression on the quality og bone repair in a rat femoral defect modeJ.Bone,2008,42(5):921-9314 Gazdag AR,Lane JM,Glaser D,et al.Alternatives to autogenous bone graft:efficacy and indicationsJ.J Am Acad Orthop Surg,1995,3(1):1-85 张航，韩坤原，董兰兰，等.DLP 打印-磷酸三钙/纳米黏土复合支架的制备与表征 J.无机材料学报，2022，7(10):1116-1122.6 Tateiwa D,Nakagawa S,Tsukazaki H,et al.A novel BMP-2-loaded hydroxyapatite/beta-tricalcium phosphate microsphere/hydrogel composite for bone regenerationJ.Sci Rep，2021，11(1):16924.7 Pazareviren AE,Tezcaner A,Keskin D,et al.Boron-doped Bi-phasic Hydroxyapatite/-Tricalcium Phosphate for Bone Tissue EngineeringJ.Biol Trace Elem Res,2021,199(3):968-980.8 Lee YC,Chan YH,Hsieh SC,et al.Comparing the Osteogenic Potentials and Bone Regeneration Capacities of Bone Marrow and Dental Pulp Mesenchymal Stem Cells in a Rabbit Calvarial Bone Defect ModelJ.Int J Mol Sci,2019,20(20):5015.9 Rushton M J D,Chroneos A.A critical assessment of interatomic potentials for ceria with application to its elastic properties re-visitedJ.Journal of Materials Science Materials in Electronics,2013,24(11):4590-459210 Heng BC,Bai Y,Li X,et al.Electroactive Biomaterials for Fa-cilitating Bone Defect Repair under Pathological ConditionsJ.Adv Sci(Weinh),2023,10(2):e2204502.11 Gugjoo MB,Amarpal,Sharma GT,et al.Cartilage tissue engi-neering:Role of mesenchymal stem cells along with growth fac-tors&scaffoldsJ.Indian J Med Res,2016,144(3):339-34712 付冬梅，周婧，王浪，等.改良型富血小板纤维蛋白与-磷酸三钙复合物诱导成骨作用与机制 J.口腔疾病防治，2023，31(4):237-244.13 张艳波，霍峰，王雪峰，等.HA 复合-TCP 在新西兰兔上颌窦提升术中的成骨及成血管效果 J.中国老年学杂志，2023，43(3):643-647.14 Ding X,Li A,Yang F,et al.-tricalcium phosphate and octacal-cium phosphate composite bioceramic material for bone tissue engineeringJ.J Biomater Appl,2020,34(9):1294-1299.15 Park JH,Jung SY,Lee CK,et al.A 3D-printed polycaprolactone/-tricalcium phosphate mandibular prosthesis:A pilot animal studyJ.Laryngoscope,2020,130(2):358-366.16 余专一，陈晶祥，程球新，等.3D 打印纳米-磷酸三钙支架缓释功能的初步研究 J.中华生物医学工程杂志,2021，27(5):465-470.17 段钢，陈宏亮，郭开今，等.3D 打印-磷酸三钙仿生骨支架修复兔股骨髁骨缺损 J.骨科临床与研究杂志,2020,5(4):243-250.18 Wei S,Zhang RG,Wang ZY.Deferoxamine/magnesium modified-tricalcium phosphate promotes the bone regeneration in osteo-porotic ratsJ.J Biomater Appl,2022,37(5):838-849.19 陈宏亮，郭开今，陈向阳，等.3D 打印技术制备-磷酸三钙仿生骨支架在兔股骨髁部骨缺损修复中的应用 J.中华解剖与临床杂志,2021,26(5):571-577.20 刘宸境，宋涛，殷楚强，等.3D 打印聚己内酯/-磷酸三钙/碳纳米管复合材料的物理性能及生物相容性 J.中华实验外科杂志,2021,38(5):968.21 Ye X,Zhang Y,Liu T,et al.Beta-tricalcium phosphate enhanced mechanical and biological properties of 3D-printed polyhydroxy-alkanoates scaffold for bone tissue engineeringJ.Int J Biol Macromol,2022,209(Pt A):1553-1561.22 Yoshida M,Turner PR,McAdam CJ,et al.A comparison between-tricalcium phosphate and chitosan poly-caprolactone-based 3D melt extruded composite scaffoldsJ.Biopolymers,2022,113(4):23482.23 王建，范江伟，陈洪涛.3D 打印多孔-TCP 负载 VAN/PLGA 缓释微球复合支架的表征评价 J.北京生物医学工程，2022,41(5):471-476.24 Xu Z,Sun Y,Dai H,et al.Engineered 3D-Printed Polyvinyl Al-cohol Scaffolds Incorporating-Tricalcium Phosphate and Icariin Induce Bone Regeneration in Rat Skull Defect ModelJ.Mole-cules,2022,27(14):4535.25 Tebyanian H,Norahan MH,Eyni H,et al.Effects of collagen/-tricalcium phosphate bone graft to regenerate bone in critically sized rabbit calvarial defectsJ.J Appl Biomater Funct Mater，2019,17(1):2280800018820490.26 Tao ZS,Li TL,Wei S.Co-modified 3D printed-tricalcium phosphate with magnesium and selenium promotes bone defect regeneration in ovariectomized ratJ.J Mater Sci Mater Med，2023,34(1):7.27 Boda R,Lzr I,Kecznn-veges A,et al.-Tricalcium Phos-phate-Modified Aerogel Containing PVA/Chitosan Hybrid Nano-spun Scaffolds for Bone RegenerationJ.Int J Mol Sci,2023，24(8):7562.28 陈凯歌，陈仁吉，郭思远，等.人工骨材料-磷酸三钙在牙槽嵴裂骨缺损修复中的应用 J.口腔疾病防治,2023,31(4):252-256.（收稿日期：2023-04-09修回日期：2023-06-19)