KISS1基因SNP对柯乐猪繁殖性状的影响.pdf

遗传育种与繁殖932023.80 引言恶性黑色素瘤细胞系中的转移肿瘤抑制基因KISS1于1996年首次被鉴定，其编码的Kisspeptin及其特异性受体G蛋白偶联受体54（GPR54，也称KISS-1R）能够收稿日期：2023-05-31基金项目：贵州省科技支撑计划（黔科合支撑2021一般 147）；贵州省生猪产业发展项目（黔财农2021157号、黔财农2022183号）；贵州省种业发展项目（黔农计财202210号）；国家重点研发计划子课题（2022YFD1100308-01）作者简介：熊力（1990-），男，贵州思南人，硕士，兽医师，研究方向：动物疫病防控。*通信作者简介：张依裕（1976-），男，贵州黔西人，博士，教授，研究方向：动物遗传与育种。熊力，谭元成，郭小江，等KISS1基因SNP对柯乐猪繁殖性状的影响J现代畜牧科技，2023，99（8）：93-96doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.025XIONG Li，TAN Yuancheng，GUO Xiaojiang，et alEffects of KISS1 Gene SNP on Reproductive Traits of Kele PigsJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：93-96KISS1基因SNP对柯乐猪繁殖性状的影响熊力1，谭元成2，郭小江3，杨红文4，杨齐心4，杨酸2，向进2，张依裕2*（1.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550000；2.贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖 教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省草地技术试验推广站，贵州 贵阳 550000；4.贵州省畜禽遗传 资源管理站，贵州 贵阳 550000）摘要：研究旨在了解KISS1基因对猪繁殖力的影响，以78头初产柯乐猪为材料，采用聚合酶链式反应（PCR）产物直接测序与人工较对相结合鉴定KISS1基因单核苷酸多态性（SNP）位点，分析SNP位点对柯乐猪繁殖指标的影响。结果显示在KISS1基因第1外显子处发现g.64835073 AG同义突变，在第1内含子处发现g.64835529 GA突变，2个SNP位点均产生3种基因型，均为中度多态位点，且均符合Hardy-Weinberg平衡；g.64835073 AG位点对5个繁殖指标的影响未能达到显著水平（P0.05）；其中g.64835529 GA位点对总产仔数、初生个体重、断奶个体重的影响达显著水平，揭示g.64835529 GA位点可能作为猪产仔数的一个分子标记。关键词：柯乐猪；KISS1基因；SNP；繁殖性状中图分类号：S828.3文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.025Effects of KISS1 Gene SNP on Reproductive Traits of Kele PigsXIONG Li1，TAN Yuancheng2，GUO Xiaojiang3，YANG Hongwen4，YANG Qixing4，YANG Suan2，XIANG Jin2，ZHANG Yiyu2*（1.Center for Animal Disease Control and Prevention of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550000，China；2.Key Laboratory of Genetic Breeding and Reproduction of Plateau Mountain Animals，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China；3.Grassland Technology Experiment Extension Station of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550000，China；4.Livestock and poultry Genetic Resources Management Station of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550000，China）Abstract：To understand the effect of KISS1 on reproductive traits of pigDirect sequencing of PCR products was combined with artificial comparison to identify the SNPs of KISS1 gene in 78 Kele pigs and analyze the influence of SNP sites on reproductive indexesThe results showed that the g.64835073 AG and g.64835529 GA mutation were found in exon 1 and intron 1 of KISS1 gene，respectivelyThe two SNPs sites produced three genotypes，all of which were moderately polymorphic sites and in line with Hardy-Weinberg equilibriumThe effects of g.64835073 AG on five reproductive indices were not significant（P0.05），the effects of G.64835529 G A locus on total litter size,birth weight and weaning weight were significant，and suggested that the g.64835529 GA site may be a molecular marker of pig litter sizeKeywords：Kele pig，KISS1 gene，SNP，reproductive traits遗传育种与繁殖94 2023.8抑制肿瘤细胞的转移1。Kisspeptin/GPR54协同调控下丘脑垂体性腺轴（HPGA）的神经内分泌功能进而对哺乳动物的生殖系统产生重要影响2。近年研究报道显示，KISS1基因除了具有抑制肿瘤转移的功能外，对哺乳动物的滋养细胞浸润、促性腺激素的分泌、启动青春期发育、卵泡发育成熟、调节体况和能量平衡以及生物节律等起重要的调控作用3-4。Kisspeptin/GPR54参与子宫内膜的生长和增殖，调节子宫内膜细胞分化和血管生成，通过控制子宫内膜腺体分泌物调节胚胎植入，揭示其对哺乳动物胚胎与子宫上皮细胞的黏附起着极其重要的作用，推测其可能影响哺乳动物的产仔数量5-6。为了进一步阐述KISS1基因对猪繁殖性能的影响，本试验开展KISS1基因在柯乐猪中的遗传变异情况，分析其变异对繁殖性状的遗传效应，判定其作为分子标记对猪繁殖力选择的可行性。1 材料与方法1.1 试验动物、样品和数据收集试验动物为柯乐猪初产母猪78头，来自于贵州省赫章县柯乐猪保种场；消毒耳号钳采集耳组织，70%乙醇溶液清洗后贮存于-40 冰箱中；测定总产仔数、产活仔数、初生个体重、断奶仔猪数/头和断奶个体重共5个繁殖指标。1.2 DNA提取按照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304）的操作说明书对每个柯乐猪个体基因组DNA进行提取，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，核酸/蛋白检测仪测定DNA浓度，稀释成终浓度100 ng/mL，用于PCR扩增。1.3 引物设计与PCR扩增根据GenBank收录的KISS1基因（NC_010451.4）序列，用Premier 5.0 软件设计3对引物，扩增KISS1基因部分内含子、外显子1至外显子3，引物信息见表1。PCR扩增体系20 mL：PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix（2）10 mL、10 mmol/L Forward Primer 1 mL、10 mmol/L Reverse Primer 1 mL、DNA 1 mL、ddH2O 7 mL。PCR反应程序：95 预变性7 min；95 变性 50 s，60 退火50 s，72 延伸60 s，共35个循环；72 最终延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统拍照，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。表1 引物信息引物引物序列（5 3）长度（bp）Tm（）扩增位置K1F1：GGGATTGGTGATTCTCAGTCR1：CACATATTTCCCCAGGATGT59260Exon 1K2F2：TTCCGGCCAACTAAGGAAATR2：TCAGACAATCGACCAACCAA71160Exon 2K3F3：TCCCAGGATTGTCTCAGCTTR3：GGGTTGAATCGGAGCTACA76960Exon 31.4 统计分析利用Chromas软件和人工较对鉴定KISS1基因SNP位点，运用SHEsis（http:/analysis.bio- 21中的一般线性模型（GLM）分析SNP位点与繁殖性状指标的关系，结果用“平均值标准差”表示。2 结果与分析2.1 KISS1基因SNP鉴定利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测3对引物的PCR产物进行检测，扩增条带清晰且与设计预期片段大小相符，符合开展下一步试验的条件（图1A）。通过序列比对，在柯乐猪KISS1基因中共检测到2个SNPs位点：位于第1外显子的g.64835073 AG同义突变和位于第1内含子的g.64835529 GA突变（图1B），均检测出3种基因型。A：PCR产物检测 B：SNP鉴定图1 KISS1基因PCR产物检测（A）及SNP鉴定（B）2.2 KISS1基因SNP位点遗传特性分析KISS1基因中发现的2个SNP位点在柯乐猪群体中的遗传特性结果，见表2。AA和GA分别是g.64835073 AG和g.64835529 GA的优势基因型，频率分别是0.590和0.539；g.64835073 AG和g.64835529 GA位点的优势等位基因A和G的频率分别是0.731和0.539，且均属于中度多态（0.25PIC0.50）；2个SNP位点的基因型分布未偏离Hardy-Weinberg平衡（P0.05）。AAGGg.64835073 AGg.64835529 GAg.64835073 AGg.64835529 GAg.64835073 AGg.64835529 GAAGGAGGAAbpM 1 2 32 0001 000750500250100遗传育种与繁殖952023.83 讨论目前的研究证实，KISS1基因具有调节促性腺激素释放、卵泡发育成熟、胚胎附植、生殖系统内分泌代谢等方面发挥重要作用7-8。Fabov Z等9的研究报道卵巢中KISS1基因编码的Kisspeptin具有特异性时空分布，揭示其在不同生理阶段的卵巢中发挥多种功能，表明其在调控卵泡发育中起至关重要的作用，低剂量和中等剂量的Kisspeptin可以直接刺激卵巢细胞的增殖，抑制细胞凋亡。孙晓煜等10研究发现，Kiss-1 mRNA及其蛋白在发情周期和乏情期的子宫、输卵管和卵巢中均有表达，发情期卵巢中KISS1 mRNA及其蛋白表达量最高；间情期子宫中KISS1 mRNA及其蛋白表达量显著高于发情周期其他3个时期；发情期输卵管中KISS1 mRNA表达量最高，卵巢中Kisspeptin免疫阳性产物主要分布在卵泡膜和泡颗粒层上，输卵管中主要在黏膜上皮的分泌细胞、纤毛细胞中表达，子宫中主要在基质细胞和上皮细胞中表达，表明KISS1对甘加藏羊生殖生理有重要调控活动。安笑笑等11报道KISS1和TrkA参与调控家兔妊娠过程。王明晶等12在夷陵绵羊KISS1基因中发现11个SNP，g.5765CT突变能显著影响产羔数。本研究在柯乐猪KISS1基因中检测到2个SNP位点，位于第1外显子的g.64835073 AG同义突变导致了KISS1 mRNA二级结构发现了改变，突变型G的稳定性高于野生型A，但对柯乐猪5个繁殖指标的影响未能达到显著性水平；位于第1内含子的g.64835529 GA突变对柯乐猪总产仔数、初生个体重和断奶个体重的影响达到显著水平。前人的报道表明，内含子虽然在转录过程中被剪切，但其内含子突变可能影响剪接的效率近而调控转录，若突变紧邻剪接位点可能导致剪接失效，产生可变剪接甚至基因失活进而影响机体表型13。多态信息含量（PIC）反映群体内基因变异的重要指标，PIC数值越大，变异程度起越大，群体的表型性状差异也会越大，育种进展就越大，反之则越小14。另外，有些外显子的突变会影响基因mRNA结构和稳定性进行对翻译起2.3 KISS1基因g.64835073 GA位点对mRNA二级结构的影响通过分析KISS1基因g.64835073 GA位点等位基因G和A的mRNA二级结构，等位基因A与GenBank中收录的mRNA序列相同（NM_174059.2），A位点突变成G位点导致KISS1 mRNA二级结构发生变化（见图2圆圈标记处二级结构颜色存在差异），自由能由-2 022.70 kJ/mol变为-1 804.70 kJ/mol，自由能增加，稳定性增加。2.4 KISS1基因SNP位点对柯乐猪繁殖性状的影响通过分析柯乐猪KISS1基因2个SNPs位点与繁殖性状的相关性，见表3。g.64835073 AG位点对柯乐猪5个繁殖指标的影响未能达到显著水平（P0.05）；g.64835529 GA位点的GA基因型个体的总产仔数显著高于AA基因型（P0.05），AA基因型的初生个体重显著高于GA基因型个体（P0.05），AA基因型个体的断奶个体重显著高于GG基因型个体（P0.05），其他指标在各基因型间差异未能达到显著水平（P0.05）。图2 KISS1基因g.64835073 GA突变引起mRNA二级 结构变化表2 KISS1基因SNP位点的群体遗传参数位点基因型频率（样本数）等位基因型频率PICx2g.64835073AGAA（46）AG（22）GG（10）AG0.3161.2410.5900.2820.1280.7310.269g.64835529GAGG（21）GA（42）AA（15）GA0.3731.4780.2690.5390.1920.5390.461注：PIC-多态信息含量，x20.05（2）=5.991，x20.01（2）=9.21。表3 KISS1基因SNP与繁殖性状的相关性位点基因型总产仔数（头）产活仔数（头）初生个体重（kg）断奶仔猪数（头）断奶个体重（kg）g.64835073 AGGG8.711.118.220.261.030.057.491.015.750.23AG9.050.288.421.071.040.037.070.265.530.11AA8.840.228.150.241.080.027.080.235.830.14g.64835529 GAGG 8.770.33ab8.100.37 1.060.03ab6.810.36 5.520.12bGA 9.190.27a8.350.24 1.030.02b7.320.24 5.670.10abAA 8.450.31b7.870.38 1.140.03a6.860.37 6.000.20a注：同列同位点数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。原序列（A64835073）突变（G64835073）遗传育种与繁殖96 2023.8重要调控作用，影响蛋白质表达水平而导致动物表型差异，但这种差异也可能会由于与其连锁突变消除了这种效应，最终不会对表型产生显著影响15。研究结果揭示g.64835529 GA突变位点可能作为柯乐猪繁殖性状选择的一个分子标记。4 结论本研究在柯乐猪KISS1基因第1外显子处发现g.64835073 AG同义突变，在第1内含子处发现g.64835529 GA突变，其中g.64835529 GA位点对总产仔数、初生个体重、断奶个体重的影响达显著水平，揭示g.64835529 GA位点可能作为猪产仔数的一个分子标记。参考文献1Motti M L，Meccariello RMinireview：the epigenetic modulation of KISS1 in reproduction and cancerJInt J Environ Res Public Health，2019，16（14）：2 6072Chen J，Minabe S，Munetomo A，et alKiss1-dependent and independent release of luteinizing hormone and testosterone in perinatal male ratsJEndocr J，2022，69（7）：797-8073陆思羽，何颖婷，周小枫，等干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响J中国农业科学，2020，53（23）：4 940-4 9494Li X，Liang C，Yan YNovel insight into the role of the Kiss1/GPR54 system in energy metabolism in major metabolic organsJCells，2022，11（19）：3 1485Flrez J M，Martins K，Solin S，et alCRISPR/Cas9-editing of KISS1 to generate pigs with hypogonadotropic hypogonadism as a castration free traitJFront Genet，2023，13：1 078 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