2016—2020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究.pdf

热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4手足口病防控专题20162020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究冯明子1，傅荔艳1，葛盈露2，马婉婉2，王鹏2，孙永2，史永林1,21.安徽医科大学公共卫生学院，安徽 合肥 230032；2.安徽省疾病预防控制中心，安徽省公共卫生研究院，安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室摘要：目的了解安徽省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）相关柯萨奇病毒A组16型（coxsackievi-rus A16,CV-A16）基因型别分布情况。方法通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统收集安徽省20162020年HFMD病例资料，并收集HFMD患儿咽拭子标本。对荧光定量PCR检出的CV-A16核酸阳性病例样本采用RT-PCR扩增VP1区基因片段并测序。运用肠道病毒在线分型工具确定基因型别，再利用MEGA6.0生物软件构建CV-A16 VP1区基因进化树并分析VP1区氨基酸变异位点。结果20162020年安徽省累计报告HFMD实验室确诊病例16 650例，其中CV-A16确诊病例3 809例（占22.88%），各年中CV-A16确诊病例占比依次为20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。对获取的436份CV-A16阳性标本进行测序，获得290条VP1区基因序列，均属于B基因型，其中B1a基因亚型 65条，B1b 225条。290条VP1区基因序列核苷酸同源性为86.80%100.00%，与CV-A16原型株G-10核苷酸同源性为74.10%76.80%。65条B1a毒株VP1区基因序列与B1a参考株核苷酸同源性为93.00%99.90%，225条B1b毒株VP1区基因序列与B1b参考株核苷酸同源性为88.40%99.60%。B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇，B1b基因亚型流行株在遗传进化上分为6个分支簇。与原型株G-10 VP1区编码氨基酸位点变异分析显示，290条VP1区基因存在多个位点变异。结论20162020年安徽省HFMD CV-A16流行株B1a与B1b基因亚型二者共同流行，应持续关注安徽省肠道病毒病原监测与分子进化变异情况。关键词：手足口病；柯萨奇病毒A组16型；分子分型；安徽省中图分类号：R373.2文献标识码：A文章编号：1672-2302（2023）04-0199-05DOI：10.3969/j.issn.1672-2302.2023.04.005Molecular typing of coxsackievirusA16 associated hand,foot and mouthdisease inAnhui Province,2016-2020FENG Mingzi1,FU Liyan1,GE Yinglu2,MAWanwan2,WANG Peng2,SUN Yong2,SHI Yonglin1,21.School of Public Health,Anhui Medical University,Hefei 230032,Anhui Province,China;2.Anhui Provincial Centerfor Disease Control and Prevention;Public Health Research Institute of Anhui Province;Key Laboratory for Medicaland Health Science of Anhui ProvinceCorresponding author:SHI Yonglin,E-mail:Abstract：ObjectiveTo understand the genetic types of coxsackievirus A16(CV-A16)associated with hand,foot andmouth disease(HFMD)in Anhui Province.MethodsThe case data on HFMD reported in Anhui Province from 2016to 2020 were downloaded from the Infectious Disease Reporting and Management System under the China Disease Pre-vention and Control Information System,and the throat swab samples were collected from HFMD children during thecorresponding period.The samples of positive CV-A16 nucleic acid detected by real-time PCR were selected,and ampli-fied for VP1 gene using reverse transcription PCR.Then the positive PCR products were sequenced.Software Molecu-lar Evolutionary Genetics Analysis(MEGA,version 6.0)was used to construct the phylogenetic tree and for analysis ofthe mutation at amino acid of VP1 gene.ResultsIn total,16 650 cases of HFMD confirmed by laboratory studieswere reported in Anhui Province from 2016 to 2020,including 3 809 cases of CV-A16 types(22.88%).The annual con-stituent ratio of CV-A16 was 20.72%(219/1 057),22.91%(677/2 955),23.89%(1 004/4 202),42.58%(1 687/3 962)and 4.96%(222/4 474),respectively in different years.290 VP1 sequences were obtained from 436 CV-A16 positive基金项目：安徽省自然科学基金项目（1708085QH186）作者简介：冯明子，女，硕士在读，研究方向：公共卫生检验与检疫。E-mail:通信作者：史永林，E-mail: 199热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4specimens,all of which belonged to B genotype,including 225 from B1b and 65 from B1a.The nucleotide homology of290 VP1 sequences was in between 86.80%and 100.00%,and that of G-10 VP1 sequence was in between 74.10%and76.80%.The nucleotide homology between 65 strains VP1 of B1a and reference strains identified as genotype B1a inGenBank database was 93.00%-99.90%.The nucleotide homology between the VP1 sequence of 225 B1b strains and thereference strains identified as genotype B1b in GenBank database was 88.40%-99.60%.The B1a and B1b genotypesconsisted of 4 sub-clusters and 6 sub-clusters in genetic evolution.Amino acid variation analysis of the prototype strainG-10 revealed mutations at many sites of CV-A16.ConclusionB1a and B1b gene subtypes of HFMD CV-A16strains were co-prevalent in Anhui Province during 2016-2020.It is necessary to continually monitor the molecular evo-lution of enterovirus pathogens in Anhui Province.Keywords：Hand,foot and mouth disease;CV-A16;Molecular typing;Anhui Province柯 萨 奇 病 毒 A 组 16 型（coxsackievirus A16,CV-A16）是小RNA病毒科肠道病毒属的一种，为单正链RNA病毒，基因组全长约7.4 kb，是引发手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）的常见病原体之一，于 1951 年首次被分离出1。按照CV-A16 基因组 VP1 区基因序列可将其分为 A、B和D三个基因型，A基因型的唯一成员是G-10原型株；而B基因型分为B1、B2亚型，B1亚型进一步分为 B1a、B1b 和 B1c；D 基因型为新发现型别，比较少见2-3。近年来安徽省HFMD发病水平一直较高，而对HFMD相关病原学的分子分型研究相对较少4-5。本研究收集安徽省各地的HFMD CV-A16核酸阳性咽拭子标本，利用生物信息学和分子遗传学方法鉴定病毒基因型，并对其VP1区测定的序列进行遗传进化和氨基酸变异位点分析，为进一步研究疾病分子机制提供参考依据。1材料与方法1.1资料与标本来源本研究中安徽省2016年1月2020年12月HFMD病例信息来源于中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统。收集安徽省各市（县、区）2016年1月2020年12月HFMD患者CV-A16核酸阳性咽拭子样本。病例标本采集与实验室检测符合 手足口病预防控制指南（2009版）6要求。1.2主要试剂与仪器核酸提取试剂盒（665A，中国台湾圆点公司）；磁珠法自动核酸提取仪（SLA-32，中国台湾圆点公司）；荧光定量PCR扩增仪（Quant-Studio 5,Thermo Fisher）；普通PCR扩增仪（Master-cycler X50P,Eppendorf）；肠道病毒CV-A16荧光定量PCR检测试剂盒（P531，西安天隆公司）；PrimeScriptOne Step RT-PCR Kit Ver 2.0（RR055A,Takara）。1.3核酸抽提与荧光定量PCR 和RT-PCR取出保存的咽拭子标本在室温条件下融化，漩涡振荡混匀后在二级生物安全柜内取200 L混匀液抽提病毒RNA，提取步骤按照核酸提取仪操作说明书进行，程序运行完成后吸取核酸洗脱液置-20备用。采用肠道病毒CV-A16荧光定量PCR检测试剂盒对收集到的HFMD核酸阳性标本进行检测，对检出的 CV-A16 阳性标本 VP1 区基因序列进行RT-PCR扩增。CV-A16 VP1区基因RT-PCR扩增引物（CV-A16-VP1-S/CV-A16-VP1-A）参照文献7，RT-PCR 扩增体系 25 L，反应条件：逆转录 5030 min，1 个循环；预变性9515 min，1 个循环；三步循环 9430 s，5030 s，721 min，40个循环；总延伸7210 min。PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离特异性目的条带。1.4基因序列测定与进化分析将扩增出的阳性PCR产物送到上海伯杰医疗科技股份有限公司测序，测序结果提交到肠道病毒在线分型网站（https:/www.rivm.nl/mpf/typing tool/enterovirus/）进行CV-A16基因型别分析，并同步提交到NCBI 网站进行BLAST 比对。从 GenBank 数据库下载CV-A16各基因型参考序列，在 MEGA 6.0 生物软件中采用Clustal W 法 进 行 基 因 序 列 比 对，采 用 邻 接 法（neighbor-joining,NJ）构建 CV-A16 VP1 区基因系统进化树。肠道病毒参考株 VP1 区序列分别为U05876、EU812514、AM292468、AM292455、LT577709、AM292476、JN248420、KU596021、KX871389、KX586352、MW197387、MW999272、MW999274、MT553210、MT553192、MT553208、MW197395、LC603085、MT119437、MT553222、MT663414、MZ043547、MZ491035、KM260139、KU595992、KX871449、MH003973、MT119428、MW197293、MW197351、MW462142、KC866888、KP341916。2结果2.1HFMD 流行概况20162020 年安徽省累计报告 HFMD 实验室确诊病例 16 650 例，各年依次为 1 057 例、2 955 例、4 202 例、3 962 例、4 474例。肠道病毒A组71型（enterovirus A71,EV-A71）200热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4共 1 296 份（占 7.78%）；CV-A16 型共 3 809 份（占22.88%）；其 他 型 别 共 11 545 份（占 69.34%）。20162020 年 CV-A16 在实验室确诊病例中的构成比依次为20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。见图1。2.2测序与基因型别鉴定共有 436 份 CV-A16核酸阳性样本纳入研究。经测序后进行比对和同源性分析获得290条阳性序列，均为B1亚型，其中B1a 基因亚型 65 株，占 22.41%（65/290），B1b 基因亚型225株，占77.59%（225/290）。见表1。2.3同源性比较与进化分析290条CV-A16 VP1基因序列核苷酸碱基均为891个，编码297个氨基酸，未见缺失或插入序列；其核苷酸和氨基酸序列同源性为86.80%100.00%和97.60%100.00%，与CV-A16原型株（G-10,U05876）核苷酸和氨基酸序列同源性为 74.10%76.80%和 90.50%92.20%；65条B1a型VP1区基因序列与GenBank数据库中B1a参考株（KC866888）核苷酸和氨基酸序列同源性为 93.00%99.90%和 98.60%100.00%，225 条B1b 型 VP1 区基因序列与 GenBank 数据库中 B1b参考株（KP341916）核苷酸和氨基酸序列同源性为88.40%99.60%和98.60%100.00%。CV-A16 VP1 基因序列亲缘性进化树分析表明，20162020年安徽省CV-A16流行毒株属于B基因型 B1a 和 B1b 基因亚型，未鉴定出其他基因型。进一步分析显示，CV-A16 B1a基因亚型流行株在遗传进化上大致分为 Cluster A、Cluster B、Cluster C 和 Cluster D 分支簇。见图 2。2017 年阜阳市、2020年淮南市和合肥市部分B1a 流行株属于Cluster A进化分支；2019年合肥市、宣城市、黄山市、蚌埠市和淮北市B1a流行株属于Cluster B进化分支；2018年和2020年合肥市部分B1a流行株属于Cluster C进化分支；2016年安庆市B1a流行株属于Cluster D进化分支。Cluster D分支簇流行株与福建株（KU596021）、山东烟台株（KX586352）、上海株（KX871389）亲缘性关系较近。20162020年鉴定出的CV-A16 B1b基因亚型流行株在遗传进化上大致分为6个分支簇（Cluster），见图2。2016年阜阳市、合肥市，2017年宣城市、安庆市、滁州市，2018年蚌埠市、铜陵市，2019 年合肥市、宣城市的 B1b 流行株属于 Cluster图120162020年安徽省HFMD实验室确诊病例和CV-A16病例分布情况Figure 1Monthly reported HFMD cases confirmed via laboratory studies and the proportion of CV-A16 cases in Anhui Provincefrom 2016 to 2020表120162020年安徽省HFMD CV-A16基因型分布情况Table 1Distribution of HFMD CV-A16 genotypes inAnhui Province from 2016 to 2020年份20162017201820192020合计VP1区基因序列数6660648317290B1a序列数446361565比例（%）6.066.679.3843.3788.2422.41B1b序列数625658472225比例（%）93.9493.3390.6256.6311.7677.59 201热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4进化分支；2017年淮北市和阜阳市，2018年合肥市和蚌埠市B1b流行株属于Cluster 进化分支；2016年安庆市和阜阳市B1b流行株属于Cluster 进化分支；2016 年合肥市和阜阳市，2017 年合肥市、宣城市、安庆市和滁州市，2018年铜陵市，2019年宣城市和铜陵市部分流行株属于Cluster 进化分支；2016年阜阳市、安庆市，2017年滁州市、阜阳市、合肥市和2019年合肥市部分流行株属于Clus-ter 进化分支；2016 年安庆市、2017 年合肥市、2018年铜陵市部分流行株属于Cluster 进化分支。2.4VP1 区氨基酸变异位点分布情况20162020年CV-A16型VP1基因序列与CV-A16原型株（G-10,U05876）进行氨基酸变异情况分析发现，290 条序列 VP1 区 297 个氨基酸编码位点中有 20个发生变异，见表 2。2016 年安徽省检出的 60 株CV-A16 B1a和B1b流行株VP1区有21个氨基酸编码位点发生变异，比表 2 中多了 1 个变异位点（VP1-A11T）；2018 年和 2019 年共检出的 147 株B1a和B1b CV-A16流行株，VP1区有21个氨基酸编码位点发生变异，比表 2 中多了 1 个变异位点（VP1-P215L）。本研究发现20162020年安徽省225株B1b CV-A16毒株中有181株VP1区第14个氨基酸编码位点出现变异（S14N），占80.44%（181/225）;205 株 VP1 区第 23 个氨基酸编码位点出现变异（L23M），占91.11%（205/225），在B1a CV-A16毒株中未见变异。3讨论HFMD的主要表现是患者手、足和口腔皮肤或黏膜皮损，前驱症状多为发烧、上呼吸道不适8。1981 年上海报告我国首例 HFMD 病例，此后至2007年HFMD在我国的流行表现为局部地区小规模暴发，重症和死亡病例少见；2007年后HFMD局部地区出现较大规模暴发，重症和死亡病例数呈升高趋势9。20082017 年安徽省共报告 HFMD 病例930 613例，其中重症病例4 738例，在全国排名第 11 位；死亡病例 147 例，在全国排名第 9 位5,10。注：2016年2017年2018年2019年2020年图220162020年安徽省CV-A16 VP1区基因进化树Figure 2Phylogenetic tree of VP1 gene sequences of CV-A16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020表220162020年安徽省CV-A16 VP1区氨基酸位点变异情况Table 2Amino acid site variation in VP1 region of CV-A16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020年份19512016201720182019202020162017201820192020基因（亚）型A/G-10B1aB1aB1aB1aB1aB1bB1bB1bB1bB1b序列数量144636156256584723GPPPPPPP/SPPP13TNNNNNNNNN/SN15RQQQQQQQQQQ17GNNNNNNNNNN19ASSSSSS/TSS/TSS22SAAAA/TA/TAA/TAAA26ELLLLLLLLLL33NEEEEEEEEEE36ESSSSSSSSSS43LVVVVVV/IV/IV/IV/IV59QSSSSSS/RSSSS61EKKKKKKKKK/RK79TAAAAAAAAAA119MLLLLLLLLLL139AVVVVVVVVVV179IVVVVVVVVVV183LMMMMMMMMMM213AEEEEEEEEEE217SAAAAAAAAAA220ALLLLLLLLLL 202热带病与寄生虫学2023年8月第21卷第4期J Trop Dis Parasitol,Aug.2023,Vol.21,No.4有研究表明，20172018年安徽省HFMD CV-A6实验室确诊病例数较以往有升高趋势，且病原谱发生变化，可能与EV-A71灭活疫苗的接种数量有关11。既往研究表明，19992008年我国流行的CV-A16毒株都属于B1a和B1b基因亚型，在2008年之后出现B1c基因亚型，但B1b基因亚型始终处于优势地位12-14。B1a分支毒株最早于1995年在日本被发现，随后在我国、马来西亚和泰国成为 CV-A16主要流行株15。近年来，CV-A16 B1基因亚型成为我国主要流行株，也是安徽省的优势流行株，以CV-A16 B1b 分支为优势基因型，B1a 分支与其共同流行及进化循环7,16。本研究结果显示，20162020年安徽省B1b基因亚型分支成为优势流行株，这与安徽省先前有关 CV-A16 毒株分子遗传进化分析的情况基本一致7,16。对 20162020 年安徽省 CV-A16 流行株序列基因型别的占比进行分析发现，20162018年CV-A16 B1b基因亚型占比均超过90%；而2019年CV-A16 B1a 基因亚型毒株所占比例与同年 CV-A16B1b比例接近；2020年CV-A16 B1a基因亚型毒株所占比例明显高于CV-A16 B1b，占比近90%。这可能提示安徽省 HFMD CV-A16 流行株基因亚型有改变的趋势，待后续的监测数据证实。从进化树聚类结果看，安徽省CV-A16 B1a Cluster D分支簇流行株与部分周边城市亲缘关系较近，提示安徽省HFMD CV-A16 B1a流行株在演变过程中可能与周边区域流行株共同循环和进化。此外，安徽省290株CV-A16毒株VP1区氨基酸序列变异分析发现，5 年中 290 株 CV-A16 序列中有 288 株病毒在 VP1区13位上由苏氨酸替换为天冬酰胺，但2019年的2 株 B1b 基 因 亚 型 毒 株（19BB002-2019013b、19BB004-2019015b）在 13 位上由苏氨酸替换为丝氨酸，是否提示安徽省 CV-A16 B1b 基因亚型在循环进化中演变成新的分支有待后续研究证实。本研究证实了HFMD CV-A16肠道病毒B1a和B1b两种基因亚型在安徽省共同存在，且B1毒株流行的优势基因型别发生了变化，为完善安徽省手足口病病原谱分子进化资料以及疾病防控提供了科学参考。但本研究收集到的手足口病患儿咽拭子样本均来自轻症病例，无重症病例标本，且2020年受新冠病毒感染疫情影响收集到的标本数量较少，可能会导致本研究结果存在一定局限性。利益冲突声明全部作者声明无利益冲突作者贡献声明冯明子负责样本收集与整理、实验室检测、论文撰写；傅荔艳、葛盈露、王鹏参与实验室检测；马婉婉负责数据整理和分析；孙永、史永林负责研究设计、论文撰写指导参考文献1Zhang C，Liu CX，Shi JP，et al.Molecular mechanism of anti-body neutralization of coxsackievirus A16 J.Nat Commun，2022，13（1）：7854.2Zhang Y，Wang DY，Yan DM，et al.Molecular evidence of per-sistent epidemic and evolution of subgenotype B1 coxsackievi-rus 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