ART调节PI3K_AKT通路对肝癌细胞增殖及迁移的影响.pdf

Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.15海南医学2023年8月第34卷第15期ART调节PI3K/AKT通路对肝癌细胞增殖及迁移的影响张雄，周江，李涛，郝琪伟，李胜，杨刚，李腾，李建雄，乔培宇，张鑫榆林市第二医院普通外科二病区，陕西榆林719000【摘要】目的探究青蒿琥酯(artesunate，ART)调节磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对肝癌细胞增殖及迁移的影响。方法体外培养HepG2细胞，分为对照组以及不同浓度(30 g/mL、60 g/mL和120 g/mL)ART组。比较不同组别HepG2细胞的细胞增殖率、细胞迁移数量、侵袭数量以及Ki-67蛋白、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9和PI3K/AKT通路相关蛋白磷脂酞肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化的磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化的蛋白酶B(p-AKT)的表达水平。结果不同浓度ART作用于HepG2细胞后，30 g/mL组、60 g/mL组和120 g/mL组的细胞增殖率分别为(81.738.39)%、(65.266.48)%、(44.274.66)%，Ki-67蛋白表达分别为0.760.11、0.430.09、0.290.04，分别与对照组的(100.0010.51)%、0.980.16比较均明显降低，且ART浓度越高，细胞增殖率和Ki-67蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)；不同浓度ART作用于HepG2细胞后，30 g/mL 组、60 g/mL 组和 120 g/mL 组的细胞凋亡率分别为(24.844.91)%、(36.027.35)%、(50.2710.02)%，Bax蛋白表达分别为0.260.05、0.390.06、0.580.08，Bcl-2蛋白表达分别为0.620.07、0.480.06、0.330.04，Caspase-3蛋白表达分别为10.260.68、12.470.77、14.960.81，分别与对照组的(5.751.63)%、0.170.03、0.830.09、8.730.46比较，细胞凋亡率、Bax 和 Caspase-3 蛋白表达明显升高，Bcl-2 表达明显降低，且 ART 浓度越高，细胞凋亡率、Bax 和 Caspase-3 蛋白表达越高，Bcl-2 表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)；不同浓度ART 作用于HepG2细胞后，30 g/mL 组、60 g/mL 组和120 g/mL组的细胞迁移数量分别为(189.1116.73)个、(162.2915.03)个、(134.2613.26)个，细胞侵袭数量分别为(144.1313.46)个、(121.6110.23)个、(90.268.71)个，MMP2蛋白表达分别为0.460.08、0.380.06、0.290.05，MMP9蛋白表达分别为0.410.09、0.330.06、0.240.03，分别与对照组的(234.2820.64)个、(187.5516.31)个、0.830.19、0.740.16比较均明显降低，且ART浓度越高，细胞迁移数量、侵袭数量和MMP2、MMP9蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)；不同浓度ART作用于HepG2细胞后，30 g/mL组、60 g/mL组和120 g/mL组的PI3K蛋白表达分别为0.510.13、0.360.09、0.190.05，p-P13K蛋白表达分别为0.540.12、0.410.08、0.220.03，p-AKT蛋白表达分别为0.560.11、0.380.09、0.210.04，分别与对照组的0.850.17、0.790.16、0.750.19比较均明显降低，且ART浓度越高，PI3K、p-P13K和p-AKT蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)。结论ART在肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭过程中能够发挥一定的抑制作用，同时可诱导HepG2细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活性有关。【关键词】青蒿琥酯；磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路；肝癌细胞；细胞增殖；细胞迁移【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】10036350（2023）15212906Effect of artesunate regulating ARTPI3K/Akt pathway on proliferation and migration of hepatocellularcarcinoma cells.ZHANG Xiong,ZHOU Jiang,LI Tao,HAO Qi-wei,LI Sheng,YANG Gang,LI Teng,LI Jian-xiong,QIAOPei-yu,ZHANG Xin.Ward,Department of General Surgery,Yulin Second Hospital,Yulin 719000,Shaanxi,CHINA【Abstract】ObjectiveTo research the effect of artesunate(ART)regulating phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)signaling pathway on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro and divided into control group and ART group with different concentra-tions(30 g/mL,60 g/mL,and 120 g/mL).The cell proliferation rate,cell migration number,invasion number ofHepG2 cells,and Ki-67 protein,apoptosis-related proteins(Bax,Bcl-2,Caspase-3),matrix metalloproteinase-2(MMP-2),MMP9,and PI3K/AKT pathway-related proteins phosphoinositide 3-kinase(PI3K),phosphoinositide 3-ki-nase(p-PI3K),and phosphoprotease B were compared among the four groups.ResultsAfter different concentrationsof ART were applied to HepG2 cells,the cell proliferation rates of 30 g/mL group,60 g/mL group,and 120 g/mLgroup were(81.738.39)%,(65.266.48)%,and(44.274.66)%,respectively,and the expression levels of Ki-67 proteinwere 0.760.11,0.430.09,and 0.290.04,respectively,which were all significantly lower than(100.0010.51)%and0.980.16 in the control group;the higher the concentration of ART,the lower the cell proliferation rate and Ki-67 pro-tein expression;the differences were statistically significant(P0.05).After different concentrations of ART were ap-plied to HepG2 cells,the apoptosis rates of 30 g/mL group,60 g/mL group,and 120 g/mL group were(24.844.91)%,(36.027.35)%,and(50.2710.02)%,respectively,and the expression levels of Bax protein were 0.260.05,0.390.06,0.580.08,Bcl-2 protein were 0.620.07,0.480.06,and 0.330.04,and Caspase-3 protein were 10.260.68,12.470.77,and 14.960.81,respectively,versus(5.751.63)%,0.170.03,0.830.09,and 8.730.46 in the con-论著 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2023.15.001基金项目：陕西省榆林市科协青年人才托举计划项目(编号：20190107)。第一作者：张雄(1980)，男，硕士，副主任医师，主要研究方向为肝胆胰、胃肠外科疾病的诊治。通讯作者：张鑫(1989)，男，主治医师，主要研究方向为肝胆胰、胃肠外科疾病的诊治，E-mail：。2129海南医学2023年8月第34卷第15期Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.15肝癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，起病较为隐匿，发病初期无明显症状，多数患者在确诊时已达到中、晚期或发生远端转移，预后较差1-2。寻找高效低毒的抗肝癌药物对于肝癌患者的临床治疗及预后具有重要意义。青蒿琥酯(artesunate，ART)是青蒿素的衍生物，具有特异的抗疟效果，在治疗重症以及耐药性疟疾上效果显著3。相关研究发现，ART除了具有特异的抗疟作用以外，还具有调节免疫力、抗肿瘤等其他生物学特性4。目前，有较多文献报道，ART对于多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，其作用机制与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期有关5。磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路在肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤进展中发挥关键作用，主要参与了肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等过程6。本研究探讨了ART对PI3K/AKT信号通路以及对肝癌细胞增殖及迁移的影响，现报道如下：1材料与方法1.1主要试剂及仪器本研究的主要试剂和仪器见表1。trol group;compared with the control group,the apoptosis rates,Bax,and Caspase-3 protein expression in 30 g/mLgroup,60 g/mL group,and 120 g/mL group were significantly increased,while Bcl-2 expression was significantly de-creased;the higher the concentration of ART,the higher the apoptosis rate,Bax,and Caspase-3 protein expression andthe lower the Bcl-2 expression;the differences were statistically significant(P0.05).After different concentrations ofART were applied to HepG2 cells,the numbers of cell migration in 30 g/mL group,60 g/mL group,and 120 g/mLgroup were 189.1116.73,162.2915.03,and 134.2613.26,respectively,the numbers of cell invasion were 144.1313.46,121.6110.23,and 90.268.71,respectively,the expression levels of MMP2-2 protein were 0.460.08,0.380.06,and 0.290.05,respectively,and the expression levels of MMP9 protein were 0.410.09,0.330.06,and 0.240.03respectively,which were all significantly lower than 234.2820.64,187.5516.31,0.830.19,and 0.740.16 in the controlgroup,respectively;the higher the concentration of ART,the lower the number of cell migration and invasion,the expres-sion of MMP-2 and MMP9 proteins;the differences were statistically significant(P0.05).After different concentrationsof ART were applied to HepG2 cells,the expression of PI3K protein in 30 g/mL group,60 g/mL group,and 120 g/mLgroup were 0.510.13,0.360.09,and 0.190.05,respectively,the expression levels of p-P13K protein were 0.540.12,0.410.08,and 0.220.03,respectively,and the levels of p-AKT protein were 0.560.11,0.380.09,and 0.210.04,re-spectively,which were all significantly lower as compared with 0.850.17,0.790.16,and 0.750.19 in the controlgroup;the higher the concentration of ART,the lower the expression of PI3K,p-P13K,and p-AKT;the differences werestatistically significant(P0.05).ConclusionART can inhibit the proliferation,migration,and invasion of HepG2cells,and induce apoptosis of HepG2 cells,which may be related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.【Key words】Artesunate;Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)signaling pathway;Hepa-tocellular carcinoma cells;Cell proliferation;Cell migration表1主要试剂及仪器明细Table 1Details of main reagents and instruments编号12345678910111213141516171819202122232425试剂及仪器人肝癌细胞株HepG2青蒿琥酯(ART)达氏修正依氏培养基(DMEM)/F12基础培养基0.25%胰蛋白酶(Hyclone)胎牛血清(FBS)STER1-CYCLE二氧化碳恒温培养箱细胞计数试剂盒-8(CCK-8)Epoch酶标仪Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒迁移实验(Transwell)小室细胞周期检测试剂盒FC500型流式细胞仪RIPA裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒兔抗人Ki-67抗体基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9抗体磷脂酞肌醇3-激酶(PI3K)抗体磷酸化的磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)抗体磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗体-肌动蛋白(-actin)抗体鼠抗人Bax单克隆抗体鼠抗人Bcl-2单克隆抗体兔抗人Caspase-3单克隆抗体辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗Image Quant 800凝胶成像仪生产厂家美国ATCC细胞库广西桂林制药厂美国Gibco公司美国Gibco公司美国Gibco公司美国Thermo公司上海碧云天生物技术有限公司美国Agilent公司上海碧云天生物技术有限公司美国Corning公司；南京凯基生物科技发展有限公司美国Beckman Coulter公司上海康郎生物科技有限公司武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司北京中杉金桥生物试剂公司北京中杉金桥生物试剂公司北京中杉金桥生物试剂公司北京中杉金桥生物试剂公司北京中杉金桥生物试剂公司北京中杉金桥生物试剂公司美国Abcan公司美国Abcan公司美国Abcan公司北京凯瑞基生物科技有限公司英国Amersham 公司2130Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.15海南医学2023年8月第34卷第15期1.2方法1.2.1HepG2细胞培养在10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中接种HepG2细胞后放置在二氧化碳恒温培养箱中(二氧化碳含量为5%，温度37，湿度97%)培养。随后每隔1 d更换液体，当细胞生长融合时，按照12传代培养。采用含0.05%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化，收集对数生长期细胞进行后续实验。青蒿琥酯采用二甲基亚砜(DMSO)溶解，加水稀释到10 mg/mL作为储存液，避光储存到-20的冰箱中，实验时采用DMEM/F12培养基稀释到目标浓度。1.2.2分组方法将 HepG2细胞培养至对数生长期，采用0.25%胰蛋白酶消化后，离心去上清液。采用10%FBS的DMEM/F12培养基配置细胞悬液，细胞浓度调整至2.5104个/mL，每孔加入 200 L 接种至96孔板中放置在培养箱中过夜培养(二氧化碳含量为 5%，温度37，湿度97%)，分别加入200 L 含有30 g/mL、60 g/mL和120 g/mL的ART，每种浓度各加20孔，分别作为30 g/mL组、60 g/mL组、120 g/mL组，另取20孔加入等量的培养液作为对照组。1.2.3CCK-8检测细胞增殖将四组细胞放入培养箱中，培养24 h后弃去培养基，加入90 L细胞培养液和10 L CCK-8试剂，放置在恒温培养箱中孵育2 h后，采用酶标仪450 nm处的光密度(OD)值，计算各组的HepG2细胞增殖率，增殖率=(处理组OD值/对照组OD值)100%。实验重复三次，取平均值作为最终结果。1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡选取对数生长期的肝癌HepG2细胞，采用10%FBS的DMEM/F12培养基配置细胞悬液，细胞浓度调整至2.5104个/mL，每孔1.0 mL接种于96孔板中，培养24 h后吸去培养液，加入200 L含有30 g/mL、60 g/mL和120 g/mL的ART，每种浓度各加20孔，另取20孔加入等量的培养液作为对照组，将四组细胞放入培养箱中培养 48 h后，采用0.25%胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，采用PBS清洗两次，300目尼龙网滤除细胞团块后，调整细胞浓度1106个/mL，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，加入10 LAnnexin V-FITC，避光孵育10 min后再加入5 L PI，避光孵育10 min后，采用流式细胞仪检测各组HepG2细胞的凋亡率。实验重复三次，取平均值作为最终结果。1.2.5Transwell法检测细胞迁移和侵袭选取对数生长期的肝癌 HepG2 细胞，采用 10%FBS 的DMEM/F12 培养基配置细胞悬液，细胞浓度调整至2.5104个/mL。迁移实验：上、下室分别加入100 L细胞悬液、500 L含FBS的培养基。细胞悬液分别加入200 L含有30 g/mL、60 g/mL和120 g/mL的ART以及等量的培养液进行培养，培养 24 h后弃去培养基。取出小室后采用4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，倒置显微镜进行观察，随机选取20个视野，拍照并计数。侵袭实验：Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后加入100 L细胞悬液，其余步骤同迁移实验。1.2.6Western blot法检测细胞中相关蛋白的表达各组细胞培养72 h后弃去培养基，收集细胞，PBS洗涤2次后去除液体，加入RIPA裂解液后4环境下裂解细胞30 min；提取各组细胞蛋白，BCA法测得领蛋白含量后进行定量，之后将蛋白质溶液与等量上样缓冲液混合，10%SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上，在脱脂奶粉溶液中(稀释比例为5%，温度37)封闭放置3 h；分别加入一抗后放置在4下孵育过夜，TBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37下孵育1 h，TBS漂洗3次；滴加化学放光液后在室温环境下孵育3 min，去除化学放光液后将NC膜放入凝胶成像系统进行成像，检测各蛋白条带的积分光密度(IOD)值，重复三次取平均值作为最终结果。1.3统计学方法应用SPSS18.0统计软件对本研究中各项数据资料进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数标准差(x-s)表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。以P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度ART对肝癌HepG2细胞增殖的影响与对照组比较，不同浓度ART作用于HepG2细胞后，细胞增殖率和Ki-67蛋白表达均明显降低，ART浓度越高，细胞增殖率和Ki-67蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)，见表2和图1。表2各组肝癌HepG2细胞的增殖率及Ki-67蛋白表达水平比较(x-s)Table 2Comparison of proliferation rate and Ki-67 protein expressionof HepG2 cells among the four groups(x-s)组别对照组30 g/mL组60 g/mL组120 g/mL组F值P值例数20202020细胞增殖率(%)100.0010.5181.738.39a65.266.48a44.274.66a184.320.001Ki-670.980.160.760.11a0.430.09a0.290.04a165.460.001注：与对照组比较，aP0.05。Note:Compared with that in the control group,aP0.05.图1Western Blot 检测不同浓度ART对Ki-67蛋白表达Figure 1Expression of Ki-67 protein in the four groups by westernblot2131海南医学2023年8月第34卷第15期Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.152.2不同浓度ART对肝癌HepG2细胞凋亡的影响与对照组比较，不同浓度ART作用于HepG2细胞后，细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达明显升高，Bcl-2表达明显降低；ART浓度越高，细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达越高，Bcl-2表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)，见表3和图2。2.3不同浓度ART对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭的影响与对照组比较，不同浓度 ART 作用于HepG2 细胞后，细胞迁移数量、侵袭数量和 MMP2、MMP9蛋白表达明显降低；ART浓度越高，细胞迁移数量、侵袭数量和MMP2、MMP9蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)，见表4和图3。图2Western Blot 检测不同浓度ART对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达Figure 2Expression of Bax,Bcl-2,and Caspase-3 proteins in the four groups by western blot表4各组肝癌HepG2细胞的细胞迁移、侵袭数量以及MMP2、MMP9 蛋白表达(x-s)Table 4Cell migration,invasion number,and MMP2,MMP9 protein expression of HepG2 cells in the four groups(x-s)组别对照组30 g/mL组60 g/mL组120 g/mL组F值P值例数20202020细胞迁移数量(个)234.2820.64189.1116.73a162.2915.03a134.2613.26a130.850.001细胞侵袭数量(个)187.5516.31144.1313.46a121.6110.23a90.268.71a213.380.001MMP20.830.190.460.08a0.380.06a0.290.05a92.510.001MMP90.740.160.410.09a0.330.06a0.240.03a99.550.001注：与对照组比较，aP0.05。Note:Compared with that in the control group,aP0.05.2.4各组细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平比较与对照组比较，不同浓度 ART 作用于HepG2 细胞后，PI3K、p-P13K 和 p-AKT 蛋白表达明显降低；ART浓度越高，PI3K、p-P13K和p-AKT蛋白表达越低，差异均有统计学意义(P0.05)，见表 5 和图4。图3Western Blot 检测不同浓度ART对MMP2、MMP9蛋白表达Figure 3Expression of MMP2 and MMP9 protein in the four groups by western blot表3各组肝癌HepG2细胞的凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较(x-s)Table 3Comparison of apoptosis rate and expression of Bax,Bcl-2,and Caspase-3 proteins in HepG2 cells among the fourgroups(x-s)组别对照组30 g/mL组60 g/mL组120 g/mL组F值P值例数20202020细胞凋亡率(%)5.751.6324.844.91a36.027.35a50.2710.02a155.910.001Bax0.170.030.260.05a0.390.06a0.580.08a189.050.001Bcl-20.830.090.620.07a0.480.06a0.330.04a198.830.001Caspase-38.730.4610.260.68a12.470.77a14.960.81a306.170.001注：与对照组比较，aP0.05。Note:Compared with that in the control group,aP0.05.2132Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.15海南医学2023年8月第34卷第15期3讨论手术切除和肝移植是目前治疗肝癌的最佳方案，但介于多数患者在确诊时已处于中晚期，手术切除和肝移植并不适用；而介入治疗操作难度较大，极易造成误栓、分流、微转移等情况发生；放疗、化疗对正常肝脏细胞损伤较大，且化疗常因肿瘤耐药性而导致疗效效果欠佳7。因此，寻求安全有效的肝癌治疗方法对于其临床治疗及预后具有重要意义。中草药在治疗肿瘤上具有低毒副作用、价格低廉等特点。大量研究结果发现，多种中草药对于肿瘤生长具有抑制作用8-9。ART是治疗疟疾的经典药物，在治疗重症疟疾以及耐药性疟疾上具有较好的治疗效果。进一步研究结果显示，ART除了具有较好的抗疟作用以外，还具有较好的抗肿瘤活性10-11，对多种肿瘤的生长具有明显抑制作用。尤杨等12研究表明，ART具有抑制肺腺癌A549细胞生长的作用，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡、调控肿瘤细胞周期有关。肿瘤细胞的异常增殖和凋亡受阻是肿瘤发生的最重要机制，其中细胞凋亡在维持机体正常生命活动中发挥关键作用，而肿瘤细胞的凋亡受阻是肿瘤的发生、发展的重要因素之一13。通过药物诱导肿瘤细胞凋亡是控制肿瘤发展的关键，也是临床治疗肿瘤的新的途径。Ki-67在细胞有丝分裂中发挥重要作用，是细胞增殖的标志性蛋白，能够较好反映细胞的增殖活性14。Bcl-2蛋白存在于线粒体膜，可通过调控细胞线粒体膜电位而抑制细胞凋亡15。Bax能够与Bcl-2蛋白与形成二聚体：Bax相对量高于Bcl-2时，Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞凋亡；Bcl-2相对量高于Bax时，Bcl-2同二聚体增加而抑制细胞凋亡16。Caspase-3蛋白在细胞凋亡的启动和执行过程中发挥作用，是细胞凋亡最重要的调控蛋白，其表达反映了Caspases家族蛋白对细胞凋亡的调控作用17。本研究结果显示，ART 能够显著降低 HepG2 细胞中Ki-67蛋白、Bcl-2蛋白表达以及细胞增殖率，同时能够有效促进Bax、Caspase-3蛋白表达及HepG2细胞凋亡。ART能够在一定程度上抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，且呈剂量依赖性。肿瘤细胞迁移和侵袭对于降低肿瘤复发和转移具有重要意义。本研究结果表明，ART能够有效降低HepG2细胞的迁移、侵袭以及细胞中MMP2、MMP9蛋白表达，ART可抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。PI3K/AKT信号通路是恶性肿瘤增殖和转移的重要分子机制之一18。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，可通过特异性催化使磷酸肌醇-3-位羟基发生磷酸化，产生肌醇脂物质而进一步激活或募集通路下游靶蛋白产生一系列信号级联反应19。AKT是PI3K的下游效应基因，被激活后能够促进磷酸化发生，进而激活或抑制PI3K/AKT信号通路的下游靶蛋白，从而对肿瘤细胞的增殖或凋亡进行调控20。本研究结果显示，不同浓度的 ART 作用于 HepG2 细胞后，PI3K、p-P13K和p-AKT蛋白表达明显降低。ART浓度越高，PI3K、p-P13K和p-AKT蛋白表达越低。ART可通过下调PI3K/AKT信号通路活性而抑制细胞生长。本研究存在一定局限性，首先只是从细胞水平上验证了ART对肝癌HepG2细胞具有生长抑制作用，缺乏临床样本验证其临床实用性；其次，本研究对于ART抑制肝癌HepG2细胞的具体机制缺乏深入研究，值得后续进行进一步研究。表5各组细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平比较(x-s)Table 5Comparison of expression levels of PI3K/AKT pathway-relatedproteins in cells among the four groups(x-s)组别对照组30 g/mL组60 g/mL组120 g/mL组F值P值例数20202020PI3K0.850.170.510.13a0.360.09a0.190.05a111.710.001p-P13K0.790.160.540.12a0.410.08a0.220.03a96.860.001p-AKT0.750.190.560.11a0.380.09a0.210.04a74.660.001注：与对照组比较，aP0.05。Note:Compared with that in the control group,aP0.05.图4Western Blot 检测不同浓度ART对PI3K、p-P13K、p-AKT蛋白表达Figure 4Expression of PI3K,p-P13K,and p-AKT proteins in the four groups by western blot2133海南医学2023年8月第34卷第15期Hainan Med J,Aug.2023,Vol.34,No.15综上所述，ART对肝癌HepG2细胞具有生长抑制作用，且呈剂量依赖性，其作用机制与调控细胞周期和诱导细胞凋亡有关。ART 能够通过调控细胞内Ki-67、Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP2、MMP9 等多种蛋白的表达以及PI3K/AKT信号通路活性，抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。参考文献1Wang HG,Li D,Wang SY,et al.Inhibitory effect and mechanism ofartesunate on the proliferation of hepatoma cells J.Journal ofShenyang Pharmaceutical University,2020,37(4):321-327,343.王惠国,李丹,王嗣瑶,等.青蒿琥酯对肝癌细胞增殖的抑制作用和机制J.沈阳药科大学学报,2020,37(4):321-327,343.2Liu L,Liu JH,Chen LT,et al.Inhibitory effect of artesunate on thegrowth of hepatocellular carcinoma cells and its mechanism J.MedJ Chin PLA,2018,43(7):594-599.刘亮,刘江惠,陈乐彤,等.青蒿琥酯对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制J.解放军医学杂志,2018,43(7):594-599.3 Zhang YY,Liang ZQ,Bai JH.Research progress of artesunate on me-tabolism-related fatty liver diseases J.Journal of Guangxi 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