Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究.pdf

畜牧与饲料科学秦海霞,韩菲，戴研平，等.Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究 J.畜牧与饲料科学,2 0 2 3,44(4):17-21.D01I:10.12160/j.issn.1672-5190.2023.04.003Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究Animal Husbandry and Feed Science2023,44(4):17-21秦海霞,韩菲1,戴研平,刘改萍1（1.乌兰察布医学高等专科学校组胚教研室，内蒙古乌兰察布0 12 0 0 0;2.岳阳职业技术学院临床医学院，湖南岳阳414000)摘要：目的 探讨亚慢性砷染毒对大鼠睾丸间质细胞Caspase-9蛋白表达的影响。方法 将40 只健康成年清洁级SD雄性大鼠随机分为4组，分别为对照组以及低、中、高剂量染毒组，每组10 只。采用自由饮水方式进行染毒，低、中、高剂量染毒组亚砷酸钠的染毒剂量分别为2.4、12、6 0 mg/L,对照组给予生理盐水,染毒试验持续14周。染毒试验结束后，检测大鼠外周血白细胞数量；采用ELISA法检测大鼠血清TNF-及IL-1的浓度；利用透射电镜观察大鼠精子的超微结构；应用免疫组化法检测大鼠睾丸间质细胞Caspase-9蛋白的表达定位及表达水平。结果 与对照组相比，中、高剂量染毒组大鼠血清中TNF-、I L-1浓度及白细胞计数均显著(P0.05)升高。透射电镜下,对照组精子顶体结构完整,厚度及染色均匀；低剂量染毒组可见精子胞膜肿胀，核染色质较均匀；中剂量染毒组精子顶体与核分离，胞膜肿胀；高剂量染毒组精子尾部中断，轴丝排列紊乱。免疫组化法分析表明,Caspase-9蛋白主要表达于睾丸间质细胞的细胞质，表达信号呈棕褐色；与对照组相比，各剂量染毒组大鼠睾丸组织内Caspase-9蛋白的表达水平均显著(P0.05)升高。结论 睾丸间质细胞Caspase-9蛋白表达水平升高可能是亚砷酸钠致雄性大鼠慢性生殖毒性的机制之一。关键词：亚慢性砷中毒；睾丸间质细胞；超微结构；Caspase-9蛋白；大鼠中图分类号：S859.87;R114Expression of Caspase-9 Protein in Leydig Cells of Rats with Sub-chronic ArsenicPoisoningQIN Haixia,HAN Fei,DAI Yanping*,LIU Gaiping(1.Department of Histology and Embryology,Ulanqab Medical College,Ulanqab 012000,China;2.Department of ClinicalMedicine,Yueyang Vocational and Technical College,Yueyang414000,China)Abstract:Objective This study was conducted to investigate the effects of sub-chronic arsenic poisoning on the expression ofCaspase-9 protein in leydig cells of rats.Method A total of 40 healthy adult clean-grade male SD rats were randomly assignedinto the following 4 groups:a control group and the low-,medium-,and high-dose arsenic exposure groups,with 10 rats in eachgroup.The rats in the low-,medium-,and high-dose arsenic exposure groups were given sodium arsenate by drinking water atconcentrations of 2.4,12 and 60 mg/L,respectively,and those in the control group was given physiological saline.The exposuretest lasted for 14 weeks.Following the exposure test,the number of peripheral white blood cells of the rats was counted;the serumlevels of TNF-and IL-1 were measured by ELISA assay;the ultrastructure of sperm was observed using transmission electronmicroscopy;the expression level and localization of Caspase-9 protein in leydig cells were assessed by immunohistochemicalmethod.Result Compared with the control group,the serum levels of TNF-and IL-1 as well as the number of peripheral whiteblood cells in the medium-and high-dose arsenic exposure groups significantly(P0.05)increased.Under transmission electronmicroscopy,the sperm acrosome structure in the control group was intact,with uniform thickness and staining.In the low-dosearsenic exposure group,the sperm membrane swelled and the nuclear chromatin was uniform.In the medium-dose arsenicexposure group,the sperm acrosome and nucleus split,and the membrane swelled.In the high-dose arsenic exposure group,the收稿日期：2 0 2 3-0 5-2 4sperm tail disrupted and the axial filament arrangementdisordered.Immunohistochemical analysis showed that项目来源：内蒙古自治区高等学校科学研究项目“砷对大鼠睾Caspase-9 protein mainly expressed in the cytoplasm of丸组织水通道蛋白-7、Survivin影响的研究”leydig cells,and the expression signal was dark brown.(NJZY19335)。Compared with the control group,the expression level of作者简介：秦海霞（19 7 6 一），女，讲师，硕士，主要从事生殖Caspase-9 protein in the testicular tissue in all the arsenic学研究工作。通信作者：韩菲（19 8 7 一），女，副教授，硕士，主要从事生殖学研究工作。文献标志码：A文章顺序编号：16 7 2-519 0(2 0 2 3)0 4-0 0 17-0 5exposure groups significantly（P 0.0 5）in c r e a s e d.Conclusion The increased expression level of Caspase-918proteininlaydig cells may be one ofthemechanisms underlying chronicreproductivetoxicity induced by sodium arsenite inmalerats.Keywords:sub-chronic arsenic poisoning;leydig cell;ultrastructure;Caspase-9 protein;rat砷是一种生殖毒物，当达到一定浓度时，具有较强的雄性生殖毒性 1-2 。砷可损伤生精细胞,引起精子数量和质量的下降 3。在精子发生过程中，各级生精细胞都会发生调亡，它是机体清除过量或异常生精细胞的一种重要方式。越来越多的研究证实天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在细胞凋亡中起重要作用 4-6 。Caspase-9是线粒体介导的调亡途径中的关键启动子，在大鼠的Leydig细胞表达 7 。从线粒体释放的细胞色素C与Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1结合形成复合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9剪切并激活Caspase-3,进而促进细胞凋亡 8-。该研究通过建立亚慢性砷中毒大鼠模型，利用透射电镜观察附睾精子的超微结构，检测睾丸组织中Caspase-9蛋白的表达，探讨砷致生殖系统损害的机制，以期为进一步研究砷的生殖毒理学特征提供参考。1材料与方法1.1 试验材料1.1.1实验动物健康清洁级10 周龄雄性SD大鼠40 只，体重为16 0 2 2 0 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCK（黔)2 0 0 2-0 0 0 1。饲养环境温度为2 0 2 5，相对湿度为6 0%6 5%，正常光照。试验期间，实验动物可自由采食和饮水。1.1.2主要药物与试剂亚砷酸钠，分析纯，购自北京化工厂有限责任公司;Caspase-9免疫组化链霉亲和素-生物素复合物（SABC)法检测试剂盒，武汉博士德生物有限公司产品；睾酮酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒，美国CSB公司产品；醋酸铀，上海瑞诚化工有限公司产品Epon812环氧树脂，沈阳市强华试剂厂产品。1.1.3主要仪器设备9905014型轮转式切片机，购自上海Leica仪器有限公司；BSllo型电子天平，德国Sartorius公司产品EG1150型包埋机，德国Leica公司产品；JEE-5B型真空冷冻干燥机，北京永光明医疗仪器厂产品；HITCHE-1010型离子溅射仪，日本日立公司产品；S-3400N型扫描电镜，日本日立公司产品；CX21型普通光学显微镜，日本Olympus公司产品。畜牧与饲料科学1.2订试验方法1.2.1亚慢性砷染毒大鼠模型的建立根据笔者所在课题组的前期研究并结合相关文献 10-,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组，分别为对照组以及低、中、高剂量染毒组，每组10只。采用自由饮水方式进行染毒，低、中、高剂量染毒组染毒剂量分别为2.4、12、6 0 mg/L,连续染毒14周。对照组给予蒸馏水。每天观察大鼠的健康情况，每周测定并记录大鼠体重。1.2.2检测指标及方法1.2.2.1大鼠白细胞计数及血清TNF-a、I L-1浓度的检测试验结束时,用血常规管收集大鼠外周血,利用全自动动物血液分析仪进行白细胞计数；用采血EP管收集心脏血液,30 0 0 r/min离心8 min,取上清液，放入-2 0 冰箱待测，严格按ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，通过公式换算，得出TNF-及IL-1 的浓度值。1.2.2.2透射电镜观察附睾精子的超微结构观察指标：正常精子头部形态（顶体为双层膜性结构，双层顶体膜间为低电子密度，核染色质较均匀）；正常精子尾部形态（颈部和尾部结构完整，尾部自然弯曲，其中央纤维鞘呈平行排列，可见微管“9+2 结构）；精子顶体完整状况、颈部线粒体鞘肿胀情况。每组随机取4只大鼠，在附睾尾部用眼科剪剪出约5mm小口,交替挤压,将精子挤出,用PBS液洗涤3次并离心（2 0 0 0 r/min），每次10 min；取12滴精液标本，采用3%戊二醛固定3h;PBS洗3次，每次15min，1%钱酸固定2 h;PBS洗3次，每次15min;30%、50%、7 0%9 0%丙酮梯度脱水各1次，每次10 min，10 0%丙酮脱水3次，每次10min;环氧树脂浸透、包埋、聚合；超薄切片机切片；醋酸铀染色30 min;柠檬酸铅染色10 min;透射电镜观察精子超微结构并摄片。1.2.2.3免疫组化法检测睾丸组织中间质细胞Caspase-9蛋白表达情况染毒结束后，大鼠乙醚麻醉，股动脉放血处死,取左侧睾丸分成4份，迅速置于10%中性甲醛溶液（磷酸盐缓冲液调节pH值至7.4)中固定，备用。常规方法脱水，用石蜡包埋。取方位相同的标第44卷第4期本连续切片4张（厚度4m），采用免疫组化法检测Caspase-9蛋白的表达情况，严格按照试剂盒说明书操作。40 倍目镜下观察5个视野，采用Biomias图像分析软件测定阳性细胞的平均光密度值,数值越高表明Caspase-9蛋白的表达量越高。1.3数据处理采用SPSS26统计学软件进行数据分析。试验结果以“平均值标准差”的形式表示，先进行正态分布及方差齐性检验，然后进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。若方差齐时,组间两两比较用LSD检验,反之用 Games-Howell 检验；检验组别对照组低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组注：同列数据相比，肩标“*”表示与对照组相比差异显著（P0.05），下表同。秦海霞等：Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究2.2精子透射电镜检查结果由图1可知，对照组大鼠精子顶体结构完整，表1大鼠血清TNF-、I L-1浓度及白细胞计数检测结果TNF-浓度/(ng/L)67.703.5368.673.0173.153.92*73.963.08*19水准=0.05,以P0.05为差异具有统计学意义。2结果与分析2.1大鼠白细胞计数及血清TNF-、I L-1浓度检测结果由表1可知,随着亚砷酸钠染毒浓度的升高，大鼠血清中TNF-、I L-1浓度及白细胞计数均呈上升趋势。与对照组相比，中、高剂量染毒组大鼠血清中TNF-、I L-1浓度及白细胞计数均显著升高(F=6.31,P=0;F=7.22,P=0;F=5.07,P=0)。IL-1 浓度/(pg/mL)63.583.6765.402.6468.312.96*69.052.62*白细胞计数/(10%/L)6.621.598.562.599.762.20*10.893.51*ABCA一对照组，箭头指示正常精子顶体结构完整，三角形指示胞核染色质均匀;B一低剂量染毒组，箭头指示胞膜肿胀；C一中剂量染毒组，箭头指示顶体与核分离；D一高剂量染毒组，箭头指示尾部中断，轴丝排列紊乱。图1亚慢性砷染毒大鼠精子形态的透射电镜图（150 0 0）D20厚度及染色均匀，顶体为双层膜性结构，平行贴于核表面，双层顶体膜间为低电子密度，胞核染色质均匀；低剂量染毒组与对照组相比，精子结构无明显变化，顶体胞膜肿胀，核染色质较均匀；中剂量染毒组精子顶体与核分离，胞膜肿胀；高剂量染毒组精子尾部中断，轴丝排列紊乱。2.3大鼠睾丸间质细胞中Caspase-9蛋白表达检测结果光镜下，各组大鼠睾丸组织中均可见Cas-pase-9蛋白表达阳性信号，定位于睾丸间质细胞的细胞质中,呈棕黄色或棕褐色。对照组,阳性细胞染色浅；低剂量染毒组，阳性细胞较对照组染色深；中剂量染毒组，阳性细胞较对照组、低剂量染毒组染色深；高剂量染毒组阳性细胞染色深（见图2)。由表2 可知,与对照组相比,各剂量染毒组阳性细胞平均光密度值均显著升高(F=8.50,P0.05)。3讨论机体的生殖发育过程对外源化学物的作用比较敏感。外源化学物质可干扰机体生殖发育多个畜牧与饲料科学组别对照组低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组环节,并造成损伤作用,对生殖过程的影响范围广泛且深远 12-13 动物实验证实，睾丸巨噬细胞和生精细胞都能分泌大量的TNF，其中,TNF-参与影响FSH对支持细胞生精功能的调节 14。TNF-可增加IL-1对睾酮分泌的抑制作用,降低 Leydig细胞对促性腺激素的反应敏感性。IL-1能改变血睾屏障的固有防御功能，增加细菌或氧自由基等有害物质进出睾丸的机会 15。该研究结果表明，随着染砷浓度的增加,大鼠血清中TNF-a、I L-1浓度以及外周血白细胞计数也增加,中、高剂量染毒组3项指标与对照组相比差异显著，推测可能长期砷暴露第44卷表2 大鼠睾丸间质细胞Caspase-9阳性细胞平均光密度检测结果Caspase-9平均光密度值0.188 90.011 600.194 7 0.002 63*0.206 70.008 21*0.211 80.004 08*ABCA一对照组;B一低剂量染毒组；C一中剂量染毒组；D一高剂量染毒组。黑色箭头指示阳性表达信号。图2 免疫组化法检测大鼠睾丸间质细胞中Caspase-9蛋白表达情况(40 0)D第4期导致了睾丸的炎症反应。电子显微镜是目前观察精子形态的最有效工具，其分辨率超高 16 。精子分为头部和尾部，头部有一个高度浓缩的细胞核,核的前2/3有顶体。顶体是一种特殊的溶酶体,内含多种水解酶,如顶体酶、透明质酸酶等，在受精过程中发挥重要作用。该研究中，透射电镜观察下可见中、高剂量染毒组大鼠精子胞膜受损，顶体与核分离，核内出现空泡，进一步证实亚砷酸钠可使精子顶体超微结构改变，胞膜受损，主要表现为顶体内外膜分离，顶体内容物丢失或顶体膜上结合的透明质酸酶等活性降低 17-18 生精细胞的调亡可以有效清除不正常的生精细胞，并严格控制生精细胞和支持细胞的适当比例，以保证精子的数量和质量 19 ,维持精子发生与调亡的动态平衡，保证遗传稳定性。但是，如果生精细胞的凋亡程序发生紊乱，则可能造成雄性不育。Caspase-9是与线粒体调亡途径直接相关的功能蛋白,目前认为Caspase-9是启动酶 2 0 ,无机砷通过ROS积累的间接作用或巯基氧化性的直接作用，诱导线粒体的基质浓缩和渗透通道开放，从而诱发线粒体损伤并引发调亡，使生精细胞调亡增加，影响精子的发育，产生生殖毒性。该研究结果显示,Caspase-9阳性细胞表达在睾丸间质细胞的细胞质,随着染砷剂量的增加,Caspase-9蛋白的表达量增加。砷对睾丸生殖毒性可能的机制是其直接通过对线粒体的损伤，激活Caspase-9蛋白，引起Caspase的级联反应，使间质细胞调亡增加。4结论睾丸间质细胞Caspase-9蛋白表达水平升高可能是亚砷酸钠致雄性大鼠慢性生殖毒性的机制之一。参考文献：1 JALALUDEEN A M,RANL,LEE W Y,et al.Ameliorating effect of selenium against arsenic inducedmale reproductive toxicity in rats JJ.Reproductive andDevelopmental Biology,2014,38(3):107-114.2王平,戴研平,杨薇，等.不育患者凋亡生精细胞与ACP超微结构的关系 J.检验医学，2 0 18,33（6)：47 2-47 5.3王随心，张玉华，李向阳，等.重金属生精细胞毒性研究进展 J.环境与健康杂志，2 0 11,2 8(4):36 7-37 2.4秦海霞,高晓勤,刘智，等.亚慢性砷中毒对大鼠睾丸间质细胞caspase-3表达及血清中睾酮含量的影响J.中华地方病学杂志，2 0 16(1)：14-17.秦海霞等：Caspase-9蛋白在亚慢性砷染毒大鼠睾丸间质细胞中的表达研究究杂志,2 0 0 9,38(12)：12 3-12 5.6马惠芳，任秀君，图娅，等.针刺对高血脂合并脑缺血大鼠海马区Caspase-9蛋白表达及神经行为学的影响 J.针刺研究,2 0 0 8,33(6)：38 2-38 6.7赵茹，华亚军，万俊.杜仲水提液对幼鼠睾丸间质细胞睾酮合成和caspase-9的影响 J.儿科药学杂志，2012,18(6):11-14.8郭泳梅，姚红，童娟.慢性阻塞性肺疾病膈肌形态学改变的机制探讨 J.临床肺科杂志，2 0 12,17(9)：1675-1676.9KONG D,ZHENG T,ZHANG M,et al.Staticmechanical stress induces apoptosis in rat endplatechondrocytes through MAPK and mitochondria-dependent caspase activation signaling pathways J.PLoS 0NE,2013,8(7):e69403.10朱筑霞，潘玮炜，易必达,等.砷致大鼠海马神经细胞调亡对学习记忆功能的影响 J.贵州医药,2 0 10,34(9):777-780.11李玉飞,康朝胜，臧贵勇，等.SYNI在慢性砷中毒大鼠海马CA3区的表达 J.当代医学，2 0 0 9(34)：3-5.12 范兴君，马子媛，杜宗花，等.低剂量亚慢性砷染毒对雄性大鼠生殖功能及子代的影响 J.中国生育健康杂志,2 0 12,2 3(5):36 1-36 4.13李解生，李纯颖，李勇，等.甲醛对小鼠胚胎的发育毒性 J.实用预防医学，2 0 0 9,16(4)：12 42-12 44.14 吴勇.精索静脉曲张大鼠血清抑制素B、性激素及睾丸肿瘤坏死因子的变化 D.佳木斯：佳木斯大学,2 0 0 7.15售曹兴午，林凯，李翠英，等.睾丸生精小管界膜和管周肌样细胞调控睾丸功能 J中国男科学杂志，2011,25(12):59-62.16杨春林，王明，邓远忠，等.雄性大鼠脊髓损伤对生殖系细菌感染及IL-1、T N F-、SO D 表达的影响 J.重庆医科大学学报,2 0 11,36(11)：12 9 6-12 9 9.17戴研平，高晓勤，丁贤胜.盐酸利多卡因体外对精子功能及超微结构的影响 J.甘肃医药,2 0 2 0,39(9)：7 9 9-8 0 1.18胡京美，许成岩，李媛，等.不同冷冻保护剂对人类精子冷冻复苏后活动能力的影响 J.中华男科学杂志，2008(1):23-25.19郭海，宋爽，王国秀，等.染锰大鼠生精细胞调亡中caspase-3mRNA、凋亡蛋白酶活化因子-1及多聚ADP核糖聚合酶的表达变化 J.解剖学杂志，2017,40(3):254-257.20白彩军,刘丹，李冰.砷的氧化应激分子机制研究进展 J.实用预防医学，2 0 12,19（2）：314-316.（责任编辑：钱英红）215 许小凤，谈勇，陈宣伊，等.补肾活血中药对雷公藤致卵巢储备下降大鼠颗粒细胞调亡的影响 J.医学研