CLCA4对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化的影响及机制.pdf

第一作者简介:李亮,副主任医师,研究方向:胃肠道肿瘤。E-mail:37056064 通讯作者:李建刚,硕士,副主任医师,研究方向:胃肠道肿瘤。E-mail:15199142320 doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.014CLCA4 对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化的影响及机制李亮,李建刚,王俊新疆医科大学第二附属医院普外科,新疆 乌鲁木齐 830063【摘要】目的探讨 CLCA4 对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化的影响及可能机制。方法收集 100 例患者的结直肠癌组织及癌旁正常组织。培养 SW620 细胞,根据转染质粒不同分为 Vector 组(转染 pcDNA3.1)、CLCA4 组(转染 pcDNA3.1-CLCA4)、sh-NC 组(转 染 sh-NC)、sh-CLCA4 组(转 染 sh-CLCA4)及 Control 组(无 处 理)。sh-NC 组 及 sh-CLCA4 组 细 胞 用GSK2126458 分处理并定义为 sh-NC+GSK2126458 组、sh-CLCA4+GSK2126458 组。分析 CLCA4 与结直肠癌临床病理特征、预后的关系,CCK-8 检测细胞增殖能力,Tanswell 实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,qRT-PCR 检测细胞、组织中 CLCA4 mRNA 表达水平,Western blotting 检测细胞或组织中 CLCA4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白表达水平。结果结直肠癌组织 CLCA4 mRNA、蛋白表达水平低于癌旁正常组织(P0.05)。CLCA4 表达水平与临床分期、淋巴结转移、脉管侵犯、神经侵犯及血清癌胚抗原水平有关(P0.05)。CLCA4 高表达组患者总体生存率高于 CLCA4 低表达组(P=0.006)。CLCA4 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数,Vimentin、N-cadherin 表达水平及 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值低于 Vector 组,迁移率及 CLCA4、E-cadherin 表达水平高于 Vector 组(P0.05);sh-CLCA4 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数,Vimentin、N-cadherin 表达水平及 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值高于 sh-NC 组,迁移率及 CLCA4、E-cadherin 表达水平低于 sh-NC 组(P0.05);sh-NC+GSK2126458 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数低于 sh-NC 组,迁移率高于 sh-NC 组(P0.05),sh-CLCA4+GSK2126458 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数低于 sh-CLCA4 组,迁移率高于 sh-CLCA4 组(P0.05)。结论CLCA4在结直肠癌组织中低表达,与肿瘤临床病理特征、预后有关,CLCA4 通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化。【关键词】CLCA4;PI3K/AKT/mTOR;结直肠癌;上皮-间质转化中图分类号:R735.3文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0908-07收稿日期:2022-08-10Effect and mechanism of CLCA4 on proliferation,invasion,migration and epithelial mesenchymal transformation in colorectal cancer cellsLI Liang,LI Jiangang,WANG JunDepartment of General Surgery,the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830063,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanism of calcium activated chloride channel A4(CLCA4)on proliferation,invasion,migration and epithelial mesenchymal transformation(EMT)in colorectal cancer(CRC)cells.MethodsA total of 100 cases of CRC tissues and adjacent normal tissues were collected.SW620 cells were cultured and divided into Vector group(transfected with pcDNA3.1),CLCA4 group(transfected with pcDNA3.1-CLCA4),sh-NC group(transfected with sh-NC),sh-CLCA4 group(transfected with sh-CLCA4)and Control group(no treatment).sh-NC group and sh-CLCA4 group were treated with GSK2126458,which were defined as sh-NC+GSK2126458 group and sh-CLCA4+GSK2126458 group.The relationship between CLCA4 and clinicopathological fea-tures and prognosis of CRC were analyzed.CCK-8 was used to detect cell proliferation.Tanswell test was used to detect cell invasion.Scratch test was used to detect cell migration.qRT-PCR was used to detect the expression level of CLCA4 mRNA in cells and tissues.Western blotting was used to detect CLCA4,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR protein expression.ResultsThe expression levels of CLCA4 mRNA and protein in CRC were lower than those in adjacent normal tissues(P0.05).The expression level of CLCA4 was related to clinical stage,lymph node metastasis,vascular invasion,nerve invasion and serum carcinoembryonic antigen level(P0.05).The overall survival rate of patients with high expression of CLCA4 was higher than that of patients with low expression of CLCA4(P=0.006).OD values at 48 hours and 72 hours,the number of invasive cells,expression levels of Vimentin and N-cadherin,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR values in CLCA4 group were lower than 809胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8those in Vector group.The mobility and expression of CLCA4 and E-cadherin in Vector group were higher than those in Vector group(P0.05).OD values at 48 hours and 72 hours,number of invasive cells,expression levels of Vimentin and N-cadherin,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR values in sh-CLCA4 group were higher than those in sh-NC group.The mobility and expression levels of CLCA4 and E-cadherin in sh-NC group were lower than those in sh-NC group(P0.05).The 48 hours and 72 hours OD values of cells in sh-NC+GSK2126458 group were lower than those in sh-NC group.The mobility was higher than that in sh-NC group(P0.05).The 48 hours and 72 hours OD values of cells in sh-CLCA4+GSK2126458 group were lower than those in sh-CLCA4 group,but the mobility was higher than that in sh-CLCA4 group(P5 cm)。本研究通过我院伦理委员会批准,批号:2019(069)号。1.2 随访采用电话或门诊复诊等方式,截止时间为2021 年 12 月 1 日,根据 CLCA4 mRNA 表达截断值分为CLCA4 低表达组、高表达组,使用 R 包“Survival”分析两组患者总体生存率:确诊之日至患者死亡或最后1 次随访日期。1.3细胞、试剂及仪器人结直肠癌 SW620 细胞株(本实验室保存)。DMEM/F12 培养基、胰蛋白酶(05-200-1A,03-045-1B,BI,以色列),CCK-8(E606335,上海生工生物有限公司),RIPA 蛋白裂解液、BCA 试剂盒(20-188,71285-M,Sigma,美 国),兔 抗 人 CLCA4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR及GAPDH(10494-1-AP、20874-1-AP、22018-1-AP、10366-1-AP、20584-1-AP、67121-1-Ig、60203-2-Ig、80455-1-RR、66888-1-Ig、67778-1-Ig、60004-1-Ig,Proteintech,美国),山羊抗兔 IgG-辣根过氧化物酶(30000-0-AP,北京博尔西科技有限公司),TRIzol(15596026,Invitrogen,美 国),Matrigel(354234,BD Biosciences,美国),荧光定量 PCR 试剂盒(RR420L,TaKaRa,日本);过表达空载体(pcDNA3.1)、CLCA4 过表达载体(pcDNA3.1-CLCA4)、敲低载体(sh-NC)、CLCA4 敲低载体(sh-CLCA4)、引物(广州锐博生物有限公司),Lipofectamine 2000(11668019,Invitrogen,美国),GSK2126458(SF2811-10 mmol/L,上海碧云天生物有限公司),ABI 7500 型 PCR 仪(ABI,美国),光学显微镜(北京仪器厂)。1.4细胞培养与分组SW620 细胞使用 DMEM/F12培养基培养,培养条件:37 ,体积分数为 5%的 CO2培养箱中。将 pcDNA3.1、pcDNA3.1-CLCA4、sh-NC、sh-CLCA4 质粒转染至 SW620 细胞,并分为 Vector 组、CLCA4 组、sh-NC 组及 sh-CLCA4 组。sh-NC 组及 sh-CLCA4 组细胞用 GSK2126458 处理并定义为 sh-NC+GSK2126458 组、sh-CLCA4+GSK2126458 组。1.5CCK-8 检测细胞增殖将各组细胞制备成单细胞悬液,以每孔 1 104个细胞接种到 96 孔板,培养24、48 及 72 h 后去除培养基,加入 10 l CCK-8,孵育1 h 后上机检测 450 nm 处 OD 值。1.6Transwell 检测细胞侵袭上室用 DMEM 稀释的 Matrigel(14)包被基底膜,然后用无血清培养基制备单细胞悬液(1106个/ml),取细胞悬液 200 l 加909胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8入到 Transwell 上室,24 孔板下室一般加入 600 l 含质量浓度为 100 g/L 胎牛血清的培养基,常规培养48 h,用棉签擦去上室内的细胞,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色,低倍镜下选取 5 个视野,计数。1.7划痕实验检测细胞迁移用无血清培养基将各组细胞制备成单细胞悬液,以每孔 1105个细胞接种到 6 孔板,当细胞融合为 80%左右时用 10 l 枪头在细胞表面划线,PBS 洗涤 3 次,培养 24 h 后测量细胞间距离。迁移率(%)=24 h 时细胞间距离/0 h 时细胞间距离。1.8qRT-PCR 检测细胞、组织 CLCA4 mRNA 表达水平将收集的组织在液氮中研磨。另取对数生长期的细胞,胰酶消化,150 g 离心 10 min。分别向组织或细胞中加入 1 ml Trizol 提取总 RNA,分光光度仪测定RNA 浓度及纯度,然 后逆转录合 成 cDNA。然后以cDNA 为模板进行 PCR,反应体系(10 l):2SYBR Mix 5 l,上下游引物各 0.25 l,10cDNA 0.5 l,ddH2O 4 l。循环条件:95 10 s,60 34 s,共 40 个循环,CLCA4 上、下游引物:5-CCCTTCAGCTCGAAAGTAA-3,5-AGATTGTATGCCCAAGTGCC-3;GAPDH 上、下游 引 物:5-TTTGGGGCTCTTACATCAGG-3,5-GT-GTCGTTCATCCAGGCATT-3。相对表达量用 2-Ct法计算。1.9 Western blotting 检 测 组 织、细 胞 CLCA4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白表达水平收集细胞或组织,加入细胞裂解溶液提取总蛋白,将蛋白样品于 100 煮 5 min。分别制备 10%分离胶及 5%浓缩胶,每孔中加入 30 g 蛋白,将蛋白转移到 PVDF 膜上,质量浓度为 50 g/L 无脂牛奶室温下封闭 1 h,加入CLCA4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 及-actin(均为1 1 000)4 过夜。次日 PVDF 膜与二抗室温下孵育1 h,加入发光液,曝光,Image J 分析灰度值,采用目标蛋白/-actin 表示目标蛋白的相对表达量。1.10 统计学分析采用 SPSS 20.0 进行统计学分析。计量资料以 xs 表示,结直肠癌组织及癌旁正常组织中CLCA4 表达水平比较采用配对 t 检验,不同临床病理特征肿瘤组织中 CLCA4 表达水平差异比较行独立样本 t检验,多组间比较采用单因素方差分析,采用 K-M 生存曲线观察不同 CLCA4 表达水平患者预后,差异比较采用 Log-rank 检验。P0.05 为差异有统计学意义。每组重复 9 次。2结果2.1 CRC 组织、癌旁正常组织中 CLCA4 表达水平 CRC组织中 CLCA4 mRNA 表达水平(3.890.65)低于癌旁正常组织(13.842.09)(t=47.212,P=0.000),CRC 组织中 CLCA4 蛋白表达水平低于癌旁正常组织(P0.05,见图 1)。2.2CLCA4 表达水平与 CRC 临床病理特征的关系CLCA4 表达水平与 TNM 分期、淋巴结转移、脉管侵犯、神经侵犯及血清癌胚抗原水平有关(P0.05,见表 1)。注:A:CLCA4 mRNA 表达水平;B:CLCA4 蛋白表达水平。P0.0001。图 1CRC 组织、癌旁正常组织中 CLCA4 表达水平Fig 1The expression level of CLCA4 in CRC tissue and adjacent normal tissue2.3 CLCA4 表 达 水 平 与 CRC 患 者 预 后 的 关系 100 例患者中,失访 3 例,共纳入 97 例患者进行预后分析。CLCA4 高表达组(71 例)患者总体生存率高于 CLCA4 低表达组(26 例)(P=0.006,见图 2)。2.4过表达 CLCA4 对 SW620 细胞增殖、侵袭及迁移的影响CLCA4 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数低于 Vector 组,迁移率高于 Vector 组(P 0.05),sh-CLCA4 组细胞 48 h、72 h OD 值、侵袭细胞数高于sh-NC 组,迁移率低于 sh-NC 组(P0.05,见图 3)。2.5CLCA4 对 SW620 细胞 EMT 的影响CLCA4组细胞 CLCA4、E-cadherin 表达水平高于 Vector 组,Vimentin、N-cadherin 表 达 水 平 低 于 Vector 组(P 0.05)。sh-CLCA4 组细胞 CLCA4、E-cadherin 表达水平低于 sh-NC 组,Vimentin、N-cadherin 表达水平高于sh-NC 组(P0.05,见图 4)。019胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8表 1CLCA4 表达水平与 CRC 临床病理特征的关系(xs)Tab 1Relationship between CLCA4 expression level and clinical pathological characteristics of CRC(xs)临床病理特征例数CLCA4 mRNA表达水平t 值P 值性别0.6410.523 男573.900.12 女433.880.17年龄1.1890.240 3 cm203.840.19分化程度-1.3230.189 低263.850.20 中743.920.24TNM 分期9.0040.000+期664.010.13 期343.750.15肿瘤位置1.0860.293 左半结肠163.920.22 右半结肠+直肠843.860.09淋巴结转移-6.0640.000 有443.710.29 无564.100.34远处转移-1.9530.054有63.690.18 无943.950.32脉管侵犯-5.1000.000 有243.750.11 无763.960.30神经侵犯-2.6100.014 有283.830.24 无723.950.07血清癌胚抗原-9.8760.000 5 ng/ml423.650.17 5 ng/ml584.150.33图 2CLCA4 表达水平与 CRC 患者预后的关系Fig 2Relationship between CLCA4 expression level and prognosis of CRC patients2.6CLCA4 对 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的影响CLCA4组 细 胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值低于 Vector 组(P0.05),sh-CLCA4组细胞 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值高于 sh-NC 组(P0.05,见图 5)。2.7GSK2126458 逆转 CLCA4 低表达对细胞的增殖、侵袭及迁移的促进作用sh-NC+GSK2126458 组细胞 48 h、72 h OD 值,侵袭细胞数低于 sh-NC 组,迁移率高于 sh-NC 组(P0.05)。sh-CLCA4+GSK2126458 组细胞 48 h、72 h OD 值和侵袭细胞数低于 sh-CLCA4 组,迁移率高于 sh-CLCA4 组(P0.05,见图 6)。注:A:CCK-8 结果,与 sh-NC 组比较,P0.01,与 Vector 组比较,P0.01;B:侵袭实验,P0.01;C:划痕实验,P0.05。图 3CLCA4 对 SW620 细胞增殖、侵袭及迁移的影响(放大 200 倍)Fig 3Effect of CLCA4 on the proliferation,invasion and migration of SW620 cells119胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8注:P0.01。图 4CLCA4 对 SW620 细胞 EMT 的影响Fig 4Effect of CLCA4 on EMT in SW620 cells注:P0.01。图 5CLCA4 对 SW620 细胞 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的影响Fig 5Effect of CLCA4 on the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in SW620 cells注:A:CCK-8 结果,与 sh-NC 组比较,P0.01,与 sh-CLCA4 组比较,P0.01;B:侵袭实验,P0.01;C:划痕实验,P0.01。图 6GSK2126458 逆转 CLCA4 低表达对细胞的增殖、侵袭及迁移的促进作用(放大 200 倍)Fig 6GSK2126458 reversed the promoting effect of low expression of CLCA4 on cell proliferation,invasion and migration219胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.83讨论CRC 作为消化系统常见恶性肿瘤,多数患者确诊时肿瘤已经发生转移,导致治疗效果不佳,预后不良。因此,探讨 CRC 发生、发展的分子机制对于改善患者预后至关重要。CLCA4 是钙活化氯离子通道家族中研究较多的基因,最新研究显示 CLCA4 在多种肿瘤组织中低表达。Song 等6研究发现,CLCA4 在食管癌组织中低表达,与肿瘤分期、淋巴结转移及分化程度有关,过表达 CLCA4 抑制食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移。Liu 等4研究结果表明,CLCA4 过表达可抑制头颈部 肿 瘤 细 胞 的 增 殖、侵 袭 及 EMT 转 化。最 新 研究21发现,CLCA4 在 CRC 组织中低表达,与患者预后有关。但 CLCA4 对 CRC 发生发展的影响及分子机制尚不清楚。本研究通过 qRT-PCR、Western blotting 检测了 CRC 组织中 CLCA4 的表达,发现 CLCA4 在 CRC组织中低表达,与临床分期、脉管侵犯、神经侵犯及血清癌胚抗原水平有关,这与其他人研究结果3,5基本一致,提示 CLCA4 参与了 CRC 的发生发展过程。为进一步探索 CLCA4 对 CRC 的作用,我们在 CRC 细胞中过表达及敲低了 CLCA4,结果显示,CLCA4 抑制了细胞增殖、侵袭及迁移。此外,本研究结果还表明,CLCA4 抑制了 CRC 细胞的 EMT 过程。EMT 是上皮细胞通过极性改变和细胞粘附力丧失等转化为间质细胞的过程,在肿瘤细胞侵袭、迁移中扮演着至关重要的角色22。上述这些结果提示 CLCA4 对 CRC 具有抑制作用,是 CRC 进展的抑癌基因,这与 CLCA4 在其他肿瘤中的作用一致。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是细胞经典通路,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡等生物学行为,在肿瘤的发生发展中扮演着关键角色23。PI3K 通过磷酸化丝氨酸/苏氨酸酶 AKT 使其激活,AKT 进而促进丝氨酸/苏氨酸酶 mTOR 的磷酸化。当 PI3K/AKT/mTOR 信号通路被异常激活后肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显增加。闫婷等24研究发现,MEX3A可通过 PI3K/AKT 通路促进 CRC 细胞的增殖、迁移。冯跃等25研究发现,PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白在 CRC 组织中高表达,与肿瘤进展、预后密切相关。最近 Liu 等4研究 发现,CLCA4 可 通 过 PI3K/AKT 通路抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移及 EMT 过程。CLCA4 是否同样通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路影响 CRC 细胞的增殖、侵袭及迁移尚不清楚。本研究结 果 显 示,敲 低 CLCA4 后 细 胞 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 及 p-mTOR/mTOR 明 显 升 高,反 之,上 调CLCA4 的细胞 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 及 p-mTOR/mTOR 明显降低,提示 CLCA4 可能通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路发挥功能。为进一步明确该推测,我们 使 用PI3K/AKT/mTOR信 号 通 路 抑 制 剂GSK2126458 进行干预,结果显示,GSK2126458 处理的SW620 细胞增殖、侵袭及迁移 能力明显下降,提 示PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与了 CRC 细胞的恶性生物学过程。同时敲低 CLCA4 的 SW620 细胞加入GSK2126458 可逆转 CLCA4 下调对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移的促进作用,再次证明了沉默 CLCA4 通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进了 SW620 细胞增殖、侵袭及迁移。但本研究存在一些缺陷。首先,本研究的临床样本量较少,有待进一步扩大样本量进行多中心验证结果。其 次,本 研 究 未 进 行 体 内 试 验 验 证 CLCA4 对SW620 细胞增殖、侵袭及迁移的影响。综上所述,CLCA4 在 CRC 组织中低表达,与肿瘤临床病 理 特 征、预 后 有 关,CLCA4 通 过 PI3K/AKT/mTOR 信 号通路抑制 CRC 细胞 的增殖、侵 袭、迁 移及 EMT。参考文献1 Sinha R.Colorectal cancer J.Clin Radiol,2021,76(12):870.DOI:10.1016/j.crad.2021.09.003.2 Biller LH,Schrag D.Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer:a review J.JAMA,2021,325(7):669-685.DOI:10.1001/jama.2021.0106.3 Li B,Jiang YP,Zhu J,et al.MiR-501-5p acts as an energetic regula-tor in head and neck squamous cell carcinoma cells growth and aggres-siveness via reducing CLCA4 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