SIRT1在高胆红素血症新生大鼠海马区的表达特点.pdf

基金项目：山西省卫生健康委员会科研课题人才专项（）作者简介：李国婧，女，生，在读硕士，：收稿日期：在高胆红素血症新生大鼠海马区的表达特点李国婧，马宁，吴永萌，阴怀清，白丹，王春芳（山西医科大学第一临床医学院儿科，太原 ；山西医科大学第一医院儿科；山西医科大学实验动物中心；通讯作者，：）摘要：目的初步探讨沉默信息调节因子 相关酶 （，）在高胆红素血症诱导新生大鼠脑损伤中的神经保护作用及可能机制。方法日龄 新生大鼠 只，随机分为对照组、模型组及干预组，每组 只。模型组大鼠腹腔注射胆红素溶液（）建立高胆红素血症模型，对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，干预组于造模后立即给予腹腔注射白藜芦醇（）。各组随机分为 个亚组，每亚组 只，于相应处理后 ，观察大鼠皮肤颜色及行为学变化，随后处死大鼠。取各组新生大鼠脑组织常规 染色观察海马区病理变化，法检测海马区细胞凋亡率，免疫组化检测海马区 表达水平。结果同一时间点，与对照组相比，模型组大鼠皮肤黄染及行为异常明显，海马区细胞凋亡率升高（），表达水平降低（）；与模型组相比，干预组大鼠皮肤黄染及行为异常减轻，海马区细胞凋亡率降低（），但仍高于对照组（），表达水平升高（），但仍低于对照组（）。结论在高胆红素血症新生大鼠中，对胆红素诱导的神经损伤发挥神经保护作用，有望成为新生儿高胆红素血症综合治疗的拓展方向。关键词：高胆红素血症；胆红素神经毒性；沉默信息调节因子 相关酶 ；新生儿；黄疸；白藜芦醇中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，：）：（）：（），（），（），（）（）（），（），（），（），（），（），：；，高胆红素血症是新生儿最常见的疾病之一，表现为黄疸，即皮肤及巩膜的黄染 。出生后第 周新生儿黄疸的发病率在足月儿和早产儿中分别为 和 ，这是由于新生儿胆红素代谢特点导致的胆红素代谢失衡引起的 。大多数黄疸是生理性的，少数新生儿胆红素水平短期内迅速上升，发展为严重高胆红素血症，使得他们面临神经系统损伤的风险，临床表现为急性胆红素脑病（，）和核黄疸谱系障碍（，），可能导致患儿死亡或遗留长期神经功能障碍 。沉默信息调节因子 相关酶 （，）是一种广泛存在于机体细胞中的去乙酰化酶，通过对蛋白质底物发挥去乙酰化作用调节炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等多种病理生理过程 。在哺乳动物细胞中，在胞核和胞浆均可定位，不同的亚细胞定位和它发挥的功能不同相关 。白藜芦醇是一种天然多酚，具有抗氧化、抗炎和神经保护作用。现有的证据证实，白藜芦醇可作为 的天然激动剂，与 的激活密切相关 。越来越多的数据表明，调节中枢神经系统（，）稳态和正常神经功能所必需的多种分子信号通路。过表达减少 蛋白乙酰化水平，从而保护麻醉和手术后小鼠的认知功能 ，而 蛋白也被认为是胆红素神经毒性（，）的 标 志 物 之一 。此外，及白藜芦醇在新生儿缺血缺氧性脑病（，）中的保护效应也是近几年国内外学者关注的对象 。的机制与新生儿 的机制在促炎因子和谷氨酸过度释放、线粒体衰竭和细胞内钙离子浓度升高方面表现出相似性 。为明确 是否在胆红素诱导的脑损伤中也能发挥其神经保护作用，本实验探究 在高胆红素血症大鼠海马区神经元的表达特点，分析 是否参与并改善了胆红素造成的神经损伤，为高胆红素血症的综合治疗提供新的思路。材料与方法 实验动物和主要试剂日龄清洁级 新生大鼠 只，雌雄不限，体质量 ，购自山西医科大学动物实验中心。胆红素（纯度 ，美国 生物科技公司），白藜芦醇（纯度 ，美国 生物科技公司），细胞凋亡检测试剂盒 （博士德生物技术公司），一抗 （博士德生物技术公司），二抗酶标山羊抗小鼠 兔 聚合物（北京中杉金桥）。药品制备胆红素溶液：取 的 溶液 于 试管中，称取 胆红素晶体加入 溶液，使胆红素充分溶解，用双蒸水将其定容至 ，逐滴加入 调节溶液 至 ，备用，操作全程注意避光。白藜芦醇溶液：称取白藜芦醇晶体 并将其转移至 试管，加入生理盐水 ，充分摇匀使白藜芦醇完全溶解，备用。动物模型分组及制备 只大鼠随机分为对照组（）、模型组（）及干预组（），模型组大鼠以 胆红素溶液腹腔注射建立高胆红素血症模型，对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，干预组于造模后立即给予腹腔注射 白藜芦醇。各组随机分为 个亚组，每亚组 只，于处理后 ，观察大鼠一般状况及行为学变化，随后处死大鼠。大鼠于相应处理完成后到处死前由母鼠继续喂养。组织标本采集各亚组大鼠在相应时间点处死。给予大鼠 水合氯醛腹腔注射，充分麻醉后将大鼠取仰卧位固定于手术台上。快速打开大鼠胸腔、腹腔暴露心脏及肝脏，用眼科剪将肝脏剪破，取头皮针连接 注射器，轻微负压，刺入大鼠心尖搏动最明显处，见血液回流后依次用生理盐水 和 多聚甲醛 灌洗，直至大鼠肝缘流出清亮液体。断头剪去大鼠头部皮肤，眼科镊钝性分离骨质暴露完整脑组织，脑组织于 多聚甲醛中固定 。取材沿冠状面取后 脑组织切片，脱水，石蜡包埋，留存蜡块备用。一般状况及行为学变化于 ，观察大鼠皮肤、体质量及尿液颜色变化、是否出现异常行为变化及具体表现。为观察大鼠行为变化，采用网屏试验和斜坡试验观察大鼠有无神经损伤。网屏试验：将长 、宽 、网眼大小为 的网屏水平放置于 高处，大鼠平山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期稳放在网屏上，下方垫垫料，先缓缓抬高网屏一侧，随后在 内将网屏旋转 ，观察大鼠是否掉落及掉落时间，测试大鼠肌力。斜坡试验：大鼠头朝下放置在倾斜度为 的斜坡上，观察大鼠身体旋转 转为头朝向斜坡上方的时间，测试大鼠平衡协调能力。脑组织病理学观察蜡块切片，厚度 ，于 烘烤 ，常规脱蜡水化。苏木素 伊红（）染色，光镜观察脑组织切片，采集图像并记录病理改变。法检测海马神经元 表达蜡块切片后常规脱蜡水化，于 浸泡 去除内源性过氧化酶活性，浸泡清洗（次，每次 ，后文未特殊强调则清洗方法同）。高温高压柠檬酸抗原修复 ，自然冷却至室温；清洗；一抗 （体积比 ）覆盖组织，孵育 ，室温冷却 ；清洗；添加二抗 孵育 ，清洗；显色（显色剂 缓冲液 滴 ）后苏木素复染封片；观察 表达水平，每张切片取 个高倍视野（）采集图像，采用 软件分析其 值，值随表达水平增加而增大。法检测海马区细胞凋亡率蜡块切片后常规脱蜡水化，去除内源性过氧化物酶活性；滴加蛋白酶 稀释液（蛋白酶 体积比 ），于湿盒 反应 ；清洗；滴加标记缓冲液 （标记缓冲液体积比 ）于湿盒 标记；清洗；添加封闭液室温反应 ；生物素化地高辛抗体：稀释抗体（抗体 稀释液体积比 ）覆盖组织，转移至湿盒，反应 ；清洗；稀释液（稀释液体积比 ）反应 ；清洗切片 次，每次 ；复染后封片；观察细胞凋亡率：每张切片取 个高倍视野（）采集图像，计算单位视野凋亡细胞数及细胞总数，二者比值即为凋亡率。统计学分析采用 统计软件进行分析，定量资料用均数 标准差（珋 ）表示，经正态分布及方差齐性检验后，采用析因设计的方差分析进行统计分析，进一步两两比较采用 检验；为差异有统计学意义。结果 大鼠皮肤颜色及行为学变化各亚组大鼠给予相应处理前均活动良好、进食正常，皮肤红润，无异常行为及表现。相较于对照组，造模后 模型组大鼠可见皮肤黄染，尿液颜色变黄，出现嗜睡、反应力减低、活动量减少等表现；时，模型组大鼠反应力进一步下降，并出现四肢颤动、俯伏、侧卧、抖动等表现，网屏试验及斜坡试验时间较对照组延长，提示大鼠肌张力降低及平衡能力受损。随时间延长，上述症状加重；时，模型组大鼠与对照组相比，体型明显偏小，提示大鼠进奶量少，体质量增长不佳。与对照组相比，干预组大鼠可见皮肤及尿液颜色黄染、嗜睡、反应降低等异常表现，但程度较模型组轻。大鼠海马神经元病理变化对照组大鼠海马区病理切片显示神经细胞排列规律整齐，胞核清晰可见，未见坏死细胞、细胞肿胀及其他明显病理变化；模型组大鼠海马区病理切片显示神经细胞数量较对照组明显减少，细胞排列松散、结构模糊，可见胞核固缩、碎裂；干预组大鼠与对照组相比存在模型组所述病理表现，但变化较模型组减轻（见图 ）。对照组模型组干预组图 造模后 各组大鼠海马区病理变化（）（），大鼠海马神经元 表达情况 在对照组海马区神经细胞中可见明显阳性表达，主要定位于细胞核，阳性细胞胞核呈棕色或棕褐色（见图）。多因素方差分析提示不同组别与时间均影响 表达水平，且存在交互效应（组间 ，；时间 ，；交互 ，见表 ）。进一步比较同一时间不同组别 表达水平，可见各时间点模型组和干预组海马区神经细胞中 表达较对照组明显减少（），但干预组明显高于模型组（，见表 ，图 ）。图 高胆红素水平和白藜芦醇对新生大鼠海马区 表达水平的影响（染色，）（，）表 高胆红素水平和白藜芦醇对新生大鼠海马区 表达水平的影响（珋 ）（珋 ）组别 对照组 模型组 干预组 与对照组比，；与模型组比，大鼠海马区神经细胞凋亡率 检测显示正常细胞呈蓝色荧光，凋亡细胞呈红色荧光。多因素方差分析提示不同组别与时间均影响细胞凋亡率，且存在交互效应（组间 ，组间 ；时间 ，时间 ；交互 ，交互 ，见表 ）。进一步比较同一时间不同组别凋亡率，可见各时间点模型组和干预组海马区细胞凋亡率较对照组明显升高（），且模型组明显高于干预组（，见表 ，图 ）。表 高胆红素水平和白藜芦醇对新生大鼠海马区神经细胞凋亡率的影响（珋 ，）（珋 ，）组别 对照组 模型组 干预组 与对照组比，；与模型组比，山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期正常细胞呈蓝色荧光，凋亡细胞呈红色荧光图 高胆红素水平和白藜芦醇对新生大鼠海马区神经细胞凋亡率的影响（）（）讨论胆红素是一种黄色的血红素降解产物，其脂溶性使得它能够穿过细胞膜并与细胞及器官结合，胎儿时期，这一特性允许胆红素穿过胎盘屏障由胎儿到达母体，经母体肝脏排出，减少了胎儿自身对胆红素代谢的需求 。胎儿娩出后，一方面，新生儿胆红素负荷增加、肝脏代谢及白蛋白结合水平有限、肠肝循环增加等原因导致胆红素处于较高水平；另一方面，与胎儿向新生儿循环方式转变相关的氧化应激引起的生理性溶血以及免疫性或遗传性溶血也是致使新生儿胆红素水平升高的重要因素 。与此同时，新生儿血脑屏障发育不成熟，未结合胆红素容易穿过血脑屏障沉积在海马、基底节、脑干核、丘脑及小脑等区域 ，诱发神经毒性反应，导致 。脑脊液分析显示，炎症相关的细胞过程和信号通路在 婴儿中被激活 。大脑受到胆红素侵袭后，小胶质细胞及星形胶质细胞被激活，释放促炎细胞因子，如 、及 等，从而导致神经细胞凋亡；同时，与神经炎症相关因子共同触发小胶质细胞及星形胶质细胞中的 通路，活化的 可以从细胞质向细胞核转移，进一步推动 、及 等下游炎症因子的产生，加重了细胞的结构破坏和功能障碍 。是与神经炎症反应密切相关的信号通路，已被证实在多种疾病中具有神经保护作用 。可通过直接或间接途径抑制 的活化。直接作用于 的 亚基，使其第 位赖氨酸残基去乙酰化，抑制 的转录，从而抑制 依赖基因的表达 。在新生大鼠 模型中，通过靶向抑制 阻断 脱乙酰并激活 ，正向调控新生儿 中的神经炎症。阿尔茨海默病（）小鼠模型中，白藜芦醇被发现通过 通路发挥抗痴呆作用 。神经炎症被认为是 的核心机制，而 动物模型显示的病理变化与 非常相似 ，。这些证据表明，可能通过减轻神经炎症改善胆红素造成的神经毒性。过高的胆红素水平还被认为与新生儿神经系统的氧化应激高度相关，并引起 损伤及神经元凋亡 。及其下游靶蛋白参与氧化应激的调节。减轻了氧化应激和炎症反应在放射性脑损伤中的伤害 ；通路改善了 中的神经元氧化应激 。此外，能够通过改变 的抑制蛋白的结构来激活 ，从而促进抗氧化基因水平提高，减少内毒素小鼠的氧化应激损伤、神经炎症和神经凋亡 ，。还可通过直接调节肿瘤抑制因子 调控细胞凋亡。是 的非组蛋白底物，乙酰化 的第 位赖氨酸残基，从而抑制其转录激活和 依赖的 ，凋亡诱导 。在新生儿高氧相关的脑损伤及 中，均表现出对 的抑制并有效改善了神经损伤 ，。结合上述理论基础，本实验通过测定 日龄高胆红素血症大鼠模型海马区神经元 表达水平及凋亡情况，分析 与高胆红素血症诱导脑损伤的关系。已有研究表明，海马区易受胆红素神经毒性的影响，其次是下丘、皮质和小脑 。对啮齿动物和人类神经系统的解剖学研究表明，的分布局限于海马、前额叶皮质、小脑和基底节区域，并且 主要表达于神经元 。基于胆红素损伤和 表达区域选择性在海马区的重叠，本实验选取海马区神经元作为观测对象。本实验结果显示，造模后各时间点模型组大鼠海马区神经元 表达水平较对照组明显降低，伴随凋亡率升高及异常行为改变，病理改变明显。随时间的延长，水平逐渐降低而凋亡率逐渐升高，二者表现出相反的变化趋势。干预组给予 激动剂白藜芦醇逆转了 表达的下降，并明显改善了神经元的凋亡情况及脑组织病理改变。证明 参与了胆红素水平升高诱导的神经损伤这一过程，并且，水平升高改善了高胆红素血症大鼠海马区神经元的损伤。分析其原因可能与高胆红素血症损伤后神经元 表达减少，促炎因子表达增加，抗氧化通路不能激活，使得神经元凋亡增加有关。白藜芦醇上调了 表达及活性，改善了神经元存活。综上所述，参与了高胆红素血症诱导的神经损伤过程，改善了胆红素造成的神经元凋亡，有望成为高胆红素血症综合治疗的拓展方向。其中涉及的具体信号通路，有待未来进一步的研究。参考文献：，：，（）：，：，（），（）：杨静丽，王建辉 版美国儿科学会新生儿高胆红素血症管理指南解读 中国当代儿科杂志，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（），：，：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，：？，（）：，（）：，：，：，：刘旺，周琴怡，莫志勇，等 调控氧化应激的研究进展 中南医学科学杂志，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，