薄壳山核桃花粉活力测定方法比较.pdf

Vol.41 No.2Jun.2023第 41 卷 第 2 期2023 年 6 月经 济 林 研 究 Non-wood Forest Research收稿日期：2022-10-18基金项目：中央财政林业科技推广示范资金项目（苏2022TG04）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。第一作者：刘帅（），硕士研究生。通信作者：彭方仁（），教授，博士，博士研究生导师。引文格式：刘帅,彭方仁.薄壳山核桃花粉活力测定方法比较 J.经济林研究,2023,41(2):110-119.LIU S,PENG F R.Comparison of detection methods for pollen viability of Carya illinoinensisJ.Non-wood Forest Research,2023,41(2):110-119.薄壳山核桃花粉活力测定方法比较刘 帅，彭方仁（南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.林学院，江苏 南京 210037）摘 要：【目的】筛选并优化薄壳山核桃花粉活力的测定方法，为薄壳山核桃的杂交育种提供参考。【方法】以 韦科、苏普锐尔、基奥瓦、奥多姆 4 个薄壳山核桃品种的花粉为试验材料，分别采用 MTT 染色法、TTC 染色法、过氧化物酶染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI 染色法和蓝墨水染色法对花粉进行染色，比较不同染色方法及不同染色溶液浓度处理间花粉活力的差异。采用正交试验对薄壳山核桃花粉萌发培养基配方进行优化，筛选适合薄壳山核桃花粉萌发的培养基。通过回归分析，探讨花粉染色率和离体萌发率之间的相关性，寻找最适合测定薄壳山核桃花粉活力的染色方法。【结果】除 TTC 染色法外，其余方法均能使薄壳山核桃花粉染色。适宜 4 个 薄壳山核桃品种花粉萌发的培养基并不完全相同，适宜韦科、基奥瓦和奥多姆花粉萌发的培养基为 5%蔗糖0.01%硼酸 0.05%硝酸钙 25%PEG-4000，萌发率分别可达 36.80%、46.32%、59.51%。适宜苏普锐尔花粉萌发的培养基为 8%蔗糖 0.025%硼酸 0.025%硝酸钙 25%PEG-4000，萌发率为 24.19%。采用 MTT 染色法所染深色花粉比例接近花粉萌发率，且所测花粉活力与花粉萌发率呈线性正相关（R2 0.686，P 0.001）。【结论】薄壳山核桃不同品种的最适花粉萌发培养基组分有差异，与其他染色法相比，MTT 法更适用于薄壳山核桃花粉活力的快速检测。关键词：薄壳山核桃；花粉活力；萌发率；MTT中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：10038981(2023)02011010Comparison of detection methods for pollen viability of Carya illinoinensisLIU Shuai,PENG Fangren(a.Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China;b.College of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China)Abstract:【Objective】In order to screen and optimize the determination method of the pollen viability of pecan,provide a reference for the cross breeding of pecan.【Method】The pollen of four pecan cultivars,Waco,Superior,Kiowa,and Odom,were used as test materials,the pollen was stained with 2,5-diphenylmonotetrazolium bromide(MTT),2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC),peroxide,acetic carmine,I2-KI and blue ink dyeing methods,respectively,the differences in pollen viability between different staining methods and different stain concentrations were compared.The orthogonal test was used to optimize the pecan pollen germination medium formulation and to screen the medium suitable for pecan pollen germination.Through regression analysis,the correlation between pollen staining rate and in vitro germination rate was explored,so as to find the most suitable staining method for measuring the pollen viability of pecan.【Result】Except for TTC dyeing method,other methods could dye pecan pollen.The media suitable for pollen germination of the four pecan cultivars were not identical.The suitable media for pollen of Waco,Kiowa and Odom were:5%sucrose+0.01%boric acid+0.05%calcium nitrate+25%PEG-4000 and the germination rates were 36.80%,46.32%and 59.51%,respectively.The suitable medium for Superior pollen was 8%sucrose+0.025%boric acid+0.025%calcium nitrate+25%PEG-4000,and the germination rate was 24.19%.The proportion of dark Doi:10.14067/ki.1003-8981.2023.02.012http:/111第 41 卷经 济 林 研 究薄壳山核桃Carya illinoinensis又名长山核桃，属胡桃科 Juglandaceae 山核桃属 Carya，是世界著名的干果油料树种，也是优良的材用和庭园绿化树种，具有较高的经济价值，因此被世界各地广泛引种1-3。19 世纪末我国开始引种薄壳山核桃，但至今未形成规模化种植4-5。花粉作为植物遗传的载体，是杂交育种的基础6。花粉活力直接影响到有性生殖的效率与能力。因此，在杂交育种前对花粉活力进行准确且快速的检测十分重要7。花粉活力的测定方法主要有染色法和离体萌发法。离体萌发法稳定可靠，然而该方法受到体外培养条件的限制，例如培养基的组成（蔗糖、钙和硼酸等）和环境因素（温度和湿度等），此外不同的植物以及不同品种需要不同的培养条件。染色法快速简便，但同种花粉采用不同染色法获得的结果有较大差别8-9。薄壳山核桃为雌雄异花植物，存在雌雄异熟现象，雌花的可授粉期与雄花的散粉期大多不一致，而环境条件的变化也会影响薄壳山核桃的花期，从而导致授粉困难10-11。掌握薄壳山核桃的花粉特性，是科学授粉及育种的重要依据。目前，测定薄壳山核桃花粉活力的方法有离体萌发法12、MTT 染色法13、FCR 荧光染色法14等，但关于不同花粉活力测定方法的系统比较及优化研究鲜有报道。因此，开展花粉离体萌发培养并确定适宜的花粉活力测定方法，对开展薄壳山核桃育种研究具有重要意义。本研究中采用不同方法测定了薄壳山核桃花粉活力，探究适合测定薄壳山核桃花粉活力的染色方法，筛选花粉萌发最适培养基，并探讨了花粉染色率与萌发率的相关性，旨在为薄壳山核桃的杂交育种提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料在江苏省句容市南京林业大学薄壳山核桃试验基地，以韦科（Waco）、苏普锐尔（Surprise）、基奥瓦（Kiowa）、奥多姆（Odom）4 个薄壳山核桃品种为花粉采集对象。于薄壳山核桃雄花散粉期采集雄花序，将花序平摊在硫酸纸上，放置于阴凉通风处 24 h，待其自然散粉，过筛（筛网孔径 0.125 mm）并收集花粉，放入装有变色硅胶的自封袋中，放置于-20 冰箱中，备用。在保存后 20 d 内完成各品种花粉活力的测定。1.2 试验方法1.2.1 花粉染色使用 MTT 染色法15、TTC 染色法16、过氧化物酶染色法17、醋酸洋红染色法18、I2-KI 染色法19、蓝墨水染色法20共 6 种染色方法来测定花粉的活力（表 1）。主要分为 3 个步骤。首先，配置不同的染色液；然后，在 1.5 mL 离心管中加入1 mL 染色液，用毛笔将花粉撒入离心管，染色；最后，将 1 滴（约 30 L）含有花粉和染色溶液的pollen stained by MTT staining was close to the pollen germination rate,and the measured pollen viability was linearly positively correlated with the pollen germination rate(R2 0.686,P 0.001).【Conclusion】The most suitable pollen germination medium for different varieties of pecans is different,MTT is more suitable for rapid detection of pollen viability of pecan compared with other methods.Keywords:Carya illinoinensis;pollen viability;germination rate;MTT表 1 使用的薄壳山核桃花粉染色方法Table 1 Methods to stain pecan pollen编号No.方法Method染色液及其配制方法Staining agent and preparation method染色时间Staining time/min染色温度Staining temperature/1MTT 染色法0.05 g MTT 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液30352TTC 染色法0.05 g TTC 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液30353过氧化物酶染色法试剂 A 为 0.5%联苯胺、0.5%-萘酚、0.25%碳酸钠各 10 mL混合均匀，试剂 B 为 0.3%过氧化氢，测试时将试剂 A 与试剂B 各 0.5 mL 混合均匀30354醋酸洋红染色法醋酸洋红染色液（Solarbio，北京）5255I2-KI 染色法1 g KI 和 0.5 g I2，溶于 200 mL 蒸馏水30356蓝墨水染色法20%蓝色墨水（Hero，上海）525112第 2 期刘 帅，等：薄壳山核桃花粉活力测定方法比较混合溶液滴至载玻片上，盖上盖玻片，使用奥林巴斯BX53显微镜（放大10倍）观察花粉染色情况。除蓝墨水染色法外，均以对应颜色花粉的染色率表示花粉活力（被染色的花粉数量占观察视野花粉总数的百分比），蓝墨水染色法所测花粉活力以未染色率表示。每种染色方法重复 3 次，即均随机选取 3 个视野，每个视野至少 80 个花粉颗粒。根据试验结果，筛选 MTT 染色法、I2-KI 染色法、蓝墨水染色法进行优化，染色液均设置 3 种质 量分数，MTT 质量分数分别为 0.1%、0.3%、0.5%，I2-KI 质量分数分别为 0.3%、0.5%、1.0%，蓝墨水染色液质量分数分别为 10%、20%、30%。1.2.2 花粉离体萌发进行花粉萌发试验之前，先将花粉从-20 冰箱取出，放入 4 冰箱中解冻 12 h，然后将花粉放置于含饱和 CuSO4溶液的密闭容器中，于 25 复水 4 h21。配置培养基 112、222、321来进行薄壳山核桃花粉体外萌发试验（表 2）。在直径为 9 cm 的培养皿中放入 1 张滤纸，并滴加 1 mL 蒸馏水保持湿润，放入1枚凹载玻片，加入100 L液体培养基，使用毛笔将花粉均匀散布在培养基上，放置于黑暗条件下 25 培养 24 h，以花粉管长度大于花粉粒直径视为花粉萌发，统计花粉萌发率。对于每种培养基使用 3 个培养皿进行培养（视为 3 个重复），观察时在每个载玻片上随机选取 3 个视野，每个视野至少 80 个花粉颗粒。表 2 薄壳山核桃花粉萌发培养基各成分的含量Table 2 Content of each component in the germination medium of pecan pollen%培养基编号Medium No.各成分的质量分数 Mass fraction of each component蔗糖Sucrose硼酸Boric acid硝酸钙Calcium nitrate聚乙二醇PEG-40001200.0300.05002150.0050.0750350.0250.05020选择萌发率最高的培养基，通过 4 因素 3 水平共 9 个组合的 L9(34)正交试验（表 3），进行培养基优化。将薄壳山核桃花粉分成 12 份，使用最适培养基对花粉进行培养，用筛选出的染色法测试其活力。1.3 数据处理试验数据使用 Excel 2016 软件进行统计，使用 SPSS 17.0 软件进行分析，使用 Origin 2021 软件进行绘图。2 结果与分析2.1 花粉染色方法比较使用 6 种方法对薄壳山核桃花粉进行染色的效果如图 1 所示。由图 1 可见，除 TTC 染色法外（图 1A），其余 5 种染色方法均能使薄壳山核桃花粉染色，且染色后能够明显区分有活力花粉及无活力花粉。其中，采用 MTT 染色法、过氧化物酶染色法、I2-KI 染色法将花粉染色后，能够明显区分被染成深色和浅色（有活力）以及未被染色的花粉（无活力）（图 1B、C、D）。采用醋酸洋红染色法进行染色时，有活力的花粉被染成红色（图 1E）。采用蓝墨水染色法进行染色后，也能较明显地区分花粉有无活力，无活力的花粉被染成蓝色（图1F）。值得注意的是，采用MTT染色法、过氧化物酶染色法、I2-KI 染色法进行染色后，可以从被染色花粉中区分出被染成深色的花粉（图 1黑色箭头所示）。表 3 薄壳山核桃花粉萌发 L9(34)正交试验设计Table 3 Orthogonal experimental design of L9(34)for pollen germination of pecan%处理编号Treatment No.各成分的质量分数 Mass fraction of each component蔗糖Sucrose硼酸Boric acid硝酸钙Calcium nitrate聚乙二醇PEG-4000120.0100.02515220.0250.05020320.0400.07525450.0100.05025550.0250.07515650.0400.02520780.0100.07520880.0250.02525980.0400.05015对采用 MTT 染色法、过氧化物酶染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI 染色法、蓝墨水染色法所测花粉活力（表 4）进行比较，结果表明采用过氧化物酶染色法所测 4 个薄壳山核桃品种的花粉活力偏高，采用醋酸洋红染色法所测 4 个品种的花粉活力差异较小。因此筛选出染色效果好的 MTT染色法、I2-KI 染色法和蓝墨水染色法进行下一步 试验。2.2 花粉染色方法优化选择不同浓度的 MTT、I2-KI、蓝墨水染色液对薄壳山核桃花粉活力进行测试，结果如图 2 所示。采用 MTT 染色法进行染色时，MTT 质量分数为 0.1%的条件下所测的花粉活力显著低于 0.3%113第 41 卷经 济 林 研 究和 0.5%的 MTT 条件下所测花粉活力（P 0.05），0.3%和 0.5%质量分数条件下所测花粉活力无显著差异（图 2A）。0.1%质量分数条件下所得深色花粉的比例也显著低于 0.3%和 0.5%质量分数条件下所得深色花粉的比例（图 2B）。因此 MTT 的最适质量分数为 0.3%。采用 I2-KI 染色法进行染色时，0.3%、0.5%和 1.0%质量分数条件下所测花粉活力均无显著差异（图 2C），但是深色花粉的比例在 3 种质量分数的染色溶液染色条件下存在显著差异，表现为 1%质量分数条件下所得深色花粉的比例显著大于 0.5%质量分数条件下所得深色花粉的比例（P 0.05），0.5%质量分数条件下所得深色花粉的比例显著大于 0.3%质量分数条件下所得深色花粉的比例（P 0.05）（图 2D）。鉴于使用 1%的 I2-KI 染色后所有花粉几乎均被染成深色，难以辨别花粉颜色深浅，因此选择适用于薄壳山核桃花粉活力测定的 I2-KI 染色液质量分数为 0.5%。使用蓝墨水法测定花粉活力时，除苏普锐尔外，随着染色液浓度的升高，被染色花粉比例逐渐上升，花粉活力逐渐下降（图 2E），因此蓝墨水染色法也不适用于薄壳山核桃花粉活力的测定。A.TTC 染色法；B.MTT 染色法；C.过氧化物酶染色法；D.I2-KI 染色法；E.醋酸洋红染色法；F.蓝墨水染色法。白色箭头表示无活力花粉，灰色箭头表示有活力花粉，黑色箭头表示被染成深色花粉。A.TTC;B.MTT;C.Peroxide;D.I2-KI;E.Acetic carmine;F.Blue ink dyeing.The white arrow indicates viability,the grey arrow indicates viable pollen,and the black arrow indicates viable pollen with dark staining.图 1 采用不同方法对薄壳山核桃花粉进行染色的效果Fig.1 Effects of different staining methods for pecan pollen表 4 采用不同染色方法测定的薄壳山核桃花粉的活力 Table 4 Comparison of testing methods on the viability of the pollen%编号No.方法Method花粉活力 Pollen viability韦科 Waco苏普锐尔 Superior基奥瓦 Kiowa奥多姆 Odom1MTT 染色法94.901.44 ab92.641.93 b97.161.28 a97.611.00 a2过氧化物酶染色法99.030.71 a99.450.43 a99.360.44 a99.090.56 a3醋酸洋红染色法94.672.00 b97.621.70 a96.411.67 a98.271.40 a4I2-KI 染色法93.322.67 bc93.064.01 b96.271.15 a97.142.11 a5蓝墨水染色法89.131.64 c86.833.78 c90.832.36 b75.162.91 b 数值均为“平均值 标准误”，同列中数据后小写字母表示处理间在 0.05 水平的差异显著性。The values are the mean standard error,and the lowercase letters behind data in a column indicate significance of differences between treatments at 0.05 level.2.3 花粉萌发培养基筛选在不同培养基中薄壳山核桃花粉的萌发率见表 5。从表 5 可以看出，韦科、基奥瓦、奥多姆 3 个薄壳山核桃品种的花粉在 3 号培养基中的萌发率分别为 20.48%、32.17%、47.43%，显著高于在其他 2 种培养基中的萌发率（P 0.05），苏普锐尔花粉在 1 号和 3 号培养基中的萌发率虽然无显著差异，但是均显著高于在 2 号培养基中的萌发率（P 0.05）。总体来说，3 号培养基适宜用于促进 4 个薄壳山核桃品种的花粉萌发，因此在此基础上对薄壳山核桃花粉培养基进行优化。2.4 花粉萌发培养基优化进行L9(34)正交试验，对3号培养基进行优化，试验结果见表 6。由表 6 可知，4 个薄壳山核桃品种的花粉萌发对培养基组分浓度的要求并不完全一致。在处理组合 4 中，韦科、基奥瓦、奥多姆114第 2 期刘 帅，等：薄壳山核桃花粉活力测定方法比较的花粉萌发率分别为 36.80%、46.32%、59.51%，显著高于其他培养基处理组合（P 0.05）。苏普锐尔花粉在处理组合 8 中的萌发率最高，为24.19%。各因素内水平极差反映该因素对试验结果的影响程度，极差越大表明影响越大。对正交试验结果进行极差分析，结果见表 6。由表 6 可知，各因素对韦科花粉萌发率的影响由强到弱依次为 PEG-4000、蔗糖、硝酸钙、硼酸，对苏普锐尔花粉萌发率的影响由强到弱依次为 PEG-4000、硼酸、硝酸钙、蔗糖，对基奥瓦花粉萌发率的影响由强到弱依次为PEG-4000、蔗糖、硼酸、硝酸钙，对奥多姆花粉萌发率的影响由强到弱依次为 PEG-4000、硝酸钙、蔗糖、硼酸。进一步进行方差分析，结果见表 7。由表 7 可知，PEG-4000 对 4 个薄壳山核品种花粉萌发率的影响均达到了显著水平（P 0.05），硼酸对韦科和奥多姆花粉萌发率的影响以及蔗糖和硝酸钙对苏普锐尔花粉萌发率的影响均未达到显著水平（P 0.05）。A.MTT 染色法；B.MTT 染色法；C.I2-KI 染色法；D.I2-KI 染色法；E.蓝墨水染色法。A.MTT;B.MTT;C.I2-KI;D.I2-KI;E.Blue ink dyeing.图 2 不同浓度染色溶液条件下薄壳山核桃的花粉活力Fig.2 Pollen viability of pecan under different concentrations of staining agents表 5 在不同培养基中薄壳山核桃花粉的萌发率Table 5 Pollen germination rate of pecan in different media%培养基编号Medium No.花粉萌发率 Pollen germination rate韦科Waco苏普锐尔Superior基奥瓦Kiowa奥多姆Odom113.425.02 b 17.152.69 a 13.283.05 b 14.233.53 c25.271.87 c 10.912.04 b 9.572.73 c 20.704.34 b320.482.96 a 16.792.67 a 32.173.11 a 47.433.80 a 数值均为“平均值 标准误”，同列中数据后小写字母表示处理间在 0.05 水平的差异显著性。The values are the mean standard error,and the lowercase letters behind data in a column indicate significance of differences between treatments at 0.05 level.115第 41 卷经 济 林 研 究2.5 花粉染色率与萌发率的关系上述结果表明，与花粉萌发率相比，染色法所测花粉活力明显偏高，深色花粉所占比例则与花粉萌发率较为接近。以最适培养基进行培养，采用MTT染色法和I2-KI染色法对花粉进行染色，对 4 个品种花粉萌发率与所染深色花粉的比例进行比较，结果如表 8 所示。与 I2-KI 染色法相比，采用 MTT 染色法所染深色花粉比例更接近花粉萌发率，两者间无显著差异（P 0.05）。表 6 薄壳山核桃花粉萌发 L9(34)正交试验结果及其极差分析结果 Table 6 L9(34)orthogonal test results and range analysis results of pollen germination of pecan%处理编号Treatment No.花粉萌发率 Pollen germination rate韦科 Waco苏普锐尔 Superior基奥瓦 Kiowa奥多姆 Odom16.532.91 def10.424.01 d13.023.46 e26.757.08 c210.882.81 d19.465.06 b30.335.07 c41.465.71 b315.803.90 c13.454.11 cd40.644.73 b38.535.76 b436.805.10 a17.763.85 bc46.324.94 a59.518.92 a59.204.27 de12.803.05 d18.405.24 d10.234.29 d615.754.67 c14.262.60 cd25.803.67 c45.8210.43 b74.330.81 f12.222.60 d14.943.60 de15.933.71 d824.175.16 b24.195.18 a40.613.40 b43.345.18 b94.972.09 ef3.991.05 e10.593.72 e26.798.41 c极差Range蔗糖 Sucrose9.511.478.139.83硼酸 Boric acid3.718.255.025.37硝酸钙 Calcium nitrate7.773.474.4221.02聚乙二醇 PEG-400018.699.4028.5225.87表 7 薄壳山核桃花粉萌发 L9(34)正交试验结果的方差分析结果Table 7 Analysis of variance results of L9(34)orthogonal test results of pollen germination of pecan品种Cultivars来源Source型平方和Type sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareF 值F value显著性Significance韦科Waco蔗糖 Sucrose511.782255.8925.96 0.01硼酸 Boric acid58.68229.342.970.07硝酸钙 Calcium nitrate278.412139.2014.12 0.01聚乙二醇 PEG-40001 736.032868.0188.05 0.01误差 Error177.42189.85总计 Total2 762.3526苏普锐尔Superior蔗糖 Sucrose10.0525.020.520.60硼酸 Boric acid315.012157.5016.41 0.01硝酸钙 Calcium nitrate58.08229.043.020.07聚乙二醇 PEG-4000411.782205.8921.45 0.01误差 Error172.71189.59总计 Total2 762.3526基奥瓦Kiowa蔗糖 Sucrose318.492159.2422.24 0.01硼酸 Boric acid128.77264.388.99 0.01硝酸钙 Calcium nitrate88.97244.486.21 0.01聚乙二醇 PEG-40003 784.8321 892.42264.34 0.01误差 Error128.86187.15总计 Total4 449.9426奥多姆Odom蔗糖 Sucrose458.002229.006.95 0.01硼酸 Boric acid130.41265.201.980.16硝酸钙 Calcium nitrate2 247.4721 123.7334.14 0.01聚乙二醇 PEG-40003 011.5821 505.7945.74 0.01误差 Error592.461832.91总计 Total6 439.9326116第 2 期刘 帅，等：薄壳山核桃花粉活力测定方法比较对采用 MTT 染色法和 I2-KI 染色法所测得的花粉染色率分别与花粉萌发率进行一元线性回归分析，结果如图 3 所示。由图 3 可见，对 4 个薄壳山核桃品种来说，采用 MTT 染色法所测花粉活力与其花粉萌发率有较强的相关性，表现出极显著正相关（R2 0.686，P 0.01），采用 I2-KI染色法所测花粉活力与其花粉萌发率未显示出显著相关性（R2 0.33，P 0.05）。因此，MTT染色法更适合用于检测薄壳山核桃花粉活力。表 8 薄壳山核桃花粉萌发率和采用不同染色方法所染深色花粉的比例 Table 8 The pollen germination rate and the proportion of dark pollen stained by different staining methods%方法Method花粉萌发率或所染深色花粉比例 Pollen germination rate or proportion of dark pollen stained韦科 Waco苏普锐尔 Superior基奥瓦 Kiowa奥多姆 OdomMTT 染色法32.713.59 a25.232.69 a49.872.55 ab56.412.18 abI2-KI 染色法25.685.03 b22.173.38 a52.047.38 a49.0616.56 b离体萌发法36.105.10 a24.195.18 a46.324.94 b59.518.92 a 数值均为“平均值 标准误”，同列中数据后小写字母表示处理间在 0.05 水平的差异显著性。The values are the mean standard error,and the lowercase letters behind data in a column indicate significance of differences between treatments at 0.05 level.A.韦科；B.苏普锐尔；C.基奥瓦；D.奥多姆。A.Waco;B.Surprise;C.Kiowa;D.Odom.图 3 薄壳山核桃花粉萌发率和花粉染色率的一元线性回归结果Fig.3 Single linear regression results of pollen germination rate and pollen staining rate of pecan3 结论与讨论不同品种薄壳山核桃的花粉萌发对培养基的要求并不完全相同，因此测定不同品种的花粉萌发率时应选择适合的培养基。虽然采用 MTT 染色法测得的花粉活力偏高，但 MTT 对花粉的染色率与花粉萌发率有一定程度的相关性，该方法可用于薄壳山核桃花粉活力的快速测定。花粉具有活力是植物完成受精的必要条件，因此授粉前快速准确测定花粉活力是较为重要 的16。染色法是快速测定花粉活力的常用方法，该方法的准确性取决于花粉自身特性，如花粉壁厚度、花粉完整性、酶活性、营养物质等23。TTC 染色法是利用花粉的呼吸作用将 TTC 还原为117第 41 卷经 济 林 研 究红色的三苯基甲酯，从而使花粉着色24，因为有活力的花粉在呼吸过程中可以产生二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐（NADPH2）或者二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）。采用 TTC 染色法测定花粉活力时，无法使薄壳山核桃花粉着色，这可能是由于花粉粒结构特殊，或是测定条件不适宜，具体原因有待进一步研究。类似研究结果表明，采用 TTC 染色法不能测定杜鹃25、卵叶海桑26、核桃27等植物的花粉活力。花粉萌发培养基的组分对花粉萌发率的影响较大28-29。本研究中选择了 3 种培养基来检测薄壳山核桃花粉的萌发情况，结果表明 5%蔗糖0.025%硼酸 0.05%硝酸钙 20%PEG-4000 培养基21对促进 4 个薄壳山核桃品种花粉萌发更有效。蔗糖不仅参与花粉萌发过程中的渗透压调节，还可为花粉萌发提供营养30。硼能促进糖的吸收、转运和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，并参与果胶物质的合成，被认为是参与花粉萌发及花粉管生长的关键物质31。钙是花粉管极性生长不可缺少的物质，适量浓度的钙能促进花粉萌发及花粉管生长32-33。PEG-4000 作为一种高分子渗透剂，常被用于原生质体融合，在花粉萌发中能使花粉内膜结构发生变化，改变膜表面的电荷构成，使膜的柔软程度和通透性提高，从而促进花粉萌发和花粉管生长30。在对培养基的进一步优化过程中发现，4 个薄壳山核桃品种花粉对培养基组分的要求并不完全相同，这可能是品种间基因型差异造成的。在对枣花粉的研究中，胡琼等34发现不同枣品种花粉萌发对培养基中硼酸及蔗糖的浓度具有选择性。本研究中 4 个薄壳山核桃品种的花粉萌发率差异较大，这可能是基因型以及采集花粉时间不同造成的。植物的不同品种因遗传背景不同，其花粉活力也会存在差异22。另外，采集花粉时间不同，品种间花粉的成熟度可能并不相同，因此花粉活力也会存在差异35。通过各种方法所测定的花粉活力，直接反映了花粉的代谢情况或营养物质含量，但不能直接表现花粉的萌发率36。本研究中采用染色法测得的花粉活力均明显高于离体萌发法测得的花粉萌发率。可能是因为被染色花粉并不一定具有可育性或可萌性，部分花粉虽然能够被染色，但不能萌发18。另外，可能是因为所筛选出的培养基以及培养条件并非最适条件，使得花粉萌发率低于采用染色法测得的花粉活力37。值得注意的是，与 I2-KI 染色法相比，采用 MTT 染色法所染深色花粉比例更接近花粉萌发率。尽管目前尚不清楚花粉染色深度与花粉活力之间的关系，但是这与板栗和锥栗的相关研究结果一致38。本研究中采用 I2-KI 染色法所染色花粉比例与花粉萌发率的相关性较低，可能是因为 I2-KI 染色溶液主要依靠花粉中的淀粉染色，无活力的花粉也会被染色39。与 I2-KI 染色法相比，采用 MTT 染色法所染色花粉比例与花粉萌发率呈线性相关，MTT 染色法更适用于薄壳山核桃花粉活力的快速测定。目前，MTT 染色法已被证明适用于多种植物花粉活力的测定，且在杜鹃花属25和板栗38等植物的研究中发现采用该方法所测花粉活力与采用离体萌发法所测定结果的相关性显著。本研究中采用正交试验筛选出了适宜不同品种薄壳山核桃花粉萌发的培养基，然而花粉萌发还与培养温度、培养湿度、光照等环境因素有关，后续有待进一步研究。另外，薄壳山核桃花期不遇，测定花粉活力主要是为了方便人工授粉及杂交育种，因此薄壳山核桃花粉的最佳储藏条件以及储藏过程中花粉活力变化及其生理机制将是下一步研究的重点。参考文献：1 何旭东,郑纪伟,田雪瑶,等.薄壳山核桃品种亲缘关系分析与指纹图谱构建 J.林业科学研究,2021,34(4):95-102.HE X D,ZHENG J W,TIAN X Y,et al.Genetic relationship analysis and fingerprint construction of Carya illinoensis varietiesJ.Forest Research,2021,34(4):95-102.2 鲍佳书,汤玉洁,刘俊萍,等.不同品种薄壳山核桃林地土壤微生物多样性及群落组