白化菠萝蜜茎2个蛋白激酶和4个转录因子家族分析.pdf

热带亚热带植物学报 2023,31(4):521 530 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2022-01-24 接受日期接受日期:2022-05-17 基金项目基金项目:海南省自然科学基金项目(319MS017)；海南大学科研启动基金项目(kyqd1620)；海南大学国家级大学生创新创业训练计划项目(SA2000008501,SA2100001230)资助 This work was supported by the Project for Natural Science in Hainan(Grant No.319MS017),the Project for Scientific Research Startup in Hainan University(Grant No.kyqd1620),and the Project for National Innovation and Entrepreneurship Training of Hainan University(Grant No.SA2000008501,SA2100001230).作者简介:张水仙(1999 年生)，本科，研究方向为野生动物与自然保护区管理。E-mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail: 白化菠萝蜜茎白化菠萝蜜茎2个蛋白激酶和个蛋白激酶和4个转录因子家族分析个转录因子家族分析 张水仙1a,王紫璇1a,谢柳青1b,于旭东1a,蔡泽坪1a*,罗佳佳1b,2(1.海南大学,a.林学院,热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室;b.热带作物学院,海口 570228;2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海口 571101)摘要：摘要：为探究蛋白激酶(PKs)和转录因子(TFs)在白化菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)幼苗茎次生生长中的表达变化，基于转录组数据对其差异表达基因(DEGs)进行预测及分类，并对挑选出的 2 个 PKs 和 4 个 TFs 家族构建系统进化树。结果表明,胞质类受体激酶(RLCK)-VIII 家族的 DEGs 上下调表达各 4 个，亮氨酸富集重复类受体激酶(LRR-RLK)-X 家族 Xa 和 Xb-2 分支中的 DEGs 均下调表达，Xb-1 中的均上调，TCP 家族的 20 个 DEGs 中有 15 个上调表达，zf-HD 和 GRF 家族中的大多数DEGs 上调表达，Alfin-like 家族中的 DEGs 均下调表达。因此，这表明 6 个家族可能在菠萝蜜茎的次生生长过程和应对非生物胁迫中发挥重要作用。关键词：关键词：菠萝蜜；茎；蛋白激酶；转录因子 doi:10.11926/jtsb.4619 Analysis on 2 Protein Kinases and 4 Transcription Factors Families in Albino Artocarpus heterophyllus Stems ZHANG Shuixian1a,WANG Zixuan1a,XIE Liuqing1b,YU Xudong1a,CAI Zeping1a*,LUO Jiajia1b,2(1a.Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants,Ministry of Education,College of Forestry;1b.College of Tropical Crops,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China)Abstract:Protein kinases(PKs)and transcription factors(TFs)are important components of signal transduction,which are involved in the secondary growth of stems.To explore their expression changes in stem secondary growth of albino Artocarpus heterophyllus seedlings,the differentially expressed genes(DEGs)of PKs and TFs were predicted and classified based on transcriptome data,and phylogenetic trees were constructed for 2 PKs and 4 TFs families.The results show that the number of up-and down-regulated DEGs in the receptor-like cytoplasmic kinase(RLCK)-VIII family was 4 each.All of DEGs in Xa and Xb-2 branches in leucine-rich repeat receptor kinase(LRR-RLk)-X family were down-regulated,while those in Xb-1 branch were up-regulated.Among 20 DEGs in TCP family,15 were up-regulated in AAS.And most genes in zf-HD and GRF families were up-regulated,while all DEGs in Alfin-like were down-regulated in AAS.Therefore,it was suggested that six families might play an important role in the secondary growth of A.heterophyllus stems and the response to abiotic stress.Key words:Artocarpus heterophyllus;Stem;Protein kinase;Transcription factor 522 热带亚热带植物学报 第 31 卷 茎的次生生长是树木茎增粗的主要方式，包括次生木质部和次生韧皮部的形成等一系列过程，与木材形成密切相关1。近年来，植物茎次生生长的研究主要在杨属(Populus)植物中开展。Dharma-wardhana 等2研究表明，胡杨(P.trichocarpa)部分转录因子(transcription factors,TFs)基因上调表达与茎的次生生长相关，对其生长速度、木材质量等方面起促进作用。Seyfferth 等3确定了白杨(Temulus tremula)转录组中与木材相关的基因，并探究了木材形成中与乙烯相关的基因表达网络，然而目前的研究集中在杨属等速生树种。蛋白激酶(protein kinases,PKs)在细胞信号转导中发挥重要作用，其主要通过使底物蛋白磷酸化的方式将信号逐级放大从而引起细胞反应4。植物类受体激酶(receptor-like kinases,RLKs)是 PKs 中重要的一类。RLKs 定位在细胞膜上，典型的 RLKs 调控机制为信号分子与其胞外结构域特异性结合后,激活胞内激酶域进而实现跨膜信号的传导5。茎的次生生长主要依赖于形成层的活动，Agusti 等6通过反向遗传学分析确定了拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的RLK基因AtRUL1和AtMOL1以相反的作用调节形成层的活动。TFs 作为一类反式作用因子，能与启动子区域的顺式作用元件特异性结合，调控基因表达7。有研究表明，POPCORONA(PtPCN)转录因子在杨树茎的次生生长过程中能够调控细胞的分化8，PtNAC、PtbZIP 等转录因子与胡杨茎的次生生长密切相关9。PtGRF9 转录因子通过调节毛果杨(P.trichocarpa)细胞壁的生物合成，进而调控茎的次生生长10。但相关研究大多在正常植株中开展，对白化突变体茎次生生长中 PKs 和 TFs 的研究还鲜见报道。菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)是优质的木材树种，能够带来良好的经济效益。白化突变体已被运用在杂交育种、分子标记等诸多方面。本课题组前期考察中发现了白化菠萝蜜苗(albino Artocarpus heterophyllus seedling,AAS)，并对其次生生长茎进行了结构解剖观察，其次生木质部、次生韧皮部及周皮的厚度均减小11，且次生木质部导管和次生韧皮部筛管的孔径和面积减小，密度增大12，这说明白化现象对菠萝蜜茎的次生生长具有负面影响。然而在细胞信号转导中起重要作用的PKs和TFs基因表达如何变化还需深入分析。因此，本研究对白化菠萝蜜苗次生生长茎中PKs 和 TFs 的差异表达基因(DEGs)进行预测及分类,并通过构建系统进化树等方法对挑选出的 2 个 PKs和4个TFs家族进行分析，为研究植物白化对茎PKs和 TFs 的影响提供参考。1 材料和方法 1.1 材料材料 菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)采自海南省儋州市海南大学儋州校区。菠萝蜜母株具有隐性的白化突变，且子代能分离出白化(AAS)和正常幼苗13，以分离出的正常幼苗作为对照(CK)。将萌发 40 d 的 AAS与CK 次生生长茎置于液氮中速冻保存(196),送华大基因公司进行 RNA 提取、文库构建和测序。1.2 转录组数据来源转录组数据来源 次生生长茎DEGs的编码序列(coding sequence,CDS)、蛋白序列及基因表达量(fragments per kilo-base million,FPKM)从谢柳青等14获取，SRA 数据库登录号为 PRJNA611876。43 881 个 DEGs 的表达差异均在 2 倍以上，且 Q-value0.001。1.3 菠萝蜜菠萝蜜 PKs 和和 TFs 预测预测 将菠萝蜜DEGs的CDS上传到ITAK(http:/ PKs 和 TFs预测。对预测结果进行统计，分析 PKs 和 TFs 家族中上下调基因的数量并绘制柱状图。1.4 多序列比对及系统进化树的构建多序列比对及系统进化树的构建 拟南芥蛋白序列或基因信息从TAIR(https:/www.arabidopsis.org/)数据库获得。进化树的构建采用MEGA 6.05 软件，用 Clustal W 将拟南芥和菠萝蜜蛋白进行多序列比对。以邻接法(neighbor-joining,NJ)建树，设置 Boot-strap 为 1 000，模式为 Poisson model，缺口设为 Pairwise deletion。1.5 各家族各家族 DEGs 的表达分析的表达分析 通过在线网站 Expression Heatmapper(http:/www2.heatmapper.ca/expression/)将样品的FPKM进行可视化处理。采用 Row Z-score 标准化方法绘制热图。2 结果和分析 2.1 PKs 和和 TFs 的数量和长度的数量和长度 本研究选取前期研究14得到的43 881个DEGs,对其中 PKs 和 TFs 相关基因进行分析。结果表明,第 4 期 张水仙等:白化菠萝蜜茎 2 个蛋白激酶和 4 个转录因子家族分析 523 PKs 中上、下调 DEGs 分别为 517 和 873 个，其中 26个(IV)仅在 AAS 中表达，67 个(I)仅在 CK 中表达。TFs 中上、下调 DEGs 分别为 865 和 773 个，其中 34个(IV)仅在 AAS 中表达，43 个(I)仅在 CK 中表达(图1:A,B)。仅在 AAS 中表达的 PKs 和 TFs 基因长度中位数均最小，分别为 2 262 和 1 251.5 bp(图 1:C,D)。图 1 PKs 和 TFs 中 DEGs 数量(A,B)和长度(C,D)。I:仅在 CK 中表达;II:CK 和 AAS 共有且在 AAS 中上调表达;III:CK 与 AAS 共有且在 AAS 中下调表达;IV:仅在 AAS 中表达。Fig.1 Number(A,B)and length(C,D)of DEGs in PKs and TFs.I:Only expressed in CK;II:Common in CK and AAS and up-regulated in AAS;III:Common in CK and AAS and down-regulated in AAS;IV:Only expressed in AAS.2.2 PKs 和和 TFs 家族分类和基因数量家族分类和基因数量 在预测的 1 390 个 PKs DEGs 中，RLK 超家族有 747 个，占 53.74%，其中 RLCK-RLK、LRR-RLK的 DEGs 数量较多，共有 390 个，占 RLK 总数的52.21%(图 2:A)。根据蛋白序列(下同)，RLCK-RLK的 DEGs 被划分为 12 个亚家族，RLCK-RLK-VIIa-2的数量最多(51 个)，RLCK-RLK-VIII 是 DEGs 上下调表达各占 50%的 4 个家族中基因数最多的，且其亚组内基因表达差异明显(图 2:B)。LRR-RLK 的DEGs 被划分为 14 个亚家族，LRR-RLK-XI-1 中的数量最多(43 个)，以上调表达的居多。而 LRR-RLK-Xa和LRR-RLK-Xb-2的DEGs均下调表达(图2:C)。在预测的 1 638 个 TFs DEGs 中，上调表达(865 个)比下调表达(773 个)的多。且有 11 个家族中上调的DEGs 均超过 70%，其中 TCP 中的 DEGs 数量最多(20 个)，且大多数上调表达。zf-HD 中上调的 DEGs占总数的 92.31%，GRF 中的均上调表达。此外,有6 个家族中下调的 DEGs 数量超过各自所含总数的70%，其中Alfin-like中的DEGs均下调表达(图2:D)。综上，预测到 RLCK-RLK-VIII、LRR-RLK-X、TCP、zf-HD、GRF 和 Alfin-like 中的 DEGs 数量相对较多，且这6个家族中的DEGs上下调表达差异显著(或亚组内基因表达差异明显)，故选择其进行后续分析。2.3 RLCK-RLK-VIII 和和 LRR-RLK-X 受体激酶家族分析受体激酶家族分析 RLCK-VIII 家族中共预测到 8 个 DEGs，主要聚于2个分支，其中，CL5339.C5、CL5339.C6、CL5339.C7、CL5339.C9、CL5339.C17 与 AtCARK6、AT3G59350聚为一支，除 CL5339.C17 外的 DEGs 均在 AAS 中下调表达。而另一支中的 CL4080.C2、CL4080.C6、524 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 2 不同家族中的 DEGs 数量。A:PKs 家族;B:RLCK-RLK 家族;C:LRR-RLK 家族;D:TFs 家族。Fig.2 Number of DEGs in different families.A:PKs family;B:RLCK-RLK family;C:LRR-RLK family;D:TFs family.第 4 期 张水仙等:白化菠萝蜜茎 2 个蛋白激酶和 4 个转录因子家族分析 525 CL4080.C7 均上调表达(图3:A,B)。I 分支中的RLCK-RLK-VIII基因家族成员DEGs在AAS中下调表达的居多，而 II 分支中则均上调表达。对预测的 LRR-RLK DEGs 进行分析，结果表明，在 LRR-RLK-Xa 中，CL13534.C1、CL13534.C4、CL13534.C2、CL13534.C5、CL5687.C1、CL5687.C6与AtBIR1为同源基因，且均在AAS中下调表达。在LRR-RLK-Xb-1 中，CL8679.C4、CL8679.C2、CL8679.C1、CL8679.C3 与 AtBRL2 为直系同源基因，且均上调表达。CL1221.C22、UG47918、CL10364.C2 分别与 AtEMS1、AtPSY1R、AtNILR1 为直系同源基因,CL1221.C22、UG47918 上调表达，而 CL10364.C2下调表达，且被认为属于 RLK-LRR-Xb-2。UG10544和 UG10746 与 AT5G42440 聚为一支，均下调表达(图 3:C,D)。表达分析表明，LRR-RLK-Xa 和 LRR-RLK-Xb-2 中的 DEGs 均下调表达，而 LRR-RLK-Xb-1 的均上调表达。2.4 TCP 和和 zf-HD 转录因子家族分析转录因子家族分析 TCP 家族同源性分析结果表明(图 4)，AAS 中TCP家族的 DEGs 与 PCF 和 CIN 2 个亚家族的相关基因同源性更高，而在 TB1/CYC 亚家族中不存在DEGs。有 12 个 DEGs 存在于 PCF 中，8 个 DEGs 图 3 菠萝蜜和拟南芥的 RLCK-VIII(A)、LRR-RLK-X(C)家族系统进化树和菠萝蜜 DEGs 表达(B,D)分析 Fig.3 Phylogenetic tree of RLCK-VIII(A)and LRR-RLK-X(C)families in Artocarpus heterophyllus and Arabidopsis thaliana and DEGs expression(B,D)in A.heterophyllus 526 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 4 菠萝蜜和拟南芥的 TCP(A)、zf-HD(C)家族系统进化树及菠萝蜜 DEGs 表达(B,D)分析 Fig.4 Phylogenetic tree of TCP(A)and zf-HD(C)families in Artocarpus heterophyllus and Arabidopsis thaliana and DEGs expression(B,D)in A.heterophyllus 第 4 期 张水仙等:白化菠萝蜜茎 2 个蛋白激酶和 4 个转录因子家族分析 527 存在于 CIN 中(图 4:A)。在 PCF 中，CL24002.C2、CL24002.C3、CL24002.C1、UG25783、CL5449.C3、CL5449.C1、CL5449.C2 与 AtTCP15 聚为一支且置信度高于 95%,均在 AAS 中上调表达。UG18242、CL3514.C10 分别与 AtTCP8、AtTCP9 为直系同源基因，UG18242 在 AAS 中上调表达，CL3514.C10 则下调表达。UG26677、UG85106、CL5100.C5 与 AtTCP6、AtTCP20 亲缘关系最近，且均下调表达。总体而言，PCF 中的 DEGs 上调表达的居多；在 CIN 中，除CL14468.C1 外均在 AAS 中上调表达。CL25353.C2、CL9344.C2、CL9344.C3、CL14468.C1 与 AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10 聚为一个大的分支。CL20939.C2、CL20939.C1、UG18998 与AtTCP24、AtTCP2 为同源基因，UG35483 与 AtTCP13 为直系同源基因(图 4:A,B)。表达分析表明，大多数DEGs 在AAS 中上调表达。zf-HD 家族中共预测到 13 个 DEGs，主要聚于4 个分支，其中CL25814.C2、UG31074、CL14682.C4、CL14682.C5、CL14682.C3、CL14682.C6 与 AtHB23、AtHB34、AtHB30 聚于一支，除 CL14682.C6 外均在AAS中上调表达。CL14549.C1、CL14549.C2与AtHB24为同源基因，UG11668、UG21337、CL13985.C1、UG19232 与 AtHB25、AtHB22 聚于一大支，且除CL13985.C1 外均在 AAS 中上调表达。CL12783.C1与 AtMIF2 为直系同源基因，并与 AtMIF1 和 AtMIF3聚于一大支，且下调表达(图 4:C,D)。表达分析表明，DEGs 在 AAS 中上调表达的居多。2.5 GRF 和和 Alfin-like 转录因子家族分析转录因子家族分析 从图 5:A,B 可见，GRF 家族中共预测到 7 个DEGs，主要分布在 I、III 和 IV 分支中,其中 UG18693与 AtGRF2、AtGRF1 为同源基因。CL13839.C2 与 图 5 菠萝蜜和拟南芥的 GRF(A)、Alfin-lik(C)家族系统进化树及菠萝蜜 DEGs 表达(B,D)分析 Fig.5 Phylogenetic tree of GRF(A)and Alfin-lik(C)families in Artocarpus heterophyllus and Arabidopsis thaliana and DEGs expression(B,D)in A.heterophyllus 528 热带亚热带植物学报 第 31 卷 AtGRF3、AtGRF4 聚为一支。IV 分支中CL13507.C1、CL13507.C2、UG40918、CL13507.C3、UG40920 与AtGRF7、AtGRF8 亲缘关系较近。表达分析表明,除CL13507.C3 和 UG40920 外均在 AAS 中上调表达。在 AAS 中，Alfin-like 家族的 DEGs 仅存在于第I 和 IV 分支中。CL4364.C5 与 AtAL7、AtAL6 高度同源，UG11526、UG30907、CL6395.C1、UG10716 与AtAL4 聚为一支，且置信度大于 75%。表达分析表明，这 5 个 DEGs 均在 AAS 中下调表达(图 5:C,D)。3 结论和讨论 Pittermann 等15的研究表明，白化北美红杉(Sequioa sempervirens)茎的木质部结构较柔弱，且光合作用能力的丧失导致茎木质部发育迟缓。王开荣16研究了 7 种白化茶的生长发育过程，白化茶的茎次生生长受到不同程度的抑制，白化程度最高的白叶茶 1 号地径最小。董俊娜等11报道 AAS 茎发育不良，其茎粗小于正常植株。这说明白化现象不利于茎的次生生长。RLCK 家族中的第 VIII 亚家族与脱落酸(abscisic acid,ABA)的调控密切相关，AtCARK6 是胞质 ABA受体激酶的成员之一17。AtCARK6 在拟南芥的 ABA信号传导中起着积极的作用，可通过提高细胞对ABA 的敏感性，从而增强植物抗旱等抗环境胁迫的能力18。而 AAS 中与 AtCARK6 同源的 5 个 DEGs中有 4 个下调表达，可能是其茎的次生生长过程对ABA 不敏感的原因。由此推测 RLK-RLCK-VIII 亚家族可能通过ABA途径调控菠萝蜜茎的次生生长。LRR-RLK 是 RLK 中最大的一个家族，几乎在植物生长发育的所有过程中发挥重要的调控作用19。Costa 等20的研究表明，LRR-RLK 中的一些基因(SlSOBIR1 来自 AtSOBIR1)在感染病毒的番茄(Lyco-persicon esculentum)叶中下调表达。AtBIR1 是第 X家族成员之一，Gao 等21报道，敲除 AtBIR1 会导致拟南芥细胞死亡。AAS 生长到 40 d 时，茎变黄变褐甚至衰老死亡，这可能与 AtBIR1 同源的 6 个DEGs 均下调表达有关。油菜素甾醇是木质部发育的调节因子22。AtBRI1、AtBRL1 和 AtBRL3 是 BR信号的受体23，AAS 中与其同源的 5 个 DEGs 均上调，这可能是茎木质部发育受到影响的原因。TCP 是转录因子中的一个大家族。其中,AtTCP14和 AtTCP15 在植物生长发育、生物胁迫等方面发挥作用24。Li 等25检测了 AtTCP15 在拟南芥根、茎、叶和花等器官中的表达，其在茎中的表达量较高。Lopez 等26认为 AtTCP14、AtTCP15 在植物免疫中发挥作用。AAS 中与 AtTCP14 和 AtTCP15 同源的7 个 DEGs 均上调表达，这可能使茎次生生长的发育和免疫功能受到影响。此外，有研究表明 AtTCP3过表达会降低植物对生长素(IAA)的敏感性27。而AAS中与AtTCP3同源的3个DEGs均上调表达,这可能是其对 IAA 的敏感性降低的原因之一。zf-HD家族是陆生植物所特有的一类转录因子,在植物生长发育过程中发挥作用，如响应逆境胁迫、调控花的发育以及种子的寿命等28。Bueso 等29研究表明拟南芥中的 AtHB25 转录因子能够诱导赤霉素(GA)生物合成酶基因 GA3OX2 的表达，从而使具有生物活性的 GA 含量提高，AAS 中与 AtHB25同源的4个DEGs均上调可能会改变GA的含量,使茎的次生生长受到一定影响。AtHB33 的表达可促进细胞的增殖30，AAS 中与 AtHB33 同源的 2 个 DEGs均上调可能会促进茎中细胞的增殖。GRF 是一类植物所特有的转录因子，主要功能是调控植物器官或组织的发育31。有研究表明，辣椒(Capsicum annuum)幼苗经 GA 处理后，CaGRF4的表达受到抑制32。而 AAS 中与 AtGRF4 同源的 2个 DEGs 均上调，可能是对 GA 敏感性降低所导致的结果。Wang 等33报道 BR 信号能促进 AtGRF7和 AtGRF8 的表达，调控黄化苗的转绿。AAS 中与AtGRF7 和 AtGRF8 同源的 5 个 DEGs 均上调，这与AAS 的 BRI1 同源基因上调表达相一致，预示 AAS茎中 BR 信号可能有所增强，从而导致 GRF 的表达发生上调。Alfin-like(AL)是植物特有的小型基因家族，在非生物胁迫反应中起作用34。在拟南芥中，ABA可诱导 AtAL5 基因的表达，且 AtAL5 的高表达使植物对盐分、干旱及低温胁迫的耐受性增强从而提高植物的抗逆性35。而 AAS 中与 AtAL5 同源的 4 个DEGs均下调，可能是ABA含量较低所造成的结果。综上，本研究通过预测 AAS 次生生长茎中 PKs和TFs 的DEGs，结果表明，RLCK-VIII、LRR-RLK-X、TCP、zf-HD、GRF 和 Alfin-like 中的 DEGs 上、下调表达差异显著且数量均较多，这 6 个家族可能分别通过调控 ABA 途径、影响茎木质部发育、降低IAA 敏感性、促进茎细胞增殖、增强茎 BR 信号、降低 ABA 含量的方式调控光合作用下菠萝蜜茎的次第 4 期 张水仙等:白化菠萝蜜茎 2 个蛋白激酶和 4 个转录因子家族分析 529 生生长，但具体机制还有待进一步探索。参考文献参考文献 1 YIN S G.Functional analysis of LBD21-31 gene in regulating stem secondary growth of Populous D.Taian:Shandong Agricultural University,2020.殷时光.LBD21-31 基因调控杨树茎干次生生长的功能分析 D.泰安:山东农业大学,2020.doi:10.27277/ki.gs dnu.2020.000488.2 DHARMAWARDHANA P,BRUNNER A M,STRAUSS S H.Genome-wide transcriptome analysis of the transition from primary to secondary stem development in Populus trichocarpa J.BMC 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