HPLC法测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的不确定度评.pdf

CEREAL&FOODINDUSTRYVol.30,2023,No.4粮食与食品工业Cereal and Food Industry标准与检测HPLC法测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的不确定度评陈润霖，杨眉*，业润泽，宋明雄，周伟玉溪市粮食质量监测中心（玉溪6 53 10 0)摘要：在能力验证试验中，采用液相色谱法，依据GB5009.209一2 0 16 食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定条件测定玉米赤霉烯酮含量，按照JJF1059.1一2 0 12 测量不确定度评定与表示要求，对此分析过程建立数学模型，确定各不确定度分量来源并量化，形成HPLC法测定玉米赤霉烯酮含量的测量不确定度评定方法。结果显示：玉米粉中玉米赤霉烯酮含量为103.44g/kg，其扩展不确定度为15.98 g/kg（p=95%，k=2），不确定度的来源中，回收率影响因素最大，其次为标准工作溶液的配制过程和测量重复性。关键词：玉米赤霉烯酮；HPLC法；不确定度中图分类号：TS201Evaluation of uncertainty on determination of zearalenone文献标识码：Ain corn flour by HPLC method文章编号：16 7 2-50 2 6(2 0 2 3)0 4-0 59-0 5Chen Runlin,Yang Mei,Ye Runze,Song Mingxiong,Zhou WeiYuxi Grain Quality Monitoring Center(Yuxi 653100)Abstract:In the capability verification,determination of zearalenone content in corn floursamples was determined by liquid chromatography according to GB 5009.209-2016.According tothe requirements of JJF 1059.1-2012,a mathematical model is established for this analysisprocess to determine the source of each uncertainty component and quantify it.The uncertainty e-valuation method for the determination of zearalenone content by HPLC method was formed.Theresults showed that the content of zearalenone in corn flour was 103.44 g/kg,which expandeduncertainty is 15.98 g/kg(p=95%,k=2).The primary sources of uncertainty are recovery,preparation of standard working solution and measurement repeatability.Key words:zearalenone;high performance liquid chromatography;uncertainty玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN)，又名 F2毒素，是由多种镰刀菌产生的霉菌毒素，从有赤霉病的玉米中分离得到,具有多种毒性和致癌性1-2 ,被列人致癌物清单，为世界卫生组织（WHO)国际癌收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 6作者简介：陈润霖，女，1994年出生，助理工程师，主要从事粮油质量安全检验工作。*通讯作者：杨眉，女，198 8 年出生，工程师，主要从事粮油质量安全检验工作。症研究机构确立名录物质3 。玉米赤霉烯酮在玉米、小麦等谷物产品中污染风险较大，造成粮食、饲料行业存储经济损失4-5。在人体中具有食物链传递的累积性，会损害机体细胞免疫功能，诱发肿瘤，威胁人类健康6 。在粮油样品中主要规定了谷物及其制品的限量要求为质量含量不超过6 0 g/kg7。当前主要的含量检测方法有高效液相色谱法 、液相色谱-质谱联用法、ELISA酶联免疫吸附试剂59标准与检测盒法10 、荧光光度计法11、胶体金快速定量法12 等。本试验基于能力验证中测定玉米粉中玉米赤霉烯酮含量的数据，系统的进行不确定评定13-14，为采用HPLC法测定玉米赤霉烯酮含量的检测结果的准确度评价提供依据。1材料与方法1.1试剂与仪器试验用样品为国家粮食和物资储备局标准质量管理办公室下发的玉米粉中玉米赤霉烯酮比对样品；甲醇、乙腈，色谱纯，美国ThermoFisher公司；氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为超纯水，上海优普实业超纯水机UPK/UPT制取；提取液：乙腈+水=90+10（体积比）；玉米赤霉烯酮标准溶液，50 g/mL，坛墨质检科技股份有限公司；玉米全粉中玉米赤霉烯酮，7 0 g/kg，证书编号GBW(E)100385，国家粮食和物资储备局科学研究院；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，3 mL，北京华安麦科生物技术有限公司。Ultimate3000型高效液相色谱仪，配荧光检测器，美国ThermoFisher公司FotectorPlus型全自动固相萃取仪，睿科集团（厦门)股份有限公司；Au-toEVA6 0 型全自动平行浓缩仪，睿科集团（厦门）股份有限公司；XB4200C型半微量电子天平，瑞士普利赛斯公司；HMGWX 型涡旋仪，北京美正检测技术有限公司。1.2试验方法1.2.1标准工作溶液配制标准中间液制备：准确吸取50 g/mL玉米赤霉烯酮标准溶液2 0 L，用初始流动相配制成1000 ng/mL的标准中间液。标准系列工作溶液配制：准确移取前述标准中间液，用流动相溶液稀释，配制成10 ng/mL、20 ng/mL、50 n g/m L、8 0 n g/m L、10 0 n g/m L、200ng/mL的标准系列工作液，现配现用。1.2.2样品前处理依据GB5009.2092016简化如图1所示15。74g氯化钠遇旋混包。过涵0 mL滤游m水至50 mL容量,40g样品100mL提取液1 mL流动相待测复溶氮吹浓缩图1样品前处理流程图60陈润霖等：HPLC法测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的不确定度评1.2.3色谱条件液相色谱柱：赛默飞AcclaimTM120C18(4.6mm250mm，粒径5m）；流动相，乙腈+水+甲醇=46+46+8（体积比）；流速1mL/min；柱温40；进样量10 0 L；检测波长，激发波长274 nm,发射波长 440 nm15。2约结果与讨论2.1数学模型的建立测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的含量，采用外标法定量，测量不确定度评定数学模型为：X=CXVX1.000m1 000R.式中：X为ZEN最终含量，g/kg;C为待测液中ZEN的浓度，ng/mL;V为浓缩后复溶体积，mL；m为玉米粉称样量，g；f=50/40,稀释倍数；R。为回收率。2.2不确定度来源分析在测定过程中，依据JJF1059.1一2 0 12 测量不确定度评定与表示分析16 ，不确定度来源主要为：测量重复性引入的不确定度；样品称量引人的不确定度；前处理过程体积引人的不确定度；标准溶液配制引入的不确定度；回收率引人的不确定度；标准曲线拟合引入的不确定度。由于使用能力验证样品，其均匀性因素可忽略。不确定度因果图如图2 所示。测量重复性人员操作仪器稳定性允差天平允差温度样品称量样品前处理线性拟合图2 不确定度来源因果关系图2.3标准测量不确定度的评定2.3.1测量重复性引入的不确定度测量重复性为A类标准不确定度，主要受实验人员操作和仪器稳定性的影响。对样品进行6 次重复测定，测定结果见表1，依据贝塞尔公式，其不确瓶定容、过滤芯定度17 为：100mL滤液s()ZEN免疫亲和柱固相萃取仪，回复率标准浓度允差温度V12(2-2)_3.54u(rep)=/nNn(n-1)i1.45 g/kg标准溶液配制玉米赤霉烯酮含量的不确定度V6假定溶液膨胀符合矩形分布k=3，则温度变化引人的不确定度为：u（V io 0 m l）=3 1.25 10*100=0.217 mL。粮食与食品工业Cereal and Food IndustryU(rep)1.45Urel(rep)=0.014 0103.44表1样品测定结果表浓度(C)含量(X)试验号/(ng/mL)183.1400284.1369387.5400481.1347580.6696679.90442.3.2样品称量引入的不确定度使用分辨力为0.0 1g的天平称样40.0 1g（扣除皮重后称重），检定分度值e=0.1g，最大允许误差MPE=土0.5e=0.05g，假定为矩形分布，置信因子k=V3，样品称量的相对标准不确定度为：0.05urel(m)=40.01/32.3.3前处理过程引入的不确定度(1)前处理过程使用10 0 mL大肚移液管移取90%乙腈水的提取液1次，其不确定度主要有2个来源：移液管容积的不确定度：依据GB/T12808一2 0 15实验室玻璃仪器单标线吸量管、JJG196一2 0 0 6 常用玻璃量器，给出的容量允差为0.080mL，假定为矩形分布k=/，则ui（V10 0 mL）0.0802=0.046 mL。V3玻璃量器体积容量允差次数urel(V)A级单标100 mL 0.080 mL线吸量管A级50 mL 0.05 mL容量瓶A级单标10mL 0.020 mL线吸量管移液器10 0 0 L10L2.3.4标准溶液引入的不确定度（1）标准溶液浓度的不确定度使用商品化标准储备溶液，标物证书表明标准值为50 g/mL,扩展不确定度为5%（k=2),其相对标准不确定度为：Vol.30,2023,No.4实验室温度变化引入的不确定度：实验室温度变化范围由空调控制在（2 0 3）间，量取溶液的体积膨胀系数明显大于玻璃量器自身容积的膨胀平均含量系数，因此温度对移液管自身容积的影响不作考虑。/(g/kg)(X)/(g/kg)103.92105.17109.42101.42100.8499.88=7.22 104表2 前处理过程引入的不确定度分量一览表校准不确定度体积不确定度溶液类型体胀系数次数10.00046290%乙腈-水1.2 510=310.00057718%乙腈-水4.1910-410.001 15990%乙腈-水1.2 510-310.001 1518%乙腈-水4.19 10-410.005 77103.44流动相8.23 10-4url(C)=2X50（2）标准储备液配制的不确定度配制10 0 0 ng/mL的标准储备液，使用2 0 L、1000L移液枪，依据JG6462006移液器检定规程要求，其最大允许误差为分别为4.0%、61V3因此，10 0 mL移液管引人的相对标准不确定度为：um(V o mL)=V0.046*+0.217=0.002 22100(2)使用10 mLA级单标线吸量管分取样品溶液，移取溶液类型为90%乙腈水的混合溶液；使用50 mLA级容量瓶1次，定容后溶液类型为18%乙腈水的混合溶液；再用10 mLA级单标线吸量管分取样品溶液，移取溶液类型为18%乙腈一水的混合溶液；最后用10 0 0 L移液枪吸取体积比为乙腈+水+甲醇=46+46+8 的流动相混合溶液定容样品检测液。上述玻璃量器及移液器引人的不确定度分量量化计算与10 0 mL移液管同理，依据GB/T12806一2011实验室玻璃仪器单标线容量瓶、GB/T12808一2 0 15实验室玻璃仪器单标线吸量管、JJG646一2 0 0 6 移液器检定规程要求，假定为矩形分布k=/3,其相对标准不确定度如表2 所示。综上，前处理过程引人的合成相对标准不确定度为:ure(样)=0.0 0 7 0 1合成相对标准不确定度Urel(T)Urel10.002 1717.26 10-410.002 1717.26 10-410.001 430.05=5.00 10-4urel(总）)0.002 229.27 10-40.002 460.001 360.005 950.007 01标准与检测1.0%，按三角分布k=V6计算其体积引人的相对.0.04标准不确定度为：0.016 3,V因此，配制标准储备液的合成相对标准不确定度为：urml(C,)=V0.016 3+0.004 082=0.016 8（3）标准工作溶液配制的不确定度使用2 0 0 L、10 0 0 L移液枪，最大允许误差分别为1.5%、1.0%，配制成10 ng/mL、20 ng/mL、50 n g/m L、8 0 n g/m L、10 0 n g/m L、200ng/mL的标准工作液，按三角分布k=V6计算合成相对标准不确定度为：(0.015)Urel(C,)=V6因此，标准溶液配制引人的合成相对标准不确定度为：uml)(c)=/(5.00 10-*)+0.016 82+0.018 02=0.024.62.3.5回收率引入的不确定度测定标示值为7 0 g/kg的玉米粉中玉米赤霉烯酮质控样品6 次，结果见表3。表3 回收率测定结果表含量(X)回收率平均含量平均回收率试验号/(g/kg)179.08280.97379.84480.24579.37679.61回收率的不确定度为：U(Rec)=S(Re)一0.009 7Z=0.003 96u(Rec)0.003 96urel(Rec)=0.003 47R1.141平均回收率需进行显著性差异评价，采用t检验，由JJF1059.1一2 0 12 测量不确定度评定与表示查表得：取置信度=95%16 1，自由度=n-1=5下的双侧临界值t(95%,5）=2.57。=11-R.L11-1.141s(Rec)/n0.0097/6Umel=um(rep)+u(m)+uu(样)+umu(C)+u(co)+um(Rec)=0.077 2合成标准不确定度为：62陈润霖等：HPLC法测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的不确定度评因此该回收率与1具有显著性差异，回收率引0.01入的不确定度需要作为不确定度分量，但测定标准=0.004 08,中未要求使用回收率修正测定结果，所以回收率引人的相对合成不确定度为：Urel(Rec)(1-1.141)VV31.1412.3.6标准曲线拟合引入的不确定度对6 个浓度标准溶液、3 次平行测定数据进行(0.01)线性拟合，浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，最=0.018 06(Rec)/%(X)/(g/kg)113.0115.7114.1114.6113.4113.71-R2+u(R)R+0.003 962=0.071 4小二乘法拟合结果为A=ac+b=1451.7c-1267，R=0.9999，（A 为峰面积，c为标液浓度，a为斜率，b为截距），测定数据见表4。标准曲线拟合引人的相对不确定度为：S1+1+(c样-c)Urel(co)=axc样A;-(1 451.7c;-1 267)0.002 39 S=607.74(Rec)/%式中：S为标准溶液峰面积残差的标准差；C样为样品溶液测定浓度，C样=8 2.7 5ng/mL；p 为样品平行测定次数，p=6；n 为标准溶液的总测定次数，79.85114.1=5.022.57=Pn2(c;-)2i=1n-2n=63=18;c为标准溶液的平均值，c=76.67ng/mL；c；为标准溶液浓度。表4标准工作溶液测定数据表CA1014 380.414.279.414 211.02028 042.15069 124.480112 170.3100140 902.5146 508.1200285730.3297 877.92.4合合成标准不确定度综合上述评定结果，所涉及不确定度分量见表5，相对合成标准不确定度为：u。=u r l X =0.0 7 7 2 10 3.44=7.99二A2A;28 968.428 909.472.370.769 686.8114 962.2112 864.5143 361.4286 213.0289.940.4A14 290.328 640.070.394.0113 332.3143.590.6粮食与食品工业Cereal and Food Industry表5不确定度分量一览表不确定度来源分量urel(rep)Uri(m)urel(样)urel(C)urel(Rec)urel(C)2.5扩展不确定度取置信水平为95%，包含因子k=216，扩展不确定度为:U=ku.=27.99=15.98 g/kg玉米赤霉烯酮含量表示为：X=（10 3.4415.98)g/kg;k=23结论本文建立了采用HPLC法测定玉米粉中玉米赤霉烯酮的不确定度的评定方法，对各不确定度分量进行分析，数据显示，不确定度的主要来源是回收率、标准系列工作溶液的配制和最终结果的测量重复性。因此,在日常检测工作中应确保HPLC性能的稳定性，做好维护保养；合理设置标准工作溶液的梯度，增加平行测定次数；注意实验操作的精细化程度，降低人为误差干扰。参考文献1 邓桃，袁青松，周涛，等.中药材中玉米赤霉烯酮毒素污染现状及其脱毒研究进展J.安徽农业科学，2022,50(16):5-9.2闫昭明，陈清华，陈凤鸣玉米赤霉烯酮毒性研究J.动物营养学报，2 0 18,3 0（9）：3 453-3 458.3张文燕.潜伏在玉米中的危险分子J.食品与健康，2018(8):10-11.4赵飞.高效液相色谱法测定小麦粉中玉米赤霉烯酮的Vol.30,2023,No.4不确定度评定J.现代食品，2 0 2 1（14）：13 7-141.5刘晨，谢岩黎，曹荣耀，等玉米赤霉烯酮降解菌的筛类型urel测量重复性A0.014 0样品称量B7.22 10-4样品前处理B0.007 01标准溶液配制B0.024 6回收率A0.0714标准曲线拟合A0.002 39贡献率/%11.660.605.8420.4859.441.99选、鉴定及降解酶初步提取J.现代食品科技，2 0 2 2，3 8(8):73 79.6王序，卢迪莎，曾道平，等时间分辨荧光免疫层析法定量检测谷物中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留J.现代食品科技，2 0 2 1,3 7（4）：2 52-2 6 1.7GB27612017,食品安全国家标准食品中真菌毒素限量S.8王燕，林明娥。免疫亲和柱一高效液相色谱法测定食品中玉米赤霉烯酮的含量J.食品安全导刊，2 0 2 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