濒危药用植物大花杓兰地下芽的组织培养.pdf

2023 年 7 月 热 带 农 业 科 学热 带 农 业 科 学 第 43 卷第 7 期 Jul.2023 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE Vol.43,No.7 收稿日期 2022-11-30；修回日期 2022-12-16 基金项目 山西省中医药管理局项目（No.2020ZYYC002）；山西中医药大学青苗项目（No.2018PY-017）。第一作者 郭鹏媛（1996），女，硕士研究生，主要研究方向为中药资源保护，E-mail：。通讯作者 樊杰（1972），女，博士，副教授，主要研究方向为中药资源保护，E-mail：。濒危药用植物大花杓兰地下芽的组织培养 郭鹏媛 李冲冲 周悦 樊杰（山西中医药大学中药与食品工程学院 山西晋中 030619）摘 要 为有效提高大花杓兰地下芽的成活率，优化其生长条件，以大花杓兰花期、果期和休眠期的地下芽为材料，在单因素试验的基础上，通过 L9（34）正交试验对组织培养方法进行优化，探索培养基、6-BA、NAA 和 pH 对大花杓兰地下芽成活率的影响。结果表明：休眠期微剥鳞叶芽成活率优于花期和果期的成活率，最高达 84.44%；地下芽成活率影响因素主次顺序为培养基6-BANAApH；大花杓兰地下芽的最佳培养基为 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+pH 6，其成活率高达 73.33%，且地下芽生长状态良好，苗株健康。优化后的组织培养方法能显著提高大花杓兰地下芽成活率，为大花杓兰苗株大规模培养提供理论参考。关键词 大花杓兰；地下芽；组织培养；单因素试验；正交设计 中图分类号 S682.31 文献标识码 A DOI:10.12008/j.issn.1009-2196.2023.07.005 Tissue Culture of Underground Buds of the Endangered Medicinal Plant Cypripedium macranthos Sw GUO Pengyuan LI Chongchong ZHOU Yue FAN Jie(School of Chinese Medicine and Food Engineering,Shanxi University of Chinese Medicine,Jinzhong,Shanxi 030619,China)Abstract To effectively improve the survival rate and growth conditions of the underground buds of Cypripedium macranthos Sw,the tissue culture method was optimized by L9(34)orthogonal test based on a single-factor experiment,and the effects of medium,6-BA,NAA,and pH on the survival rate of underground buds of C.macranthos Sw were explored.The results showed that the sur-vival rate of micro-scaly leaf buds in the dormant stage was better than that at the flowering and fruit stages,up to 84.44%.The pri-mary and secondary factors influencing the survival rate of underground buds were the medium 6-BANAA pH.The best medium for underground buds of C.macranthos Sw was MS+1.0 mgL1 6-BA+0.1 mgL1 NAA+pH 6,and the survival rate was as high as 73.33%,the underground buds were in good condition and the seedlings were healthy.The optimized tissue culture method can sig-nificantly improve its survival rate,which provides a theoretical reference for the large-scale cultivation of plants of C.macranthos Sw.Keywords Cypripedium macranthos Sw;underground buds;tissue culture;univariate testing;orthogonal design 大花杓兰（Cypripedium macranthos Sw）隶属于兰科杓兰属，是多年生草本植物，生于海拔4002 400 m 的林下、林缘或草坡上腐殖质丰富和排水良好之地，如中国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东和台湾等地；花瓣披针形，唇瓣深囊状，囊口较小，外观独特，花色多变，具有很高的观赏价值和经济价值,是国际著名的切花品种，还具有活血祛瘀、利尿消肿、祛风镇痛的药用价值1。由于长期的滥采乱挖，造成种群被严重破坏和野生资源减少；同时，由于大花杓兰种子没有胚乳，自然繁殖率低，萌发困难，导致该物种野生种群资源减少，处于严重濒危状态，被国家列为濒危保护植物2。因此，开展大花杓兰的组织培养研究显得尤为重要。植物组织培养是保护濒危植物的有效途径之一。近年来，关于大花杓兰的相关研究逐渐增多。王艳丽等3以大花杓兰的种子为试验材料，研究了不同培养基及激素对种子萌发的影响，深入探索原球茎的诱导与分化、移栽等的条件。另外，有研究以大花杓兰不同发育阶段的种子为材料，探索基本培养基、激素浓度以及添加物等因素对大花杓兰种子萌发的影响，并筛选出最佳萌发条2023 年 7 月 热带农业科学 第 43 卷第 7 期 -32-件，成功使大花杓兰种子萌发4-5。有研究发现，以大白花杓兰的叶片为外植体，通过改良诱导培养基中的无机盐浓度，可满足大白花杓兰叶片细胞分化的需要，大幅提高了利用大白花杓兰叶片诱导再生植株的成功率6。以上研究多以大花杓兰种子和杓兰属其他植物为试验材料开展相关试验，而关于大花杓兰地下芽组织培养方面的研究未见报道。因此，为了提高大花杓兰的成活率，缩短组织培养周期，本试验以大花杓兰花期、果期、休眠期地下芽为外植体，对其进行灭菌处理，获得无菌芽，通过单因素试验和正交试验研究培养基、6-BA、NAA 和 pH 对地下芽成活率的影响，筛选出最佳培养基配方。研究不同条件对大花杓兰地下芽组织培养的影响，旨在为后续的培养提供充足的实验材料，对大花杓兰组培快繁有重要意义。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试材 取山西省五台山生长良好的大花杓兰植物的地下芽作为试验材料。1.1.2 实验仪器及试药 高压灭菌锅（四川高能科迪仪器有限公司）；超净台（苏州凯德乐金属科技有限公司）；人工气候箱（上海川宏实验仪器有限公司）；培养瓶，75%乙醇，1%氯化汞，0.5%的次氯酸钠、无菌水，萘乙酸（NAA）（连云港连和花卉科技有限公司）；6-苄基腺嘌吟（6-BA）（北京索莱宝科技有限公司）。1.2 方法 1.2.1 地下芽灭菌剂的选择 选择幼嫩健康的大花杓兰地下芽7，用清水把采集的地下芽洗净，剥去外面 1 至数层鳞片；用毛刷蘸取洗涤液仔细清洗每一个地下芽，置于流水下冲洗 30 min，后置于超净工作台进行外植体的表面消毒。首先将地下芽在 75%乙醇中浸泡 30 s，用无菌水冲洗 3次；分别采用 0.1%的 HgCl2和 0.5%的 NaClO 两种灭菌剂对大花杓兰地下芽消毒 5、7、10、12、15 min，并分别比较 2 种灭菌剂的消毒效果，筛选出最佳消毒条件；用无菌水冲洗 5 次，放在滤纸上吸干表面水分备用，将处理好的外植体接种到培养基上。每个处理接 15 瓶，每瓶接种 1 个无菌芽，3 次重复；置于(252)、光强 1 500 lx、pH 为 6.0 条件下培养；在培养的第 10 天，统计污染率。污染率污染的芽数/接种的总芽数100%1.2.2 外植体选择 分别选取大花杓兰花期、果期和休眠期的地下芽，并将花期、果期和休眠期的地下芽做 3 种不同程度的处理，即剥鳞叶（剥去外面所有的黑色鳞叶）、微剥鳞叶（剥去外面一层鳞叶）、不剥鳞叶（去泥土中取出，未作鳞叶处理）；然后接种到 MS 培养基上，每个处理接 15瓶，每瓶接种 1 个无菌芽，3 次重复；置于(252)、光强 1 500 lx 条件下培养，通过观察地下芽的成活率和褐化率来初步筛选合适的外植体。成活率=诱导出芽苗数/未污染的接种数100%褐化率=褐化的芽苗数/接种的总芽数100%1.2.3 单因素试验 将处理好的大花杓兰地下芽分别接种于培养基（MS、Y1、VWD），添加不同浓度 6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)和 NAA(0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L)，调节 pH 值（5.4、5.6、5.8、6.0、6.2），每个处理 15 瓶，每瓶接种 1 个，3 次重复；随时观察其生长状况，45 d 后，统计大花杓兰地下芽成活率。1.2.4 正交试验设计 根据单因素试验结果选取培养基、6-BA、NAA 和 pH 作为正交试验的 4 个因素，分别为培养基（Y1、MS、VWD）、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）、pH（5.6、5.8、6.0），设置 4 因素 3 水平 L9（34）正交试验，每个处理 15 瓶，每瓶接种 1 个，3 次重复；培养 45 d 以后统计地下芽成活率，根据成活率选择适合大花杓兰地下芽的培养条件。表 1 正交试验因素与水平 水平培养基(A)6-BA(B)/(mgL1)NAA（C）/(mgL1)pH(D)1VWD0.5 0.1 5.6 2Y1 1.0 0.2 5.8 3MS 1.5 0.3 6.0 注：Y1 培养基为专利中的可再生植株诱导培养基6。1.2.5 数据分析 数据采用办公软件 Excel 2019 和统计分析软件 SPSS 26.0 对数据进行处理和分析。2 结果与分析 2.1 消毒剂的选择 以大花杓兰地下芽为外植体材料，采用 2 种 郭鹏媛 等 濒危药用植物大花杓兰地下芽组织培养 -33-消毒试剂、不同消毒时长进行消毒处理，培养 10 d后记录外植体的污染情况。由图 1 可知，随着消毒时间的增加，大花杓兰地下芽组织培养污染率呈下降的趋势。用 0.1%HgCl2消毒 5 min 时，污染率高达 91.11%，污染率显著高于其他处理；消毒 15 min 时，污染率为 4.47%。0.5%NaClO 消毒5 min 时污染率最高，为 97.78%；消毒时间为15 min 时，污染率为 10%。可以明显看出，2 种消毒剂处理时间越长，地下芽被消毒越彻底，但同时外植体也越容易受消毒剂毒害，导致成活率下降，0.1%HgCl2消毒效果优于 0.5%NaClO，污染率低。综合考虑，选择 0.1%HgCl2消毒为 10 min最适合，污染率较小，为 17.78%，且生长状态最好。图 1 不同消毒时间的外植体污染率 2.2 外植体选择 花期、果期和休眠期的地下芽成活率和褐化率见图 2，处理和接种情况见图 3-a、3-b。从成活率来看，休眠期的微剥鳞叶芽成活率最高，可达84.44%；其次是果期、花期。从褐化率来看，花期的剥鳞叶芽褐化率最高，为 91.11%；其次是果期、休眠期。以 MS 培养基为例，25 d 左右，地下芽开始萌发（图 3-c），芽顶端变绿；35 d 后，芽顶端长出绿色嫩叶（图 3-d）；45 d 左右，芽长成植株，13 片绿色叶片，茎秆粗壮。从不同时期的地下芽分析，休眠期的成活率最高，褐化率低；花期的成活率最低，褐化率最高。最佳外植体为休眠期微剥鳞叶的地下芽。2.3 单因素试验 从图 4 可知，VWD、Y1、MS 三种培养基的成活率分别为 13.33%、48.89%和 75.56%。地下 图 2 花期、果期、休眠期地下芽不同处理的 成活率、褐化率 a.地下芽处理；b.地下芽接种；c.地下芽萌发；d.长出嫩叶的地下芽。图 3 大花杓兰组织培养过程的不同阶段 2023 年 7 月 热带农业科学 第 43 卷第 7 期 -34-图 4 单因素试验结果 芽在 MS 培养基中可长成健壮的完整植株，叶片舒展，深绿色（图 5-a）；在 Y1 培养基长成的植株较为健壮，叶片较小，颜色较浅（图 5-b）；VWD培养基中的植株较弱，叶片皱缩不健康（图 5-c）。在不同浓度的生长调节剂 6-BA 处理下，成活率分别为 44.44%、77.78%、60.00%、33.33%；在不同浓度生长调节剂 NAA 处理下，成活率分别为37.77%、75.55%、55.55%、28.89%。随着 6-BA和 NAA 浓度增加，成活率在不断增加，当 6-BA浓度到达 1.0 mg/L 和 NAA 达到 0.1 mg/L 时，成活率开始呈下降趋势。在 pH 为 6.0 时，成活率最高，达 75.55%；pH 为 5.4 时，成活率最低，为15.55%。2.4 正交试验 从 k 值（表 2）大小可以看出，大花杓兰地下芽培养过程中，适宜培养基为 MS 培养基，6-BA 的适宜浓度为1.0 mg/L，NAA的适宜浓度为0.1 mg/L，pH 为 6.0。正交试验结果显示，其中 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH 为 6.0 时的成活率最高，为 73.33%。从极差 R 分析结果可知，R培养基R6-BA RNAARpH，因素 A（培养基）的极差最大，因素D（pH）的极差最小。在 2 种激素对比下，适量 a.MS 培养基；b.Y1 培养基；c.VWD 培养基。图 5 不同培养基大花杓兰地下芽的生长情况 郭鹏媛 等 濒危药用植物大花杓兰地下芽组织培养 -35-表 2 正交试验结果分析 因素 序号 A(培养基)B(6-BA)C(NAA)D(pH)平均成活率/%1 1 1 1 1(24.453.85)d 2 1 2 2 2(35.553.85)c 3 1 3 3 3(17.783.85)d 4 2 1 2 3(42.223.85)b 5 2 2 3 1(64.443.85)a 6 2 3 1 2(26.676.66)d 7 3 1 3 2(68.8813.87)a 8 3 2 1 3(73.336.66)a 9 3 3 2 1(35.553.85)b k1 25.927 45.183 41.483 41.480 k2 44.443 57.773 37.773 43.700 k3 59.253 26.667 50.367 44.443 R 33.326 31.106 12.594 2.963 注：平均污染率为（平均值标准偏差）；同列数据后不同小写字母表示差异显著（p果期花期。通过该方法培养出的植株叶片浓绿，长势健壮。相比前人的研究结果，本试验采用大花杓兰地下芽诱导成苗，极大地提高了大花杓兰外植体组织培养的成活率，且具有不受外界环境气候影响、取材方便、成长周期短、方法先进等优势。下一步将对该品种生根培养进行系统研究，为大花杓兰组培的系统研究提供实验思路及数据支持。参考文献 1 付亚娟,乔洁,侯晓强.珍稀濒危药用植物大花杓兰的研究现状J.江苏农业科学,2015,43(10):328-331.2 纪玉山,孙立娟,王红.敦化地区大花杓兰资源调查及人工栽培技术研究J.特种经济动植物,2017,20(12):22-24.3 王艳丽,林昊,赵洪颜,等.大花杓兰的组织培养与快速繁殖J.植物生理学通讯,2009,45(2):155-156.4 朴仁哲,王艳丽,赵洪颜.濒危植物大花杓兰种子离体培养条件初探J.安徽农业科学,2011,39(30):18 428-18 429+18 445.5 邓莲,张毓,王苗苗,等.濒危兰科植物大花杓兰种子非共生萌发的研究J.种子,2012,31(6):31-34+39.6 黑龙江省林业科学研究所.一种大白花杓兰叶片愈伤组织再生植株诱导培养基:CN201710001334.4P.2017-05-24.7 王 长 宝,徐 增 奇,王 鹤,等.濒 危 植 物 大 花 杓 兰(Cypripedium 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