mRNA疫苗的研究及应用进展.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 492 498Current Biotechnology ISSN 20952341进展评述进展评述ReviewsmRNA疫苗的研究及应用进展蔚丹1，马云龙1，万方1*，武建强2*1.内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010010；2.内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010107摘要：与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有高效、安全、低成本等优点，但它的应用一直受到体内传递不稳定、翻译效率较低等技术问题的限制。新型冠状病毒的流行及其疫苗的研发加速了mRNA疫苗的研发和批准，特别是在mRNA结构修饰及脂质纳米颗粒构建等方面有了突破性进展，如使用优化后核苷、帽子结构的mRNA疫苗稳定性大大提高，替换低使用频率的密码子可提高其翻译效率等。目前常用的mRNA递送系统有脂质纳米颗粒、聚合物载体、类病毒载体等。综述了mRNA疫苗的发展历程、作用机制、修饰技术突破和递送系统方面的研究及应用进展，以期促进mRNA疫苗的深入研究及应用。关键词：mRNA疫苗；作用机制；递送系统DOI：10.19586/j.20952341.2023.0015 中图分类号：Q812，R373 文献标志码：AAdvances on Research and Application of mRNA VaccinesYU Dan1，MA Yunlong1，WAN Fang1*，WU Jianqiang2*1.Faculty of Life Science，Inner Mongolia Agricultural University，Huhehot 010010，China；2.College of Basic Medicine，Inner Mongolia Medical University，Huhehot 010107，ChinaAbstract：Compared with traditional vaccines，mRNA vaccines have the advantages of high efficiency，safety and low cost，but its application has been limited by technical problems such as unstable in vivo delivery and low translation efficiency.The prevalence of SARS-CoV-2 virus and their vaccine development have accelerated the development and approval of mRNA vaccines，especially breakthroughs in mRNA structural modification and construction of lipid nanoparticles，for example，the stability of mRNA vaccines using optimized nucleoside and cap structures is greatly improved，and the replacement of codons with low frequency of use can improve their translation efficiency.The commonly used mRNA delivery systems are lipid nanoparticles，polymer vectors，virus-like vectors，etc.The research and application progress of development history，mechanism of action，technological breakthroughs in modification，and delivery systems of mRNA vaccines were reviewed in order to promote the in-depth research and application of mRNA vaccines.Key words：mRNA vaccine；mechanism of action；delivery systemmRNA疫苗是一种通过体外转录技术合成后选择合适的递送系统将mRNA运输进入机体，依靠细胞自身的翻译系统将 mRNA 翻译成目标蛋白，从而达到临床治疗目的的先进疗法1。早在1961年就有科学家发现了mRNA，但由于自身不稳定且缺少高效的递送载体，mRNA疫苗的发展较缓慢。在最近的研究中，Karik等2使用假尿苷代替尿苷来合成mRNA，不仅可以避免不良的免疫反应，还可以提高分子稳定性和蛋白质产量。2019年新型冠状病毒肺炎疫情爆发，Moderna和BioNTech 公司的 mRNA 新冠疫苗通过了美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administra收稿日期：20230213；接受日期：20230331联系方式：蔚丹E-mail:；*通信作者 万方E-mail：；武建强 E-mail：蔚丹，等：mRNA疫苗的研究及应用进展tion，FDA）的紧急授权并开始免疫接种，这些临床应用方面的重大进展激起了mRNA疫苗的研究热潮。虽然mRNA疫苗的生产技术、有效性还需进一步研究，但由于其自身优势，在未来的疾病预防及治疗领域将占据一席之地。1mRNA疫苗的简介1.1mRNA疫苗的概况mRNA疫苗是基于mRNA指导蛋白合成的特性，在体外设计合成的含有编码特定抗原的mRNA序列，经过必要的修饰和纯化等加工，通过不同的方式递送至人体细胞内，直接翻译产生抗原蛋白，模拟病毒感染并引发机体产生特异性免疫反应。与亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗相比，mRNA疫苗有以下优点：在安全性方面，mRNA是非感染性、非整合性的，不存在潜在的感染或插入突变风险；在疗效方面，各种修饰使mRNA更加稳定，使用阳离子脂质体（lipid nano-particles，LNPs）将其包裹，可以实现高效的体内递送，使其快速进入抗原递呈细胞并表达；在生产方面，由于体外转录反应产率较高，mRNA疫苗具有快速、经济和规模化生产的潜力3。1.2mRNA疫苗的发展历程目前，由于mRNA疫苗的大规模应用，关于这项技术起源的争论愈演愈烈，事实上这项技术是30多年来数百名研究人员的工作成果。1961年，加州理工学院科学家首次成功提取到 mRNA。1990年，Wolff等4将含有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和-半乳糖苷酶基因的RNA和DNA表达载体分别注射到体内小鼠骨骼肌中，并在肌肉细胞中检测到了它们的表达。1992年，科学家将来自正常大鼠下丘脑细胞中的mRNA注射到患有尿崩症大鼠的下丘脑中，在注射后数小时内观察到尿崩症的暂时逆转5。1995年，研究人员将癌胚抗原基因注射入小鼠肌肉作为癌症疫苗 6。2002年，Heiser等7 发现编码前列腺特异性抗原的mRNA转染的树突细胞（dendritic cell，DC）能够在体外有效地刺激T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，并进行了临床试验。2005年，匈牙利生物化学家Karik2 发现在mRNA中掺入修饰的核苷（m5C、m6A、m5U、s2U或假尿苷）后抑制了RNA激活DCs的潜力，即降低了mRNA在体内的免疫原性。2009年，Weide等8将鱼精蛋白-mRNA疫苗成功注射至黑色素瘤患者体内，并证明这是安全可行的。2017年，Sahin等9证明了通过RNA新表位疫苗靶向个体癌症突变的临床可行性、安全性和抗肿瘤活性。2019年，新型冠状病毒肺炎疫情爆发，多种 mRNA 疫苗作为新型冠状病毒疫苗获得紧急授权并投入使用10，如Moderna公司的mRNA-4157和BioNTech公司的BNT122，在全球掀起了新一轮mRNA研究的热潮。1.3mRNA疫苗的作用机制在疫苗接种过程中，mRNA疫苗在抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）中表达抗原，促进APC活化并诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫11-12。抗原递呈细胞包括树突状细胞、单核-巨噬细胞、B淋巴细胞等。mRNA疫苗引发免疫反应的过程如图1所示。2mRNA疫苗的修饰虽然mRNA早在1961年被科学家发现，但由于其稳定性和翻译效率较低、免疫原性较高等原因，相关研究进展较缓慢，可通过优化mRNA的序列和结构来提高其稳定性和翻译效率，通过修饰核苷酸来降低其免疫原性。2.15Cap结构的修饰Cap 结构位于 mRNA 的 5端，由甲基化的鸟苷酸（m7G）经焦磷酸化后与mRNA的5端核苷酸相连，在体内转录时，传统的 Cap 结构有 Cap0（m7GpppXpYp）、Cap1（m7GpppXmpYp）、Cap2（m7GpppXmpYmp）3种。它与翻译水平密切相关，当mRNA到达细胞质时，Cap与Poly A尾发生协同作用，与翻译起始因子4F（eIF4F）形成稳定的闭环结构13，促进翻译起始，在mRNA翻译中发挥重要作用。此外，对mRNA进行加帽后，可使5端的末端游离磷酸基团缺失，进而不被碱性磷酸酶降解，并且Cap1和Cap2 mRNA核苷酸上的甲基能够将磷酸酯键上游离的2OH基团封闭，不会被RNA酶降解14，因此Cap结构对mRNA有保护作用。目前有2种加帽方法。转录后加帽（酶法加帽）。使用专门的酶对来自体外转录的mRNA进行加帽反应，例如工业上常使用的牛痘病毒加帽酶（vac-cinia virus capping enzyme，VCE），它将m7G封端至mRNA的5端。此方法加帽效率较高，493生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology但可能会造成5端产物的异质性。共转录加帽。在 T7 聚合酶反应的同时，使用抗逆转帽类似物（anti-reverse cap analogues，ARCA）进行共转录加帽。ARCA是一种帽状二聚体，此方法操作简单，但在转录反应中，体外转录的原料GTP会与ARCA产生竞争，因此该方法的加帽效率仅能达到80%。2.2密码子的优化原始编码区的密码子在体内可合成氨基酸，但一部分密码子的翻译效率不高，因此可以参照密码子使用频率表（表1）将使用频率较低的密码子替换，提高密码子的翻译效率15-16。有研究表明，将第3位是A、U的密码子替换为第3位是G、C的密码子17-18，降低U的含量可降低mRNA在体内的免疫原性，也可提高所使用密码子的翻译水平，但 GC含量不是越高越好。此外，应排除编码区序列中含有的酶切位点，防止后续的酶切反应破坏编码序列。2.3UTR的修饰5端UTR含有与mRNA转运和翻译相关的调控序列，可抑制核酸外切酶对mRNA的降解，同时能够与内部核糖体的位点相结合19。在5UTR中加入的Kozak序列（G/ANNATGG）可与翻译起始因子结合避免错误起始，提高mRNA的翻译效率20。3UTR 除抑制核酸外切酶对 mRNA 的降解外，还可与Poly A尾发挥协同作用来提高mRNA注：注射的mRNA疫苗被抗原呈递细胞或肿瘤细胞内吞。mRNA脱离内体进入细胞质后，被核糖体翻译成蛋白质，翻译的抗原蛋白可用于刺激免疫系统。经过翻译的抗原蛋白被蛋白酶体复合物分解成更小的片段，这些片段通过组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)类蛋白形成复合物，在细胞表面递呈给细胞毒性T细胞。活化的细胞毒性T细胞通过分泌细胞因子，如穿孔素、颗粒酶等，杀死感染细胞。mRNA也可与肿瘤细胞膜融合后进入细胞，表达为蛋白质，细胞裂解后释放出大量抗原。分泌的抗原可以被APC摄取，在内体中降解，并与MHC 类蛋白形成复合物pMHC，在细胞表面呈现给辅助性T细胞。辅助性T细胞识别pMHC并通过刺激B细胞产生特异性的中和抗体，通过炎症细胞因子激活吞噬细胞，如巨噬细胞等，促进病原体的清除。图1mRNA疫苗引发免疫反应的过程图Fig.1Process of mRNA vaccineinduced immune response表1密码子使用频率Table 1Codon usage frequency密码子UUU FUUC FUUA LUUG LCUU LCUC LCUA LCUG LAUU IAUC IAUA IAUG MGUU VGUC VGUA VGUG V频率/10317.620.37.712.913.219.67.239.616.020.87.522.011.014.57.128.1密码子UCU SUCC SUCA SUCG SCCU PCCC PCCA PCCG PACU TACC TACA TACG TGCU AGCC AGCA AGCG A频率/10315.217.712.24.417.519.816.96.913.118.915.16.118.427.715.87.4密码子UAU YUAC YUAA*UAG*CAU HCAC HCAA QCAG QAAU NAAC NAAA KAAG KGAU DGAC DGAA EGAG E频率/10312.215.30.80.810.915.112.334.217.019.124.431.921.825.129.039.6494蔚丹，等：mRNA疫苗的研究及应用进展疫苗的稳定性和翻译效率。也有研究表明，使用人类和球蛋白的3UTR可增强mRNA的稳定性和翻译效率21。2.4Poly A尾的修饰真核生物中mRNA添加Poly A尾是一个默认的过程，几乎所有真核生物的mRNA通过转录后修饰，都会获得100150个碱基的Poly A尾，它在发育和细胞周期期间受到动态调节22，不同长度的Poly A尾有助于调节mRNA的稳定性、运输和翻译效率23。在缺少ATP的情况下，可以使用T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）对带有3磷酸的 mRNA 进行末端修复。当 mRNA 到达细胞质，Poly A尾与5Cap发生协同作用，通过形成mRNA 闭环模型促进翻译起始24。此外，Poly A尾有助于mRNA从核到细胞质的转运及延长半衰期、增加佐剂效应。目前有2种加尾方法。DNA模板含Poly A尾。转录模板中加入100150 bp碱基A，在细菌培养等过程中可能会发生突变导致Poly A减少，破坏编码序列，可使用A30-linker-A70增加稳定性18。酶法加尾。体外转录后使用Poly A聚合酶完成，通过调整反应时间和酶用量来控制碱基 A 的数量，操作简便，但得到的Poly A的数量不稳定。2.5核苷酸的修饰体外转录mRNA的免疫原性较高是一个亟待解决的问题，免疫细胞可被体外转录的mRNA激活并诱导Toll样受体引起炎症反应25，从而被免疫系统清除。有研究发现，体外转录的mRNA用假尿苷（）、N1-甲基-假尿苷（m1）或5-甲氧基尿苷（5 moU）代替尿苷可以增强其翻译效率并降低免疫原性。假尿苷是由尿苷通过碱基异构化反应衍生的，其中核碱基围绕N3C6轴旋转180，导致核碱基-糖键发生变化（从N1C1键变为C5C1键），由此产生的CC键能够使核碱基更自由地旋转，假尿苷也可像尿苷一样与腺苷进行碱基配对，但假尿苷可以通过改善碱基配对、碱基堆叠和主链稳定性来改变mRNA结构（图2）。N1-甲基-假尿苷和假尿苷具有一个关键的共同特征，即C5C1键，它有助于改善碱基配对、碱基堆叠和双链稳定性26-27。与尿苷相比，N1-甲基-假尿苷与A配对具有更高的亲和力，从而实现更有效地翻译28-29；也有研究者发现，可以用N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）代替天然腺苷，m6A是大多数真核生物中mRNA和长链非编码RNA最丰富的内部修饰元件，它和mRNA的稳定性、剪接加工及翻译有关30-31。此外，还可用5-甲基胞苷（m5C）代替天然胞苷，m5C已在各种代表性生物的mRNA、rRNA和tRNA中发现。作为可逆的表观遗传修饰，m5C修饰可增强mRNA的稳定性，促进剪接和核质运输等32-33。Yamamoto等34 发现使用25%5-甲基胞苷和25%2-硫尿苷分别代替胞苷和尿苷的效果更好。Andries等29 发现m1和m5C联合使用的效果优于只使用假尿苷或5-甲基胞苷。无论是体内试验还是体外实验都表明，替换后的核苷酸在有效降低mRNA免疫原性的同时，显著提高了翻译效率。3mRNA疫苗的递送系统mRNA进入细胞并成功表达后，易被RNA酶降解，因此需使用能够抵御降解的载体来递送mRNA。目前，已经开发了多种递送载体，如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物载体、病毒载体类病毒载体等。3.1LNPLNPs递送系统主要由阳离子脂质体和其他辅助脂质体组成，阳离子脂质体与带负电的mRNA结合，可实现较高的包载效果，形成直径小于200 nm的复合物，在体内由低密度脂蛋白介导的胞吞机制可使纳米粒子成功被细胞摄取，进而实现良好的细胞摄取效果。LNP可以在内核中携带mRNA并避免RNA酶的降解，LNP的亲脂性可使它和细胞膜融合，完成mRNA的递送。3.2鱼精蛋白鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，主要在鱼类成熟精子的细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在。鱼精蛋白也是一种天然的阳离子蛋白，与带负电的mRNA络合成纳米级别的核酸颗粒，保护其不被降解35。但由于鱼精蛋白与mRNA结合的较紧密，使它在体内的表达效率降低，因此鱼精蛋白使用率较低。3.3聚合物载体常用的聚合物递送载体有聚酰胺、聚氨基酯和聚乙烯亚胺等，其中聚乙烯亚胺的应用较广泛。由于聚合物载体的不良反应较强，且和mRNA结合比较紧密，因此使用率也较低。此外，Prieve等36 发495生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology明了一种新的递送技术结合脂质和聚合物颗粒来递送mRNA，这种递送载体包含聚合物胶束和LNP 2种纳米粒子，其中聚合物胶束以肝细胞为靶点，促进mRNA在内体中的释放并产生特异性蛋白质。3.4病毒载体一些正链RNA病毒，如甲病毒属（辛德华斯病毒、福斯特病毒）、小核糖核酸病毒、黄病毒、仙台病毒等可携带目的基因进入人体细胞核，可用于mRNA的递送。3.5类病毒载体已有研究人员开发了工程化无DNA类病毒颗粒（virus-like particles，eVLP），这种类病毒颗粒在逆转录病毒的基础上做了大量改造和优化，以解决包装、递送和释放中存在的问题。它能够在人类细胞、多种小鼠器官和组织（如肝脏、大脑、眼睛）中进行有效的基因编辑37。eVLP是由病毒蛋白组装而成的小颗粒，可模拟病毒进入细胞并运送分子货物，在颗粒表面使用不同的分子，就可递送到不同的目的地。由于eVLP内没有病毒的遗传物质，不会在细胞中插入外来的DNA，因此被认为比用真正病毒作载体的递送方法更安全。4mRNA疫苗应用进展2020年，有研究人员开发了黑色素瘤疫苗FixVac，它是一种通过静脉注射的纳米颗粒脂质体mRNA疫苗，其能靶向作用于淋巴组织中未成熟的树突状细胞，并驱动肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs）在MHC 类和类分子上呈现38。研究人员通过利用 TLR 配体刺激后细胞内葡萄糖的消耗来判断 FixVac 是否靶向，在RNA-LPX 注射后进行 18F-氟-2-脱氧-2-d-葡萄糖-正电子发射断层扫描/计算机断层扫描，发现脾脏中葡萄糖代谢活性显著增加，表明免疫细胞进行了快速靶向和瞬时激活39。研究者又通过测量血浆中细胞因子含量来评估佐剂性，IFN-、IFN-、IL-6、IFN-IP-10和 IL-12 p70含量随着 FixVac剂量的增加而增加，并伴有体温的短暂升高，细胞因子含量在治疗后26 h达到高峰，并在24 h内恢复正常40。这种疫苗包含了4种TAAs，分别是 NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和 TPTE，通过诱导机体的效应T细胞对TAAs产生反应，并介导免疫检查点阻滞剂（immune checkpoint blockades，ICB）对晚期黑色素瘤患者产生持久的反应41。图2核苷酸的基本结构与化学修饰Fig.2Basic structure and chemical modification of nucleotides496蔚丹，等：mRNA疫苗的研究及应用进展ELISPOT分析表明，患者在接种疫苗后至少对一种TAA产生特异性T细胞反应，其中大多数仅表现为 CD4+T 细胞反应，少数患者表现出 CD8+和CD4+T细胞反应。在每月接受FixVac增强剂的患者体内，TAA特异性效应T细胞的频率继续增加或保持稳定，但在没有连续接种疫苗的患者体内记忆T细胞也持续存在。某些患者在PD-1抑制剂治疗失败后接种FixVac疫苗，会出现肿瘤消退的现象，而在接受过 ICB 的患者中，接受 FixVac和抗PD-1联合治疗的患者肿瘤消退率超过35%，因此FixVac疫苗既可作为单一药物使用，也可与抗PD-1抑制剂协同作用达到抗肿瘤效果。2022年美国癌症研究所（Cancer Research Institute）进行了一项临床试验旨在评估NSCLC检查点抑制剂与mRNA疫苗联合治疗的安全性和初步疗效。该mRNA疫苗包含6种抗原，分别是MUC1、survivin、NY-ESO-1、5T4、MAGE C2 及 MAGE C1。临床试验中病人分为2组，A组接受mRNA疫苗和PD-1抑制剂治疗，B组接受mRNA疫苗和PD-1抑制剂、CTLA-4抑制剂治疗，结果显示，B组患者的治疗效果较好，且接受治疗后出现的不良反应症状较轻，死亡人数较少（临床试验编号 NCT03164772）。2022年6月，中国军事医学科学院、沃森生物公司和艾博生物公司合作完成了一项在300名中国成年人中进行的临床试验，结果显示接种两剂灭活新冠疫苗后，使用 mRNA疫苗 ARCoV（也叫作AWcorna）作为第三针加强针，与继续使用灭活疫苗作为加强针相比，能够引发更强的针对新冠野生毒株、Delta突变株和Omicron突变株的免疫反应。这项临床试验证实了ARCoV作为第三针疫苗接种的安全性和有效性，也标志着我国第一个mRNA疫苗有望获批。5展望随着研究的不断深入，mRNA疫苗技术已经日渐成熟，Karik等2，26的研究使其翻译效率和稳定性提高，各种递送系统使其成功进入人体细胞并激发高效的免疫应答。从mRNA本身的特性、引发的免疫反应情况等方面来看，mRNA疫苗优于亚单位疫苗、灭活疫苗等。但mRNA疫苗大规模用于人体的时间尚短，需进行长期不良反应监测，以验证其安全性及有效性42。到目前为止，在癌症的免疫治疗中通过将mRNA转入树突状细胞方面存在瓶颈，使mRNA疫苗在治疗方面的应用受到限制，将其应用于不同类型疾病的治疗研究还需不断的拓展。总之，mRNA疫苗的研究在疾病预防、治疗等方面具有重大意义。参考文献 1 古丽米热依米提,斯坎德尔白克力,王延蛟.大鼠肝癌模型中 Piwil4、Mael 和 Ddx4 基因 mRNA 和蛋白表达水平及其与肿瘤检测的关系J.生物技术进展,2020,10(1):74-79.2 KARIK K,BUCKSTEIN M,NI H,et al.Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors:the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNAJ.Immunity,2005,23(2):165-175.3 RUIZ R,HUNIS B,RAEZ L E.Immunotherapeutic agents in non-small-cell lung cancer finally coming to the front linesJ.Curr.Oncol.Rep.,2014,16(9):1-10.4 WOLFF J A,MALONE R W,WILLIAMS P,et 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