SOX1过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生.pdf

基金项目:河南省自然科学基金(222300420537)第一作者简介:晋大川,研究方向:食管癌相关分子机制研究。E-mail:jindcvip 通讯作者:周舫,博士,教授,研究方向:职业肿瘤与应激医学。E-mail:zhoufang doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.011SOX1 过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生晋大川1,郭军强2,岳欣3,程金兵4,周蓉1,靳超美1,焦琳琳1,周舫11.郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室,河南 郑州 450001;2.新乡医学院药学院;3.河南省直第三人民医院检验科;4.濮阳县人民医院外科【摘要】目的探索 SOX1 过表达对食管癌细胞增殖及凋亡的作用及其机制。方法构建 SOX1 过表达细胞株,检测 SOX1 mRNA 和蛋白表达,CCK-8 检测细胞增殖,细胞划痕及结晶紫染色检测细胞的迁移及克隆形成能力,Hochest 染色实验检测细胞凋亡情况,Western blotting 检测 GSK-3 及 Wnt/-catenin 通路相关蛋白表达水平。结果SOX1 过表达组 mRNA 显著高于对照组(P0.01)。CCK-8 OD 值及增殖曲线绘制表明 SOX1 过表达组增殖速率显著降低(P0.05);SOX1 过表达组细胞的迁移速率和克隆形成能力明显下降(P0.05);显微镜下观察到 SOX1 过表达组细胞的皱缩明显,提示凋亡的发生;Western blotting 检测结果表明,SOX1 过表达组 GSK-3 上调,Wnt 信号通路相关基因-catenin、Cyclin D1、c-Myc 蛋白表达明显下降(P0.05)。结论SOX1 通过抑制 Wnt/-catenin 信号传导抑制食管癌细胞的增殖和促进凋亡。【关键词】食管癌;SOX1;细胞迁移;细胞凋亡;Wnt/-catenin中图分类号:R735.1文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0891-05收稿日期:2022-09-13SOX1 overexpression inhibits proliferation and promotes apoptosis of esophageal carcinoma cellsJIN Dachuan1,GUO Junqiang2,YUE Xin3,CHENG Jinbing4,ZHOU Rong1,JIN Chaomei1,JIAO Linlin1,ZHOU Fang11.Department of Occupational Health and Occupational Disease,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.School of Pharmacy,Xinxiang Medical University;3.Department of Clinical Laboratory,the Third Peoples Hospital of Henan Province;4.Department of Surgery,Puyang County Peoples Hospital,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of SOX1 overexpression on proliferation and apoptosis of esophageal carcinoma cells.MethodsSOX1 was overexpressed in ECA109 and EC9706.SOX1 mRNA and protein expression were detected.Cell proliferation was detected by CCK-8.Cell migration and clonal formation ability were de-tected by crystal violet staining,and cell apoptosis was detected by Hochest staining.Western blotting was performed to analysis GSK-3 and Wnt/-catenin pathway.ResultsmRNA in SOX1 overexpressed group was significantly higher than that in control group(P0.01).CCK-8 showed that the proliferation rate of SOX1 overexpressed group was signifi-cantly decreased(P0.05).The migration rate and clonal formation ability of SOX1 overexpressed cells decreased sig-nificantly(P0.05).Under the microscope,the cells in SOX1 overexpressed group showed obvious shrinkage,sugges-ting the occurrence of apoptosis.Western blotting analysis showed that GSK-3 was up-regulated in SOX1 overexpressed group,and-catenin,Cyclin D1,c-Myc protein expression of Wnt signaling pathway was significantly decreased(P0.05).ConclusionSOX1 inhibits esophageal carcinoma cells proliferation and promotes apoptosis by inhibiting Wnt/-catenin signaling.【Key words】Esophageal carcinoma;SOX1;Cell proliferation;Apoptosis;Wnt/-catenin食管癌作为一种侵袭性疾病,是全球最常见的癌症之一1。食管癌的发生与长期摄入的食物中含有亚硝铵类化合物、不良饮食习惯(食物过烫、粗糙或变霉等)、不良生活习惯(熬夜、吸烟、喝酒)有很大关系。其发病率在经济不发达地区较高,且在发病后期无能显著提高患者生存质量的有效措施2-3,SOX 基因属SRY BOX 基 因 超 家 族。SOX1、SOX2、SOX3、SOX7、SOX9 和 SOX17 已被证明是不同类型癌症中的抑制因子4-5。GSK-3 是多种信号转导通路中的关键激酶之一,主要参与慢性炎症的调控,并与多种肿瘤的发生发展密切相关。SOX 家族成员通过操纵 Wnt 信号来发挥其功能是一种相当常见的策略。Wnt 信号的异常激活与 人类致癌 相 关-catenin 破 坏 复 合 物(APC、Axin2、CK1 和 GSK-3)的突变或失调导致 Wnt 信号的激活6。本研究拟分析 SOX1 过表达对食管癌细胞198胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8增殖、迁移、凋亡及 Wnt/-catenin 信号通路的影响,探索 SOX1 对于食管癌的潜在治疗价值。1材料与方法1.1实验材料食管癌 ECA109、EC9706 细胞系(中国科学院细胞库);RPMI-1640 培养基(河南普诺易生物制品研究院有限公司);胎牛血清(美国 Gibco 公司);胰酶、青链霉素(河南普诺易生物制品研究院有限公司);SOX1 过表达载体由吉凯基因有限公司合成。结晶紫染色液(上海碧云天生物技术有限公司);Hochest 33342(上海碧云天生物技术有限公司);Lipofectamine 3000(美 国 Invitrogen 公 司);SOX1、Cyclin D1、-catenin、c-Myc、GSK-3、-actin 抗体均购自 CST 公司。1.2方法1.2.1细胞转染:取对数生长期 ECA109、EC9706 细胞株接种到 12 孔板中,待细胞融合度为 70%左右时,将 SOX1 阴性或 SOX1 过表达载体转染到两种细胞中,实验步骤参照脂质体转染试剂 Lipofectamine 3000 使用说明,质粒 Lipofectamine 3000=1 2.5;转染 8 h 后更换新鲜培养基。1.2.2qRT-PCR:qRT-PCR 检测过表达后 SOX1 的 mRNA表达水平。引物:SOX1-F:5-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3,SOX1-R:5-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3;GAPDH-F:5-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3,GAPDH-R:5-ATG-GCATGGACTGTGGTCATGAG-3。使用细胞总 RNA 分离试剂盒(FOREGENE,中国成都)从 ECA109、EC9706细胞中获得总 RNA。NovoScriptSYBR 两步 qRT-PCR SuperMix(Novoprotein,中 国)用 于 将 RNA 逆 转 录 为cDNA。最终体积为 10 l 的 qRT-PCR 反应混合物为0.4 l 模板 cDNA、5 l LBR 预混料 Ex Taq、0.3 l 正向引物、0.3 l 反向引物和 4 l ddH2O。反应是在皮科雷尔号上进行的 96 实时 PCR 系统(ThermoFisher Scientific,美国),使用 PikoReal 软件 2.2。扩增条件如下:95 5 min,94 30 s,40 个周期,50 30 s,72 40 s,60 60 s。通过 2-Ct方法计算相对 mRNA表达。进行了 3 个平行实验。1.2.3CCK-8 实验:将对照组(阳性对照与阴性对照)和SOX1 过表达细胞分别以 2103个/ml 的浓度接种于 96孔板(100 l/孔)中,置于37,体积分数为 5%的 CO2中培养。CCK-8 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)分别在 12、24、48、72 h 检测细胞活力,持续 5 d。细胞达到90%融合后,向每孔添加10 l CCK-8 溶液,在培养箱中培养 2 h 后,在微孔板读取器下测量 450 nm 处的吸光度(OD)值。对每种类型的细胞进行一式三份的分析。1.2.4细胞迁移及克隆形成实验:(1)通过划痕实验比较 SOX1 过表达后对于细胞迁移能力的影响。细胞接种于 6 孔板(1105个细胞/孔)中培养 24 h,融合度为 95%左右。划痕实验通过在融合的单层上用移液管尖端造成的线性划痕进行。伤后 0、12、24、48 h,立即在光学显微镜下(Eclipse Ti-S;日本东京尼康公司)记录在不含 FBS 的培养基中培养的细胞图像。测量伤口间隙的宽度,并将线性划痕 0 h 作为标准,用于 3个独立实验。(2)用阴性对照载体转染 ECA109 和EC9706 细胞 48 h 后进行集落形成实验。然后将转染细胞以 200 个/孔的密度接种到 24 孔培养板中,并在体积分 数 为 5%的 CO2增 湿 培 养 箱 中 于 37 的DMEM 中常规培养。细胞保持 14 d,在 25 下,用 Gi-emsa(北京索拉比科技有限公司,中国北京)对细胞进行 15 min 染色,以评估细胞克隆的形成。菌落形成效率根据光学显微镜下计数的菌落数计算(放大 100倍)。每组选择 5 个视野。1.2.5Hoechst 染色:通过 Hoechst 33258 染色分析细胞凋 亡 情 况。收 集 的 细 胞 按 照 说 明 使 用 Hoechst 33258 染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)染色,随后在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化。1.2.6Western blotting 检测蛋白表达情况:提取总蛋白,BCA(上海碧云天生物技术有限公司)法测定蛋白浓度;每孔 15 g 总蛋白上样进行 SDS-PAGE 电泳,然后 在 转 膜 缓 冲 液 中 转 移 至 0.2 m PVDF 膜(GVWP02500)(购自 MILLIPORE,美国)。室温封闭1.5 h,分别用一抗 SOX1(#4194)、-catenin(D10A8)、Cyclin D1(E3P5S)、c-Myc(E5Q6W)、GSK-3(D5C5Z)、-actin(#4970)(购自 CST,美国)按照 1 1 000 4 条件下孵育过夜。随后,用 TBST 清洗膜后,用与辣根过氧化物酶结合的二抗(A01827)(购自金斯瑞,中国)按照1 12 000 孵 育 2 h。用 TBST 清 洗 膜 后,使 用 Amer-shamTM ECLTM Prime Western blotting(美国 GE Health-care Life Sciences)检测蛋白条带。1.3统计学处理采用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析。应用两独立样本 t 检验比较 ECA109 和 EC9706细胞系中 SOX1 过表达后相对于阴性对照组和空白对照组 mRNA 的差异。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1转染过表达载体后食管癌细胞中 SOX1 表达情况将 SOX1 过表达载体和 SOX1 阴性载体分别转染至 ECA109、EC9706 细胞中,通过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆池。qRT-PCR 检测结果表明,与空白对照组和阴性对照组比较,ECA109 和 EC9706 细胞中SOX1 过表达组 mRNA 表达水平显著升高(P0.05,见表 1)。298胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8表 1过表达 ECA109、EC9706 细胞后 SOX1 的相对表达量(xs,n=3)Tab 1Relative expression of SOX1 overexpression in ECA109 and EC9706 cells(xs,n=3)组别mRNA 相对表达量ECA109 空白对照组1阴性对照组1.0750.079SOX1 过表达组3.3970.182 EC9706空白对照组1阴性对照组1.0910.045SOX1 过表达组2.9180.223 P 值0.001注:与阴性对照组、空白对照组相比,P0.01。2.2SOX1 对食管癌细胞增殖、迁移的影响CCK-8实验分析表明,ECA109 细胞中 SOX1 过表达组与阴性对照组和空白对照组相比,增殖速率显著下降(P 0.05);EC9706 细胞中 SOX1 过表达组与阴性对照组和空白对照组相比,增殖速率显著下降(P0.05)。在培养 12、24、48、72 h 后,与阴性对照组、空白对照组相比,SOX1 过表达组食管癌细胞增殖速率显著降低(P0.05,见图 1),转染 NC 载体的食管癌细胞,细胞增殖能力与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),因此接下来的实验我们仅采用空白对照组进行下一步的分析。结晶紫染色实验结果显示,与空白对照组相比,SOX1 过表达组紫色克隆个数明显减少,细胞之间的克隆面积也变小,表明 SOX1 过表达后细胞增殖速度减弱导致细胞形成克隆的能力降低(见图 2)。划痕实验表明,与空白对照组相比,培养 48 h 后,随着 SOX1 的过表达,ECA109 细胞和 EC9706 细胞的迁移距离显著变小。SOX1 表达上调显著缩短了 EC9706 细胞迁移的距离,表明细胞迁移能力降低(见图 3)。注:A:ECA109 细胞;B:EC9706 细胞。图 1MTT 检测过表达 SOX1 后的食管癌细胞 ECA109 和 EC9706 增殖曲线图Fig 1The proliferation curves of esophageal cancer cells ECA109 and EC9706 of SOX1 overexpression detected by MTT图 2SOX1 基因对细胞克隆形成的影响Fig 2Effect of SOX1 gene on cell clone formation图 3SOX1 过表达对食管癌细胞 ECA109 和 EC9706 迁移能力的影响(放大 100 倍)Fig 3Effect of SOX1 overexpression on migration of esophageal cancer cells ECA109 and EC9706398胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.82.3SOX1 对食管癌细胞凋亡的影响Hochest 染色实验结果提示,相比较空白对照组,SOX1 过表达组可以观察到细胞核的明显皱缩(白色箭头所示),染色质凝集(见图 4),表明 SOX1 过表达导致细胞凋亡引起细胞核形态改变。图 4SOX1 过表达对食管癌细胞 ECA109 和 EC9706 凋亡的影响(放大 100 倍)Fig 4Effect of SOX1 overexpression on apoptosis of esophageal cancer cells ECA109 and EC97062.4SOX1 过表达对食管癌细胞中 Wnt/-catenin信号通路的影响过表达 SOX1 的 ECA109 和 EC9706细胞中-catenin、c-Myc 和 Cyclin D1 的蛋白表达均明显下降。与空白对照组、阴性对照组相比,SOX1 过表达显著抑制了-catenin、c-Myc 和 Cyclin D1 蛋白水平,而 GSK-3 的蛋白水平明显升高(见图 5)。因此,SOX1 过表达对于食管癌细胞增殖和凋亡的影响可能是由 Wnt/-catenin 信号通路介导。注:1:ECA109 空白对照组,2:ECA109 阴性对照组,3:ECA109 SOX1 过表达组,4:EC9706 空白对照组,5:EC9706 阴性对照组,6:EC9706 SOX1 过表达组。图 5SOX1 过表达对 Wnt/-catenin 信号通路相关基因蛋白表达影响Fig 5Effect of SOX1 overexpression on the expression of Wnt/-catenin signaling pathway related genes and proteins3讨论食管癌作为一种侵袭性恶性肿瘤,具有复杂的发病机制及难以改善的 5 年生存率7。目前治疗食管癌的主要方案是手术结合化疗。然而,食管癌的发生涉及多 个 原 癌 和 抑 癌 基 因 的 失 调。SOX 家 族 蛋 白SOX2、SOX7、SOX9 和 SOX17 已被证明是肿瘤不同类型癌 症 中 的 抑 制 因 子8-10。然 而,也 有 研 究 表 明,SOX1、SOX3 具有癌基因功能11。研究发现,GSK-3与肺癌、乳腺癌密切相关,通过抑制上皮-间质转化发生,从而抑制肺癌转移12。GSK-3 抑制剂能够维持干细胞的干性,在肿瘤发生后,这种特性可能参与肿瘤的发生发展。Wnt/-catenin 信号通路参与细胞的多种生理过程,包括细胞的分化、胚胎发育以及发育过程的状态稳定8,13。-catenin 通过不同细胞间定位(核易位)发挥稳定功能,与 T 细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor,TCF/LEF)形成复合物,促进 Wnt/-catenin 信号通路相关基因(c-Myc、Cyclin D1)的表达13。SOX 家族已被证明在不同的发展和癌症环境中调节 Wnt/-catenin 的活性14。自从首次报道了在非洲爪蟾胚胎中 SOX17 和SOX3 的典型 Wnt 信号通路的调控以来,越来越多的SOX 蛋白被发现与-catenin 和 TCF 相互作用,并提出了一些机制15。在结肠癌细胞中,SOX7 和 SOX17 通过与-catenin 结合发挥作用,促进其作为肿瘤抑制因子的降解功能16。目前尚无研究分析 SOX1 对于食管癌细胞的生物特性的影响与 Wnt/-catenin 信号通路的关系。在本研究中,我们通过转染 SOX1 过表达载体,SOX1 的 mRNA 以及蛋白表达均显著提高。MTT 进行增殖测试,转染后 12 48 h 时 SOX1 过表达组 OD 值显著低于阴性对照组和空白对照组,从增殖曲线可以看出 SOX1 过表达后细胞几乎处于增殖停滞状态,表明了 SOX1 在食管癌中是作为抑癌基因存在。肿瘤细胞高的侵袭能力对于肿瘤的恶化程度是一个关键因素,是恶性肿瘤扩散的基础。本研究进一步通过克隆形成及细胞划痕实验表明,体外过表达 SOX1 基因后细胞形成克隆的能力减弱,细胞间融合受到影响,其迁移能力受到明显抑制,这表明推测 SOX1 可能在食管癌细胞迁移和侵袭的过程中起到调控作用。SOX 家族基因 SOX2 与成骨细胞中的-catenin 相互作用,胃癌中 Wnt 表 达 的 抑 制 导 致 Cyclin D1 基 因 下 调,p27kip1 表达上调,p27kip1 作为细胞周期关键蛋白,其表达上调会明显抑制细胞的增殖。因此,干扰 Wnt信号的表达在生长抑制中发挥重要作用17。我们推498胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8测 SOX1 可能通过干扰食管癌细胞中的 Wnt 信号来影响细胞周期进程从而影响增殖。Western blotting 实验结果验证了我们的推测,与对照组相比,过表达 SOX1的 ECA109 细胞和 EC9706 细胞中-catenin、c-Myc 和Cyclin D1 的蛋白表达均明显下降,GSK-3 的蛋白水平明显上升。因此,SOX1 过表达对于食管癌细胞增殖的影响可能是由于 Wnt/-catenin 信号通路介导的。研究表明,在肿瘤细胞中低糖条件和二甲双胍过度活 化 GSK-3,显 著 促 进 了 细 胞 凋 亡 的 发 生18。GSK-3 在发育中与 Wnt/-catenin 信号通路是负调控关系,白藜芦醇与 GSK-3 抑制剂干预有效上调 Wnt/-catenin 信号通路蛋白表达19。在肿瘤细胞的放化疗手段中,促进细胞凋亡的发生一直是研究的热点及有效手段,在食管癌细胞中靶向 SOX1 基因的凋亡机制尚未报道,我们通过 Hochest 染色实验提示 SOX1 基因的过表达导致了细胞核的皱缩,这可能是凋亡的发生导致核形态改变,机制上来说可能是由于 SOX1 基因激活了 GSK-3 的表达,引起细胞凋亡的发生。然而 SOX1 对于食管癌细胞凋亡的影响机制以及具体作用还需要进一步实验探究。综上所述,在本研究中,食管癌细胞中 SOX1 基因过表达显著抑制细胞的增殖及迁移,同时诱导了细胞凋亡的发生。其作用机制可能是 SOX1 通过促进 GSK-3的表达抑制 Wnt/-catenin 信号通路引起的细胞增殖停滞,上 述 结 果 进 一 步 阐 明 了 SOX1 及 Wnt/-catenin信号通路在食管癌中的分子机制,可以推断 SOX1 表达可能在抑制肿瘤转移和发展中发挥关键作用,有望成为食管癌的潜在治疗靶点。参考文献1 Miller KD,Nogueira L,Mariotto AB,et al.Cancer treatment and sur-vivorship statistics 2019 J.CA Cancer J Clin,2019,69(5):363-385.DOI:10.3322/caac.21565.2 Arnold M,Soerjomataram I,Ferlay J,et al.Global incidence of oeso-phageal cancer by histological subtype in 2012 J.Gut,2015,64(3):381-387.DOI:10.1136/gutjnl-2014-308124.3 Kaz AM,Grady WM.Epigenetic biomarkers in esophageal cancer J.Cancer Lett,2014,342(2):193-199.DOI:10.1016/j.canlet.2012.02.036.4 Grimm D,Bauer J,Wise P,et al.The role of SOX family members in solid tumours and metastasis J.Semin Cancer Biol,2020,67(Pt 1):122-153.DOI:10.1016/j.semcancer.2019.03.004.5 Abadi AJ,Zarrabi A,Hashemi F,et al.The role of SOX family tran-scription factors in gastric cancer J.Int J Biol Macromol,2021,180:608-624.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2021.02.202.6 Giles RH,van Es JH,Clevers H.Caught up in a Wnt storm:Wnt sig-naling in cancer J.Biochim Biophys Acta,2003,1653(1):1-24.DOI:10.1016/s0304-419x(03)00005-2.7 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