奥硝唑诱导弱精子症与少弱精子症大鼠模型的建立.pdf

.1208.生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.08.011奥硝唑诱导弱精子症与少弱精子症大鼠模型的建立刘胜京，晏斌，安晓静，耿强，韩强，赵丰，张继伟1，王福，郭军1*（1.中国中医科学院西苑医院，北京10 0 0 9 1;2.天津中医药大学第一附属医院，天津30 0 19 3;3.首都医科大学附属北京中医医院，北京10 0 0 10）【摘要】目的通过不同剂量的奥硝唑（ORN)制备弱精子症及少弱精子症大鼠模型，并探讨其对附睾、睾丸及超微结构的损伤，以及对精子线粒体的影响。方法48 只雄性SD大鼠随机分为4组，每组12 只，实验组分别给予ORN200mg/kg、ORN400mg/kg、O RN8 0 0 m g/k g 灌胃，空白对照组给予1%羧甲基纤维素钠灌胃，连续灌胃2 8 d。观察记录各组大鼠体重、附睾及睾丸脏器指数，检测附睾精子浓度及活力，采用苏木素-伊红（HE)染色方法观察附睾头、附睾尾及睾丸病理损伤情况，透射电镜观察附睾、睾丸及精子超微结构，统计分析4组间各项指标差异。结果与空白对照组相比，ORN200mg/kg剂量组附睾及睾丸脏器指数、精子浓度及活力均无显著变化（P0.05）,H E染色及透射电镜结果均显示附睾及睾丸组织无明显损伤；ORN400mg/kg剂量组附睾脏器指数显著降低（P0.05），精子活力显著降低（16.3士7.2)%vs.（36.1士6.6%，P0.05），H E染色观察附睾及睾丸组织损伤不明显，透射电镜超微结构可见附睾及睾丸线粒体出现部分空泡化，精子线粒体出现损伤，但仍可见较为完整的精子线粒体结构；ORN800mg/kg剂量组附睾及睾丸脏器指数均显著降低（P0.05），精子浓度（15.3士9.2）10%/mlvs.（6 0.3土10.2）10%/ml,P0.001及活力（7.3士5.2）%vs.（36.1士6.6%，P0.001均显著下降，HE染色可见附睾及睾丸组织损伤明显，透射电镜下可观察到附睾及睾丸线粒体空泡化明显，精子线粒体明显肿胀断裂。结论ORN400mg/kg灌胃2 8 d可用于弱精子症大鼠模型的制备，其对附睾、睾丸组织损伤及精子线粒体结构损伤不明显；ORN800mg/kg灌胃2 8 d可用于少弱精子症大鼠模型的制备，可明显造成附睾及睾丸组织损伤，破坏精子线粒体结构。【关键词】奥硝唑；男性不育症；弱精子症；少弱精子症；动物模型【中图分类号】R698十.2Establishment of ornidazole-induced rat models with asthenozoospermia and oligoasthenozoospermiaLIU Sheng-jing,YAN Bin,AN Xiao-jing,GENG Qiang”,HAN Qiang,ZHAO Feng?,ZHANG Ji-wei,WANG Fu,GUOJun!*1.Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 1000912.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 3001933.Beijing Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University,Beijing 100010Objective:To establish rat model with asthenozoospermia and oligoasthenozoospermia byadministrating the different doses of ornidazole(ORN),and to explore its effects on the ultrastructuraltissue damage of the epididymis and testis,and sperm mitochondria.Methods:Forty-eight male SD rats were randomly divided into 4 groups,12 rats for each group.Therats in experimental groups were given ORN 200 mg/kg,400 mg/kg and 800 mg/kg by gavage,respectively,and the negative control group was given 1%sodium carboxymethyl cellulose by gavage,continuous gavage for 28 days.The body weight,organ index of epididymis and testis,sperm concentration【文献标识码】A【A b s t r a c t【收稿日期】2 0 2 3-0 2-0 7；【修回日期】2 0 2 3-0 3-2 3【基金项目】国家自然科学基金面上项目（8 2 17 439 2，8 2 17 42 17）；国家中医药管理局中医药传承与创新“百千万”人才工程岐黄学者资助项目（国中医药人教函【2 0 2 2 6 号）；中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目重点项目（CI2021A02201）【作者简介】刘胜京，男，山东聊城人，博士研究生，生殖男科学专业.（*通讯作者，Email：g u o j u n 112 6 12 6.c o m）生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期and motility were observed.HE staining was used to observe the pathological damage of epididymis head,epididymis tail and testis.The ultrastructure of epididymis,testis and sperm was observed by transmissionelectron microscope.The differences in various indicators among the four groups were analyzed.Results:Compared with the negative control group,there was no significant change in the epididymisand testis organ index,sperm concentration and motility in the ORN 2o0 mg/kg group,and there was noobvious tissue damage of epididymis and testis tested by HE staining and transmission electronmicroscopy.The epididymal organ index of ORN 400 mg/kg group significantly decreased(P0.05),andthe testicular organ index did not change significantly.Sperm motility decreased significantly(16.37.2)%vs.(36.16.6)%,P0.05).HE staining showed that there was no obvious tissue damage to the epididymis and testis.Transmissionelectron microscopy revealed partial vacuolization of the epididymis and testicular mitochondria,and spermmitochondria was damaged,but relatively complete sperm mitochondrial structure was still visible.In theORN 800 mg/kg group,the epididymal and testicular organ indexes were significantly reduced,the spermconcentration(15.39.2)X10%/ml vs.(60.310.2)X10%/ml,P0.001 and motility(7.35.2)%vs.(36.1 6.6)%,P0.001J were significantly decreased.HE staining showed significant damage to theepididymis and testis.Under transmission electron microscopy,obvious vacuolization of mitochondria in theepididymis and testis can be observed,and the sperm mitochondria were significantly swollen and fractured.Conclusions:Adiministration of ORN 400 mg/kg by gavage for 28 days can be used for theestablishment of rat model with asthenozoospermia,but it does not significantly damage the epididymis,testis and sperm mitochondrial structure.Adiministration of ORN 800 mg/kg by gavage for 28 days can beused for the preparation of rat model with oligoasthenozoospermia,which significantly damages theepididymis,testis and destroys the sperm mitochondrial structure.Key words:Ornidazole;Male infertility;Asthenozoospermia;Oligoasthenozoospermia;Animal model(JReprod Med 2023,32(08):1208-1215)男性不育症是指夫妇备孕1年以上，性生活规作用部位及原因进行探讨，以期为弱精子症及少弱律且未采取避孕措施，由于男方因素导致女方不能精子症的研究提供理论基础。怀孕的一类疾病1。其中,弱精子症与少弱精子症材料与方法是男性不育症最常见的原因2 ，然而目前临床尚缺乏治疗弱精子症及少弱精子症的有效药物3-4，通过构建稳定的弱精子症及少弱精子症动物模型，对探索弱精子症及少弱精子症的发病机制及新药研发均具有重要的意义。奥硝唑（Ornidazole,ORN)是继甲硝唑、替硝唑之后的第3代硝基咪唑类抗生素，具有良好的抗厌氧菌和抗原生质（如滴虫等）感染作用，常用于泌尿生殖道感染等疾病。目前生殖毒性结果显示ORN对雄性大鼠生殖系统具有可逆性影响，其影响程度与给药剂量有关5。有研究证实其可用于诱导弱精子症及少弱精子症模型，但是其影响环节及影响生殖功能的具体机制尚不清楚。本实验通过对大鼠进行不同剂量ORN灌胃处理，研究ORN造模效果，同时对ORN诱导的大鼠弱精子症及少弱精子症的:1209一、材料和试剂1.实验动物：SPF级雄性SD大鼠48 只，体重2002 2 0 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司许可证号：SCXK（京）2 0 2 1-0 0 0 6 。动物分笼饲养，每笼6 只，自由摄食饮水。室温（2 3士2），湿度（6 0 士5)%，12 h/12h光暗周期。实验前适应性喂养1周。本研究已通过中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会审查，取得伦理审查批件（批件号2021XLC051-受 1)。2.主要试剂与仪器：ORN(E120437)购自安耐吉化学公司；羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）、戊二醛固定液购自北京索莱宝科技有限公司；睾丸固定液（Davidsons固定液）购自上海源叶生物科技有限公司。SSA-I 精子检测分析系统.1210:（北京穗加软件有限公司），透射电镜（HT7800，日立，日本)。二、研究方法1.动物分组：将48 只SD大鼠随机分为空白对照组(NC组）及ORN200mgkg-1d-1剂量组(ORN200组）、ORN400mgkg-1d-1剂量组(ORN400组）、ORN800mgkg-1d-1剂量组（O RN8 0 0 组），每组12 只。因ORN不溶于水，为避免灌胃时未能混匀引起剂量的不稳定，影响造模结果，故ORN采用1%CMC-Na制成混悬液，NC组给予等量的1%CMC-Na溶液灌胃，共持续2 8 d。2.大鼠一般情况观察：各组大鼠每周称重1次，并每日观察外观体征、行为活动、饮食摄水、排尿排便、皮毛光泽度及精神状态等。3.实验取材：连续干预2 8 d后，大鼠经天平称重，使用异氟烷吸入麻醉。快速取出一侧附睾，将附睾尾于含有1mlPBS缓冲液（37 温浴）的EP管中剪碎，温浴5min，制备精子悬液，检测精子浓度及活力。另一侧附睾及双侧睾丸于冰上取出，剔除多余脂肪，精密天平称重后，放置于睾丸固定液及液氮保存。采用取血针抽取大鼠腹主动脉血到促凝管中，放置分层后于离心机30 0 0 转/min离心10 min，取上清，保存于一8 0 冰箱备用。为避免血液对样本的影响而干扰电镜的观察，每组选3只进行血管灌注处理，大鼠麻醉后，暴露心脏，10 0 ml注射器从心脏处插人升主动脉，先以PBS缓冲液快速冲洗血管，然后用4%多聚甲醛灌注固定，直至大鼠四肢及尾部抽搐皱缩。把附睾及睾丸完整取下后完全浸人4预冷戊二醛固定液内，固定1min后，于固定液内分解为米粒大小组织，转人新戊二醛固定液固定保存，用于电镜观察。4.大鼠附睾及睾丸指数计算：电子天平称重大鼠，精密天平称取大鼠附睾及睾丸重量，计算附睾及睾丸的脏器指数。计算方式如下：脏器指数=（脏器湿重/大鼠体重)10 0 0%。5.精子质量的检测：将精子悬液吸出10 l加人含9 9 0 l的PBS缓冲液离心管中混合均匀，将稀释后的精子悬液滴加到预热的精子计数板上，使用SSA-II 精子分析系统分析精子质量。精子检测由同一人操作完成以减少实验误差。6.苏木素-伊红（HE)染色观察附睾及睾丸组织病理形态学变化：将睾丸固定液固定后的附睾及睾丸组织，经固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期染色，镜下观察。采用约翰逊评分(Johnsen score)将睾丸分为110个等级，根据生精小管中精子的发生及精子发生障碍程度做出定量判断的评分表，分数越高，睾丸功能越好6 。具体评分如下：1分：无生精上皮；2 分：无生精细胞，只有支持细胞；3分：只有精原细胞；4分：无精子或精子细胞，精母细胞较少；5分：无精子或精子细胞，精母细胞较多；6 分：无精子或后期精子细胞，初期精子细胞较少；7 分：无精子或后期精子细胞，初期精子细胞较多；8 分：每小管小于5条精子，后期精子细胞较少；9 分：生精功能轻度改变，后期精子细胞较多，上皮细胞排列紊乱；10 分：生精功能正常。7透射电镜观察附睾及睾丸超微结构：将戊二醛固定的附睾及睾丸组织，经固定、脱水、包埋、固化后，使用超薄切片机莱卡EMUC7切片，经醋酸铀-枸橡酸铅双染色后，透射电镜下观察附睾及睾丸线粒体超微结构并拍照。三、统计学分析使用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析及图形的绘制。数据资料使用（士s）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，以P0.05为差异有统计学意义。结果一、各组大鼠的一般情况NC组大鼠实验过程中精神状态良好，活动反应正常，体重稳定增长。ORN各组大鼠均出现不同程度的少动、反应迟缓、倦态萎靡、进食量减少、体重增长缓慢、毛色稀松无光泽的现象，其中大鼠倦怠乏力症状灌胃初期更明显，且随剂量增加而加重，ORN800组大鼠萎靡症状表现最为严重。灌胃2 8 d过程中无大鼠死亡。二、ORN对大鼠体重、附睾及睾丸指数的影响与NC组相比,ORN200组大鼠体重、附睾指数、睾丸指数均无显著变化（P0.05）；O RN40 0 组体重及附睾指数下降（P0.05）;O RN8 0 0 组体重显著减轻（P0.01),附睾及睾丸指数显著下降（P0.05);ORN400组精子浓度无显著变化(P0.05)，精子活力显著降低(P0.001);ORN800组精子浓度及活力均显著降低(P0.001)（表1)。生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期500400B/重+H300F20010001211610*42050NCNCORN200表1各组大鼠精子浓度及活力比较（士s)组别例数精子浓度/(X10/ml)NC9ORN2009ORN4009ORN8009注：与NC组比,*P0.001。四、ORN对大鼠附睾及睾丸组织形态的影响HE染色结果显示：NC组大鼠附睾头和附睾尾中附睾管排列均紧密，管腔可见大量精子，睾丸生精50ORN800与NC组比较，*P0.05,*P0.01,*P0.05),ORN800组的评分显著低于NC组(P0.001)(图5)。生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期:1213上皮细胞形态基本正常，细胞核呈椭圆形；胞质内线1050图中圆圈代表每只大鼠的约翰逊评分；与NC组比较,*P0.001。图5各组大鼠睾丸约翰逊评分比较五、ORN对大鼠附睾及睾丸超微结构的影响大鼠附睾尾透射电镜超微结构结果显示：NC组NCORN2008000000008880NCORN200ORN 400ORN800000000000000粒体丰富，线粒体形态基本正常，呈杆状或椭圆形，内丰富、排列正常；ORN各组均可见丰富线粒体，*但线粒体轻度肿胀，内减少（图6）。大鼠睾丸透射电镜超微结构结果显示：NC组生精细胞形态基本正常，细胞核呈椭圆形，胞质内线粒体丰富，线粒体形态基本正常，呈杆状或椭圆形，内丰富、排列正常ORN各组均可见较多线粒体，OL但随着剂量增加，线粒体肿胀程度加重，线粒体逐渐稀疏，且线粒体空泡化逐渐加重（图7）。大鼠精子尾部线粒体中段横切透射电镜结果显示：NC组可见完整的精子线粒体鞘，并可见完整且结构清晰的9 十9 十2 结构（9 根外周致密纤维、9 根轴丝及2 个微管），未见周围微管和中央微管畸形。ORN200组可见精子线粒体鞘轻微肿胀，ORN400ORN800KVERRN：细胞核；M:线粒体；ER：内质网。图6 各组大鼠附睾尾透射电镜下超微结构比较NCORN200ORN400ORN800KN:细胞核;M:线粒体。图7 各组大鼠睾丸透射电镜下超微结构比较.1214：ORN400组可见精子线粒体鞘有轻度损伤及肿胀，但ORN200及ORN400组外周致密纤维完整，未见周围微管和中央微管畸形，仍能看到清晰及较为NC生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期完整的9 十9 十2 结构。ORN800组精子线粒体鞘出现明显肿胀及断裂，大小不一，有空腔出现，内部轴丝断裂（图8)。ORN200ORN400ORN800500nm图8 各组大鼠精子尾部线粒体中段横切透射电镜下超微结构比较（X20K）讨论目前弱精子症及少弱精子症模型的制备方法，包括物理方法、化学方法及基因敲除等方法。其中化学方法因其简单、稳定、高效，是最常用的造模方法7-8 。关于弱精子症的动物模型制备方法主要围绕ORN展开5.9-11。少弱精子症模型制备的化学方法主要包括环磷酰胺、白消安、腺嘌呤等化疗药物，以及雷公藤多苷、ORN等7-8 。开发稳定且具有较好关联性的弱精子症及少弱精子症动物模型，对药物研发及药物机制阐述具有重要意义。本课题组对目前少弱精子症常见化学造模方法进行文献梳理及预实验探索，并比较其优缺点。环磷酰胺及白消安作为化疗药物，造模采用腹腔注射的方法，造模剂量及天数目前文献记载仍不完全一致，且存在药物注射过量或操作不当时极容易造成大鼠死亡率过高，而注射过少则睾丸组织损伤不明显等问题12-13。腺嘌呤具有较为严重的肾损伤特点，不能排除肾衰对生精功能的直接影响，可能更适宜作为肾损伤合并睾丸功能低下的模型14。雷公藤多苷作为中药提取混合物，成分复杂，包括雷公藤甲素、雷公藤红素等多种成分。而市场上雷公藤多苷标准提取物往往仅以雷公藤甲素为单一评价指标，导致各种雷公藤多苷提取物鱼目混杂15，对药物质控带来一定挑战，可能不如单一化合物诱导的动物模型更为稳定。ORN作为三代抗生素，可剂量依赖性地造成可逆性的雄性动物不育，为其诱导少、弱精子症模型的建立提供了基础5.9 10.16-17，是较为理想的弱精子症与少弱精子症造模药物之一。本研究结果表明,ORN400mg/kg对大鼠灌胃Onm28d，会引起大鼠精子活力显著下降，对精子浓度无显著影响；ORN800mg/kg对大鼠灌胃2 8 d，会引起大鼠精子浓度及活力均显著下降，这与之前文献记载5.-1.1-11致，认为ORN400mg/kg灌胃2 8 d可用于弱精子症大鼠模型的制备，ORN800mg/kg灌胃2 8 d可用于少弱精子症大鼠模型的制备。本研究对精子发生的部位睾丸，以及精子发育成熟的部位附睾进行了观察与相关的检测，从附睾、睾丸病理及超微结构角度阐述ORN对附睾及睾丸的病理损伤，为弱精子症及少弱精子症大鼠模型的构建提供了更多证据。附睾可储存和排放精子，有促使精子成熟和分泌液体供给精子营养的作用，可分为头、体、尾三部分，其不同区域功能不同18 。本研究通过HE检测，发现ORN对同组附睾头及附睾尾病理学影响未见明显差异，其影响机制可能与附睾内环境及蛋白表达等有关18 。此外目前的实验多采用精子检测分析系统进行精子数量分析，但大鼠精液检测与人类精液检测相比，仍存在一定误差，因此附睾病理检查在判断大鼠精子数量等方面仍存在一定价值，可在今后男性不育症相关动物研究中予以一定重视。ORN对于附睾及睾丸损伤情况存在剂量依赖现象，ORN200mg/kg大鼠灌胃2 8 d,对大鼠附睾及睾丸脏器指数、精子浓度及活力未见显著影响，HE染色观察附睾及睾丸组织未观察到明显损伤。透射电镜发现附睾线粒体体积偏小，睾丸线粒体出现内减少，并有部分线粒体空泡化，精子线粒体未见明显异常。说明ORN200mg/kg灌胃2 8 d对大鼠附睾及睾丸组织影响未见明显影响，附睾及睾丸组50生殖医学杂志2 0 2 3年8 月第32 卷第8 期织线粒体有轻微损伤，但未影响到精子线粒体结构，未引起附睾及睾丸组织明显损伤。ORN400mg/kg灌胃2 8 d时，附睾指数及精子活力显著降低，但睾丸指数及精子浓度未见异常，HE染色观察附睾及睾丸组织未见明显损伤，但超微结构下已经可见附睾及睾丸线粒体出现内减少及部分空泡化现象，精子线粒体出现损伤，但仍可见较为完整的精子线粒体结构。说明ORN400mg/kg灌胃2 8 d对大鼠附睾影响更为明显，主要造成大鼠精子活力下降。当ORN每日给药量达8 0 0 mg/kg给药2 8 d时，会造成附睾及睾丸指数显著下降，附睾精子数量及活力显著减低，HE染色可见睾丸精原细胞减少且排列紊乱，各级生精细胞及精子细胞明显减少。超微结构下可观察到附睾及睾丸线粒体空泡化明显，精子线粒体明显肿胀断裂。说明ORN800mg/kg灌胃2 8 d对附睾及睾丸损伤明显，可严重影响睾丸的生精功能。此外ORN800mg/kg组灌胃初期，大鼠可出现数小时菱靡现象，部分大鼠症状严重时无法正常行动及进食，在一定程度符合中医“肾虚”“虚象”症状，可为中医病症结合动物模型的研究提供参考。本实验从动物水平上观察了不同剂量的ORN对雄性大鼠附睾及睾丸生殖系统的影响，为更全面、更深入地了解其对附睾及睾丸生殖功能的影响提供基础，同时也为弱精子症及少弱精子症动物模型的构建提供了更多思路。【参考文献】1张继伟，晏斌，郭博达男性不育症中西医结合多学科诊疗指南（2 0 2 3版）J中国男科学杂志，2 0 2 3，37：13-19.2中国医师协会生殖医学专业委员会生殖男科学组弱精子症诊疗中国专家共识编写组.弱精子症诊疗中国专家共识.中华生殖与避孕杂志，2 0 2 1，4159 3-59 9.3中华医学会生殖医学分会.生育力保存中国专家共识门生殖医学杂志，2 0 2 1,30：112 9-1134.4 Guo J.Thoughts and approaches of integrated 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