KP-10对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及凋亡相关 基因表达的作用研究.pdf

第44卷总第131期2023年9 月西北民族大学学报（自然科学版）Journal of Northwest Minzu University(Natural Science Edition)Vol.44,No.3Sep,2023KP-10 对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及凋亡相关基因表达的作用研究时小凤1，袁肇方1，黄一迪1巩转娣（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州7 30 0 30；2.西北民族大学医院，甘肃兰州7 30 0 30)摘要目的：探讨Kisspeptin-10(KP-10)对绵羊卵泡颗粒细胞（FGCs)CCND1、CD K 6、Bc l-2、T H BS1、T NC和Bax基因表达的影响.方法：将分离培养的原代FGCs细胞在含不同浓度（0、10、10 0 和10 0 0 nmol/mL)KP-10培养基中培养，分别标记为CG组、EP-1组、EP-2组和EP-3组，采用CCK-8法检测FGCs的细胞活性，筛选出KP-10对FGCs增殖的最佳浓度与时间.采用RNA-seq技术进行转录组测序分析，应用实时荧光定量PCR(qPCR)和WesternBlot方法进行验证.结果：与CG组比较，48 h时EP-2组FGCs细胞活力极显著增强（P0.01).转录组测序显示CG组和KP组间存在2 0 2 个差异表达基因，其中上调基因119个，下调基因8 3个.qPCR和Western Blot结果表明,KP组CCND1、CD K 6、Bc l-2 基因表达显著上调(P0.05);Bax、T H BS1、T NC基因表达显著下调（P0.01;P0.05),与转录组测序结果基本一致.WesternBlot验证结果与qPCR检测结果表明,KP组BAX蛋白、THBS1蛋白、TNC蛋白表达水平极显著降低（P0.01),CCND1蛋白、BCL-2蛋白和CDK6蛋白水平均显著升高（P0.05或P0.01).结论：KP-10可促进绵羊FGCs增殖及凋亡相关基因表达.KP可以降低 BAX、T H BS1、T NC m R NA 及蛋白表达，提高 CCND1、BCL-2、CD K 6 m R NA 及蛋白表达.关键词绵羊；卵泡颗粒细胞;RNA-Seq;Kisspeptin-10中图分类号S826.1文献标识码A文章编号10 0 9-2 10 2(2 0 2 3)0 3-0 0 54-0 80引言绵羊产业在我国现代畜牧业中占据重要地位，而绵羊繁殖性能的高低对绵羊的产业化规模发展有着直接影响.绵羊的季节性繁殖特性及其常见的空怀、流产等繁殖性疾病严重地阻碍了绵羊产业的发展.卵巢是成年雌性哺乳动物体内最重要的生殖器官，颗粒细胞是卵巢卵泡中最重要的体细胞之一，它可以通过自分泌和旁分泌的形式与各种细胞互相交流，在自身增殖和分化的同时，也为卵母细胞提供成熟所需的营养 1.Kisspeptin(KP)是由KISS-1基因编码的一种多肽类激素，在蛋白酶的作用下水解成长短不同且具有生物活性的酰胺化肽段，包括Kisspeptin-54（K P-54）、K i s s p e p t i n-14（K P-14）、K i s s p e p t i n-13（K P-13）和Kisspenptin-10(KP-10)21.Leel3I等首次在人黑色素瘤细胞中发现了KISS-1基因,该基因具有肿瘤抑制和细胞转移能力.随后的研究发现,在哺乳类动物以及人类的卵巢组织中均存在KISS-1 和KISS-1RmRNA的表达 4.在卵母细胞、壁层颗粒细胞、颗粒细胞、黄体细胞、间质细胞以及上皮细胞中均有KISS-1和 KISS-1R mRNA表达,其中颗粒细胞KISS-1 mRNA的表达量明显高于黄体细胞、卵母细胞收稿日期2 0 2 3-0 6-12基金项目西北民族大学高原动物疾病创新团队建设项目（2 0 2 0-8 8-0 7-3）；国家自然科学基金项目（3146 0 6 8 4）通信作者巩转娣，女，主任护师，主要从事生物医学研究作者简介时小风，女，硕士研究生，主要研究方向为动物生殖生物技术研究.54一和间质细胞 5.KP-10是目前Kisspeptins多肽家族中最短的活性多肽，且在各个物种中保持着较高的同源性.通过与G蛋白偶联受体(GPR54)结合并发挥相应功能，Kisspeptins多肽家族可直接调控下丘脑促性腺激素（GnRH)的释放，调控哺乳动物青春期的激活和卵巢的发育 6-7.Xiao8等研究发现,KP-10对鸡卵泡颗粒细胞的增殖和孕酮的分泌有促进作用.在猪的卵泡颗粒细胞中过表达KISS-1基因，可以将GO/G1期的细胞比例下调,并显著抑制细胞凋亡 9.然而KP-10影响FGCs细胞增殖和凋亡的具体机制尚不清楚.本研究旨在发现KP-10处理绵羊卵巢颗粒细胞后凋亡基因表达特点及其参与的信号通路,为深人发掘调控绵羊颗粒细胞调亡的关键基因,也为卵母细胞凋亡、卵泡闭锁、家畜繁殖疾病的深人研究提供理论支持 10-1.1材料与方法1.1药物与试剂DMEM/F-12无糖培养基购买于美国Gibco有限公司;Kisspeptin-10购买于中科亚光生物技术（北京）有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone有限公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自Dojindo公司；PBS缓冲液购自上海雅酶生物医药科技有限公司；TRizol购自美国Therome公司；qPCR反转录试剂盒购自湖南艾科瑞（AG)生物科技有限公司；AceQqPCRSYBRGreenMaster Mix购自于南京诺唯赞生物技术有限公司；抗体TNC、CD K 6、CCND 1、T H BS1、A CT I N、Bc l-2、Ba X、H R P-山羊抗兔均购自武汉赛维尔（Servicebio)生命科技有限公司.1.2主要仪器CO2培养箱（IL-161CT，施都凯仪器设备（上海）有限公司）、超低温冰箱（BCD-251WDBD，青岛市海尔股份有限公司）、荧光定量PCR仪及化学发光仪（AriaMx，安捷伦科技有限公司），低温高速离心机（美国Thermo公司）、倒置显微镜（CKX41，奥林巴斯（深圳）工业有限公司）,RNA质量检测仪（NANO-DROP ONE,美国 Therome公司).1.3FGCs分离和培养从甘肃省武威市天祝县某屠宰场无菌采集57 月龄的初情期母羊卵巢，置于37 含有双抗的生理盐水中，4h内用保温杯带回实验室.选取卵巢表面直径2 6 mm的卵泡,采用抽吸法抽吸卵泡液.卵泡液经7 0 m(200目)滤网过滤以除去卵母细胞.过滤后的悬液置于15mL离心管中10 0 0 r/mim离心8 min.弃掉上清液，细胞沉淀中添加6 mL含15%FBS的完全培养液.将细胞吹打均匀，将细胞密度调至1X10/mL，接种至6 孔板上.在37、5%COz细胞培养箱中培养 10-117.培养2 4h后用DPBS冲洗2 次，再添加新的完全培养液.选取细胞生长状况优良的FGCs，进行后续实验。1.4KP-10处理FGCs方法与分组取对数生长期的绵羊卵泡颗粒，细胞随机分为四组.依据前期的预实验和有关文献 12，选用10、100、10 0 0 n m o l/L 的KP-10,其中3个实验组分别在培养基中添加10、10 0、10 0 0 nmol/L的KP-10.空白对照组不做任何处理，分别标记为EP-1组,EP-2组、EP-3组和CG组。1.5细胞活性测定取对数生长期的FGCs细胞，按每孔4X103个细胞接种于96 孔板中，按照1.4添加不同浓度KP-10.每组设5个重复孔，严格按照CellCountingKit-8（C C K-8)使用说明操作.在2 4h、48 h 和7 2 h分别测定450 nm处的吸光度（OD值），重复测定3次.1.6?cDNA建库和 Illumina测序根据CCK-8法细胞活力检测结果，筛选出KP-10对颗粒细胞增殖影响最佳浓度与最佳作用时间进行细胞培养.将细胞收集于无菌EP管中，干冰保存运输.样品检测、文库构建、质量控制和上机测序均由北京百迈客生物科技有限公司进行.1.7测序结果比对与差异基因分析统计和评估测序得到的原始序列，去除不符合要求的序列，使得Q30（即基因测序质量，Sequencing5一一55表1引物序列Quality,是指基因检测的质量有30 位,即每一行的DNA核苷酸序列有30 个测序的位点是正确的.基因检测的Q30得分越高，测序的质量就越高，所获得的结果就越准确和可信)达到8 0%以上，得到高质量的纯净序列.用To-phat软件将质控后的高质量序列与NCBI数据库中的绵羊基因组进行比对.对不同处理组进行重复相关性评估，用DESeq进行样品组间的差异表达分析.通过KOBAS(2.O）从生物过程（BP）、分子功能(MF)及细胞成分(CC)等方面进行差异表达基因的Gene Ontology(GO)功能富集分析,对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析，P0.05被认为显著富集，可进行信号通路的富集分析.1.8实时荧光定量PCR(qPCR)将CG组和EP-2组FGCs以1X105/mL接种至6 孔板上，每组设3个重复，培养48 h后用TR-izol法提取FGCs的总RNA并逆转录成cDNA，选择与细胞增殖和凋亡的相关基因（CCND1、CD K 6、Bcl-2、T H BS1、T NC 和Bax)作为验证基因.以GenBank中绵羊的基因序列为依据，用Primer Premier设计PCR引物，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成.引物具体信息见表1.PCR反应体系20L.PCR反应条件：预变性956 0 s；变性955s;退火6 0 30 s，共40 个循环.每个样品3次重复.检测结果用2-Ct法进行统计分析.1.9Western Blot 验证收集培养的FGCs用PBS冲洗细胞2 3次，加人适当体积的RIPA裂解液于培养瓶内35min，使试剂与细胞充分接触进行裂解.用5%浓缩胶SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，30 0 mA恒流、30 min转移至PVDF膜上.将转印完的膜放人装有TBST的孵育槽中，然后加上5%的牛奶，放置脱色摇床室温下封闭30 min.分别加人配置好的抗Bcl-2抗体（1：10 0 0）、抗-Bax抗体（1：10 0 0）、抗PI3K抗体（1：10 0 0）、抗-pan-AKT抗体（1：10 0 0)及-actin（1：150 0）等一抗，4孵育摇床过夜，然后加人羊抗免IgG(1：50 0 0)二抗，孵育30 min.采用ECL化学发光试剂进行印迹.蛋白的相对含量表示灰度值与内参灰度值的比值.阴性对照组不加一抗，重复3次实验.在暗室中进行曝光拍照.每组实验重复3次，用Image软件分析各条带灰度值。基因F:TGGCATCGTGGAGGGACTTAGAPDHR:CATCATACTTGGCAGGTTTCTCCF:CGCCCTCGGTGTCCTACTTCCCND1R:GACCTCCTCCTCGCACTTCTGF:TGCTGCTTCTCATCCTCCTCTGCDK6R:GTGATTGGTGTCCTGACTGTTCTCF:CCTTTGTGGAGCTGTATGGCBcl-2R:ACTTATGGCCCAGATAGGCAF:GTGCCTGACAAGAAGTTCCAAGACTHBS1R:GGAGACCACGCTGAAGACCTGF:GCTACGGAGGTTCAGTCGGAATCTNCR:GTCAGGCTGTAAGAGGTGGTGTCF:GCCCTTTTGCTTCAGGGTTTBaxR:TCAGACACTCGCTCAGCTTC1.10数据分析ImageJ软件分析Westernblotting蛋白条带的灰度值，用GraphPadPrism8.O软件作图分析.实验数据采用Excel分析并进行处理，组间差异比较选择SPSS21.0统计软件进行独立样本t检验，结果用“平均值土标准差”表示,P0.05表示组间差异显著，P0.01表示组间差异极显著.2结果2.1KP-10对绵羊FGCs活力的影响CCK8检测细胞活力结果显示,FGCs培养48 h时和7 2 h时，与CG相比较，各EP组FGCs的细56一引物序列(5-3)退火温度/60616262646460产物大小/bp266116168141156146121GenBank登录号NM_001190390.1XM_027959928.2XM_042248372.1XM_027960877.2XM_042252253.1XM_042242818.1XM_027978594.21.5-胞活力均增强（图1），尤其以EP-2组FGCs细胞活力最强（P 1,P 0.0 5）共获得2 0 2 个DEGs，其中上调表达基因119个，下调表达基因8 3个).上调幅度较大的前10 个基因中有3个基因与细胞周期相关（L O C10 1116 30 2、CD K 6、CCND 1），有4个与细胞生长迁移有关（LOC100125610、BST-2 A、O A S1、DDX58），有3个与细胞凋亡相关（BCL2、IFIT 2、IR F7).下调幅度较大的前10 个基因中有3个与细胞生长黏附有关（LOC101114018、SCN2 B、T NC），有3个基因与细胞凋亡有关（BAX、CO M P、T H BS1）.T024FGCs细胞体外培养时间（h）表2 转录组文库测序结果Clean Reads/条Clean GC/%20578591.33236 037.8650.220.4021 415 015.671 068 893.3350.220.49表3转录组比对结果统计表（平均值）Total mapped35173350874860.77(82.71%87.08%)36 504 072.331 676 735.01(81.79%87.06%)T4872Multiple mapped1 875 658.33114 846.13(4.21%4.8%)1 965 402123 894.48(4.34%4.78%)Clean Q20/%98.530.3598.550.4233 297 691.67770 526.14(78.49%82.28%)34538670.331554382.33(77.45%82.34%)57Clean Q30/%92.511.4392.591.76Uniquely mapped表4KP-10处理后上调的前10 个基因(FPKM)KP-10处理对FGCs基因表达调控上、下调前10 位的基因见表4.基因L0C100125610L0C101116302Bcl-2IFIT2CDK6CCND1BST-2AOAS1IRF7DDX58基因THBS1TNCBaxDIRAS3L0C101123349COMPL0C105606082SCN2BL0C101114018VIPMETTL42.4GO功能富集分析和KEGGpathway信号通路富集分析通过在线软件DAVID对上述DEGs进行GO功能和KEGGpathway信号通路富集进行分析.经过GO数据库分析发现，差异表达基因主要富集在生物过程（Biological Process,BP）、分子功能（Molecular Function，MF)和细胞定位(Cellular Component,CC)三大类上,其中生物过程占单基因注释的大多数.GO富集分析结果发现,DEGs主要在以下生物过程中富集，包括：细胞代谢、生物过程调控、生物调节、代谢过程等;DEGs主要行使的分子功能有结合、催化活性、分子功能调节剂、结构分子活性及核酸结合转录因子活性等;DEGs在细胞定位中主要富集在细胞部分、膜、胞外区、细胞器及超分子复合体等细胞结构上.pvalue1410.011)KeunedHIF-1signaling pathwayApoptosismultiplespeciesLongevity regulating pathway-mammalNecroptosisNoD-likereceptorsignalingpathwayTGF-beta signalingpathwayAutophagy-animalProteinprocessing in endoplasmic reticulumFerroptosisHedgehog signaling pathwayBasaltranscriptionfactors图2 差异基因KEGG富集柱状图CG组FPKM值67.866.502.653.744.873.183.799.642.744.04表5KP-10处理后下调的前10 个基因(FPKM)CG组FPKM值KP组FPKM值85.3216.6919.448.910.830.391.090.6653.0532.261.200.730.880.541.090.7182.1154.790.970.660.810.63Top20ofKEGGEnrichmentPI3K-Akt signalingpathwayFocal adhesionECM-receptorinteractionp53signaling pathwayRIG-I-likereceptorsignalingpathwayApoptosisNeurotrophin signaling pathwaySphingolipidsignaling pathwayRNAtranspontKP组FPKM值353.1728.646.558.9210.896.987.6817.204.876.2518(85005)15(0.0033)140.003340.00260)140.0037)3(0076)20.019)20.026)20.033)3(0.07)3(0.049)20.0580)210.0)20.13)1014102102010GenePercent(%)差异倍数2.382.141.311.261.161.131.020.840.830.63差异倍数-2.35-1.13-1.08-0.73-0.72-0.71-0.70-0.63-0.58-0.55-0.370.200.150.100.052030580 nmol 100 nmolKEGG通路富集分析结果表明，共有2 0 2 个差异基因富集在51个信号通路中.主要的信号通路有PI3K/AKT信号通路、神经营养蛋白信号通路、细胞调亡、鞘脂信号通路、细胞外基质受体信号通路、p53信号通路、RIG-I样受体信号通路等（图2).2.5差异基因 qPCR验证qPCR验证结果由图3表明.与CG组相比,KP组的Bcl-2、CD K 6、CCND 1的基因表达量显著升高(P0.05），T NC、T H BS1的基因表达量显著降低（P0.05)且Bax基因表达极显著降低（P0.01).qPCR验证结果显示与高通量测序的结果基本一致，差异基因的表达趋势基本相同.1.5-1.0-0.5-0.0NCCDK6CCNDIBCL-2基因*P0.05，*P 0.0 1,与0 nmol组相比图3差异基因表达比较分析2.6差异表达基因 Western Blot 验证WesternBlot检测结果显示，与CG相比,KP组BAX蛋白、THBS1蛋白、TNC蛋白表达水平极显著下降（P0.01）,CCND 1蛋白、BCL-2蛋白表达水平均显著升高（P0.05）,CD K 6 蛋白表达水平极显著升高（P0.01）（图4）.WesternBlot验证结果与qPCR检测结果均表明KP可以降低BAX、T H-BS1、T NC m R NA 以及蛋白表达，提高 CCND1、BC L-2、C D K 6 m R NA 以及蛋白表达.THBSICT2.5CG2.0KP*1.5*1.0千*0.5-0.0BaxTNCTHBS1Bcl-2CCNDI*P0.05，*P 0.0 1,与CG组相比图4Bax、T NC、T H BS1、CD K 6、CCND 1、Bc l-2 蛋白的表达水平3分析与讨论颗粒细胞作为哺乳动物卵巢中重要细胞组成成分，为卵母细胞发育成熟提供营养和信号分子，同时59分泌卵巢主要功能激素.颗粒细胞的衰老和调亡与卵巢功能息息相关.已有研究发现,KP-10可以通过调节生殖及内分泌活动，影响GnRH、L H 和FSH的分泌和释放，从而达到调控机体生殖活动的目的.研究表明，KP-10可以显著提高牛 12-13、耗牛 141、鸡 151等卵巢颗粒细胞活力，促进孕酮分泌.本试验通过在FGCs体外培养基中添加不同剂量的KP-10,进行RNA-seq技术测定增殖与调亡相关基因的表达，测序数据经过质控合格后最终得到37.6 9 GbCleanData.结合GO功能富集分析和KEGG通路分析测序得到的差异显著基因，可对部分细胞凋亡相关基因进行验证与分析.RNA-Seq测序及qPCR和WB实验结果证明,KP-10可以上调颗粒细胞内CCND1与CDK6的表达，细胞外信号通过CCND1偶联到控制G1期进程的生物化学区域.通过与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（C D K 4/6)结合形成全酶的形式并激活，磷酸化下游底物视网膜母细胞瘤蛋白（RB），导致E2F转录因子的释放，从而启动细胞的DNA复制，正向调控细胞周期 16-18 1.研究发现,PI3K信号通路能够抑制颗粒细胞的凋亡和促进细胞增殖，从而促进卵泡的成熟 19 .赵静 12 等研究结果提示，Kisspeptin可促进牛卵巢颗粒细胞增殖和孕酮分泌，这与本实验结果一致.实验表明，10 0 nmol/LKP-10使Bcl-2上调与Bax下调，从而抑制颗粒细胞调亡，抑制卵泡闭锁.Bcl-2和Bax是细胞调亡过程中两个重要的调节因子,Bcl-2可作为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的直接底物作用于Caspase-3下游，通过阻断Caspase-3激活而抵抗调亡，延长细胞的寿命.在卵泡发育过程中，高Bax或低Bcl-2表达或者Bax/Bcl-2高比值更利于细胞调亡的发生，而高Bcl-2表达可抑制卵母细胞和颗粒细胞中Caspases活性，减少卵泡闭锁 2 0-2 1.有研究表明，50 0 nmolKP-10能够显著上调抑细胞凋亡Bcl-2基因表达，下调促细胞凋亡p53、Ba x、Ca s p a s e-3基因表达，从而抑制滩羊卵巢颗粒细胞凋亡 2 2 .本研究结果与以上研究相似.血小板凝血酶蛋白-1（thrombospondin-1,THBS1)中的TSRs序列与内皮细胞膜蛋白 CD36、C D 47 相互作用，从而抑制内皮细胞迁移并促进细胞凋亡 2 3.研究表明，细胞外基质糖蛋白Tenascin-C(TNC)基因的沉默显著增加了 SAH细胞模型的细胞增殖，显著降低了细胞凋亡 2 4.TNC基因沉默显著上调抗凋亡蛋白Bcl-2，而促凋亡分子的表达减弱 2 5.本实验表明，10 0 nmol/LKP-10可以通过影响THBS1和TNC基因表达，从而影响颗粒细胞和闭锁.RNA-Seq测序与qPCR实验结果一致，但是和WB实验结果有部分差异，可能因为基因上调或下调会对蛋白表达有更加明显的作用.综上所述，KP-10可以通过调控与细胞增殖和调亡相关的信号通路，例如PI3K-Akt信号通路、p53信号通路等，上调CCND1、C D K 6、BC L 2 基因表达，下调BAX、T H BS1、T NC 基因表达，促进颗粒细胞增殖来抑制其调亡，达到对卵泡生长进行调节，从而促进卵泡的成熟.参考文献：1张焱，张华.哺乳动物卵巢卵泡发育调控机制研究进展J.生理学报，2 0 2 0，7 2（1）：6 3-7 4.2J DUNGAN H M,CLIFTON D K,STEINER R A.Minireview:Kisspeptin Neurons as Central Processors in the Regulation 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activity of FGCs was detected by CCK-8 method.The optimal concentration andtime of KP-10 for FGCs proliferation were screened,and transcriptome sequencing was performed byRNA-seq technology,and verified by real-time quantitative fluorescent PCR(qPCR)and WesternBlot.Results:Compared with CG group,FGCs cell viability in EP-2 group was significantly enhanced at48h(P0.01).Transcriptome sequencing showed that there were 202 differentially expressed genesbetwen CG and KP groups,among which 119 up-regulated genes and 83 down-regulated genes.Theresults of qPCR and Western Blot showed that the expressions of CCND1,CDK6 and Bcl-2 genes inKP group were significantly up-regulated(P0.05).Bax gene expression was significantly down-reg-ulated(P0.01),THBS1,TNC gene expression was significantly down-regulated(P0.05),whichwas basically consistent with the transcriptome sequencing results.Conclusion:KP-10 can induce ex-pression of genes related to proliferation and apoptosis of FGCs in ovis aries.Key words Ovis Aries;Follicular Granulosa Cells;RNA-Seq;Kisspeptin-10（责任编校朱兴红）61