miR-654-3p靶向GMFB抑制骨肉瘤细胞增殖的作用及机制研究.pdf

doi:10.3969/j.issn.1672-5972.2023.04.008文章编号:swgk2022-11-00281生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY2023 年 08 月第 20 卷 第 4 期miR-654-3p靶向GMFB抑制骨肉瘤细胞增殖的作用及机制研究赵立晶 张鸿翔 王国安摘要 目的 探究miR-654-3p对骨肉瘤细胞增殖的影响，预测其靶基因并评估靶基因对骨肉瘤患者生存预后的干预情况。方法 选择GEO数据库中GSE70367数据集进行差异分析，筛选骨肉瘤细胞中异常表达的miRNA，通过RT-qPCR 检测 miR-654-3p 在骨肉瘤细胞系 143B、MG-63、SAOS2 和 HOS 中的表达情况。通过 TargetScan 和miRmap数据库预测miR-654-3p的靶基因，采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-654-3p与GMFB基因的结合。用CCK8实验和CFU实验分析miR-654-3p和GMFB对骨肉瘤细胞MG-63和HOS增殖的影响。下载TCGA数据库中肉瘤患者的GMFB表达数据和临床信息，通过R软件包绘制GMFB对生存预后影响的KM曲线以及预测肉瘤患者1年、3年和5年生存率的列线图。结果 与人正常成骨细胞hFOB1.19相比，骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS中miR-654-3p的表达均明显降低（P0.05）。miR-654-3p与GMFB基因结合，并负调控GMFB的表达。miR-654-3p模拟物在体外明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，而GMFB转染能够逆转抑制作用（P0.05）。GMFB高表达的骨肉瘤患者的总体生存率明显低于低表达患者（P0.05），且通过列线图能够预测患者的1年、3年和5年生存率。结论 miR-654-3p通过靶向负调控GMFB基因表达，抑制骨肉瘤细胞的增殖，且GMFB高表达与骨肉瘤患者的预后呈负相关。关键词 骨肉瘤；miR-654-3p；GMFB；增殖；列线图中图分类号 R318 文献标识码 AEffect and mechanism of miR-654-3p inhibiting osteosarcoma cell proliferation by targeting GMFBZhao Lijing,Zhang Hongxiang,Wang Guoan.Department of Orthopedics,Peoples Hospital of Dingbian County,Yulin Shaanxi,718699,ChinaAbstract Objective To investigate the effect of miR-654-3p on the proliferation of osteosarcoma cells,predict its target genes and assess the intervention of target genes on the survival prognosis of osteosarcoma patients.Methods The GSE70367 dataset in the GEO database was selected for differential analysis to screen for aberrantly expressed miRNAs in osteosarcoma cells,and the expression of miR-654-3p in osteosarcoma cell lines 143B,MG-63,SAOS2 and HOS was detected by RT-qPCR.The target genes of miR-654-3p were predicted by TargetScan and miRmap database,and the binding of miR-654-3p to GMFB gene was verified using dual luciferase reporter gene assay.The effects of miR-654-3p and GMFB on the proliferation of MG-63 and HOS in osteosarcoma cells were analyzed by CCK8 assay and CFU assay.GMFB expression data and clinical information of sarcoma patients in the TCGA database were downloaded,and KM curves of the effect of GMFB on survival prognosis and column plots predicting 1-year,3-year,and 5-year survival of sarcoma patients were plotted by the R package.Results The expression of miR-654-3p was significantly lower in osteosarcoma cell lines 143B,MG-63,SAOS2 and HOS compared to human normal osteoblasts hFOB1.19(P0.05).miR-654-3p bound to the GMFB gene and negatively regulated the expression of GMFB.The miR-654-3p mimics significantly inhibited the proliferation of osteosarcoma cells in vitro,while GMFB transfection was able to reverse the inhibitory effect(P0.05).Overall survival was significantly lower in sarcoma patients with high GMFB expression than in patients with low expression(P0.05),and 1-year,3-year,and 5-year survival rates could be predicted by the nomogram.Conclusion miR-654-3p inhibits the proliferation of osteosarcoma cells by targeting the negative regulation of GMFB gene expression,and high GMFB expression is negatively correlated with the prognosis of sarcoma patients.Key words Osteosarcoma;miR-654-3p;GMFB;Proliferation;Nomogram骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，在青春期和老年期发病率较高。骨肉瘤极易发生转移，且以肺转移最常见1。近三十年来，骨肉瘤的治疗进入了平台期，尤其是转移性骨肉瘤和复发性骨肉瘤，致残率和死亡率极高2-3。探究骨肉瘤发病的分子机制和治疗靶点是骨肉瘤研究的重论著实验研究作者单位：定边县人民医院骨科，陕西 榆林，718699.352023 年 08 月第 20 卷 第 4 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY要方向。miRNA是一种由18 24个核苷酸组成的小型单链非编码RNA，其通过与特定mRNA的靶向结合来调控基因的表达4。miRNA水平的改变与包括肿瘤在内的常见人类疾病的发展有关，能够参与所有关键的肿瘤相关过程，包括DNA损伤修复、细胞死亡、细胞增殖，以及上皮-间质转化、肿瘤侵袭和转移形成等5-6。同样，miRNA的异常变化也参与骨肉瘤的发生和发展，本研究通过生信分析，从经典GEO数据库中筛选骨肉瘤中异常表达的miRNA。探究miR-654-3p对GMFB基因的靶向调控作用，以及对骨肉瘤细胞增殖的影响，并绘制基于GMFB表达来预测骨肉瘤患者预后情况的列线图，从而为探究骨肉瘤更多的发病机制、探索更可靠的生存预后预测方法提供理论依据。1 材料与方法1.1 主要材料、试剂与仪器主要材料、试剂：人正常成骨细胞系hFOB1.19，人骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS美国模式培养物集存库（ATCC）；DMEM 培养基、胎牛血清（FBS，美 国 Gibco 公 司）；miR-654-3p mimics、mimics NC、pcDNA-GMFB、双荧光素酶报告质粒（上海吉玛基因公司）。PrimeScripTM RT试剂盒、SYBR Green Premix试剂盒（日本TaKaRa公司）；4%多聚甲醛、CCK8试剂盒、RIPA裂解液、制胶试剂盒、上样缓冲液、ECL化学发光试剂盒（上海碧云天公司）；抗GMFB抗体、山羊抗兔IgG二抗（英国Abcam公司）。主要仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、NanoDrop分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养与转染将冻存的细胞复苏，用含10%FBS的DMEM培养液将细胞培养于二氧化碳恒温培养箱中，每2 3 d更换一次培养液。当细胞融合度达到80%90%时，将细胞消化并以5105/孔的密度接种到6孔板中。培养过夜后，用miR-654-3p mimics或mimics NC及pcDNA-GMFB转染细胞，严格按照转染试剂说明书进行。置于培养箱中孵育6 h后，更换细胞培养液，继续培养48 h，然后收集各组细胞进行后续实验。1.2.2 生物信息学分析在GEO数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索GSE70367数据集，然后采用GEO2R在线分析工具对数据集中骨肉瘤细胞和正常细胞进行miRNA表达差异分析，筛选满足 P 值0.05 且 logFC 绝对值2 的前 20 个miRNA。在 TargetScan7.2 数据库（https:/www.targetscan.org/vert_72/）和 miRmap 数据库（https:/mirmap.ezlab.org/app/）中输入has-miR-654-3p，对其靶基因进行预测。在TCGA数据库（http:/cancergenome.nih.gov/）中下载骨肉瘤患者的GMFB表达数据和临床信息，使用R软件4.0.2版本基于survminer R软件包和survival R软件包绘制GMFB与骨肉瘤患者总体生存率的KM生存曲线，rms R软件包和survival R软件包绘制骨肉瘤患者的生存预后列线图。1.2.3 RT-qPCR实验提取各处理组的不同骨肉瘤细胞的总RNA，根据逆转录试剂盒的说明书反转录合成cDNA，然后按照RT-qPCR试剂盒的反应体系进行定量检测。引物序列如下：miR-654-3p 上游引物：5-AGCGAATATGTCTGCTGACCA-3，下游引物：5-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3；U6上游引物：5-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3，下游引物：5-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3；GMFB上游引物：5-ACGCCTGGTGGTACTGGATGAG-3，下游引物：5-GCGAGGTTGTCGTTCAGGTAGTTC-3；GAPDH 上游引物：5-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3，下游引物：5-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3。1.2.4 Western blot实验收集各处理组的骨肉瘤细胞进行裂解，提取总蛋白，然后加入上样缓冲液在金属浴中煮沸10 min。将蛋白样品经过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育和二抗孵育，采用ECL化学发光试剂盒在化学发光成像系统中进行显色。选用抗 GMFB 抗体（11 000）、山羊抗兔 IgG 二抗（12 000）。将目的蛋白和内参蛋白GAPDH的比值作为相对定量结果。1.2.5 双荧光素酶报告基因实验将包含GMFB 3UTR区的野生型和突变型pGL3报告质粒，分别和 miR-654-3p mimics 或 mimics NC 一起转染MG-63细胞和HOS细胞。在二氧化碳恒温培养箱中培养48 h后，测定两种骨肉瘤细胞的荧光素酶活性。1.2.6 CCK8实验将处于对数生长期的各处理组骨肉瘤细胞以1 500个每孔的数量接种于96孔板中，在二氧化碳恒温培养箱中培养72 h。弃去上清液，在每孔中加入含10%CCK8溶液的培养液进行孵育。孵育2 4 h后，将96孔板置于酶标仪中在450 nm波长下检测各孔吸光度OD值。1.2.7 菌落形成实验（colony forming units，CFU）将处于对数生长期的各处理组骨肉瘤细胞以300个每孔的数量接种于6孔板中，然后置于二氧化碳恒温培养箱中，每3 d观察一次菌落形成数量。培养14 d后，当出现肉.362023 年 08 月第 20 卷 第 4 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY眼可见的菌落时，弃去培养液，用4%多聚甲醛固定后用结晶紫溶液进行染色。拍照并对克隆数进行计数。1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，结果用均值标准差的方式表示。两组间的比较采用Student t检验，三组或三组以上采用单因素方差分析。KM生存曲线采用单因素Cox回归分析，而预后列线图的绘制采用单因素和多因素Cox回归分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 GEO数据库筛选骨肉瘤细胞中异常表达的miRNA通过GEO数据库检索到包含骨肉瘤细胞和正常细胞的miRNA表达值的数据集GSE70367，通过GEO2R工具分析骨肉瘤细胞与正常细胞差异表达最明显的20个miRNA。结果发现其中有4个miRNA表达明显上调，16个miRNA表达明显下调。在这些差异表达的miRNA中，miR-654-3p在骨肉瘤细胞样本中明显下调（见图1）。2.2 miR-654-3p在骨肉瘤细胞系中的表达情况通过PCR实验检测了正常成骨细胞hFOB1.19和143B、MG-63、SAOS2 及 HOS 骨肉瘤细胞中 miR-654-3p 的表达情况，结果如图2所示。与hFOB1.19细胞相比，miR-654-3p在这4种骨肉瘤细胞系中的表达均明显下调，且以MG-63细胞和HOS细胞最为明显。2.3 miR-654-3p靶向调控GMFB如图3所示，通过TargetScan 7.2数据库和miRmap数据库预测到 GMFB 基因是 miR-654-3p 的靶基因之一，且PCR 检测发现，与 hFOB1.19 细胞相比，GMFB 在 143B、MG-63和HOS骨肉瘤细胞中的含量明显上调。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-654-3p mimics能够明显降低野生型GMFB-WT转染的MG-63细胞和HOS细胞的荧光素酶活性，而对突变型GMFB-Mut转染的细胞的荧光素酶活性没有明显影响，而阴性对照组mimics NC转染的细胞同样没有明显变化（见图4）。miR-654-3p mimics转染的MG-63细胞和HOS细胞中的GMFB在mRNA和蛋白质水平的表达明显降低（见图5）。2.4 miR-654-3p和GMFB对骨肉瘤细胞增殖的影响情况CCK8实验和CFU实验结果均显示，与mimics NC组相比，miR-654-3p mimics转染能够明显抑制MG-63细胞和HOS细胞的增殖，且这种抑制现象能够被pcDNA-GMFB转染所逆转（P0.05，见图6）。A AB B图3 A.miR-654-3p与GMFB mRNA的预测结合位点；B.正常成骨细胞和骨肉瘤细胞中GMFB的表达注：红色标出为突变位点；*表示与hFOB1.19细胞相比，P0.05。图2 正常成骨细胞和骨肉瘤细胞中miR-654-3p的表达 注：*表示与hFOB1.19细胞相比，P0.05。A AB B图 1 GSE70367 数 据 集 中 骨 肉 瘤 细 胞 差 异 表 达 的 miRNA：A.GSE70367数据集中差异最明显的20个miRNA；B.miR-654-3p在骨肉瘤样本中的表达情况图4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-654-3p与GMFB的结合注：*表示与mimics NC组相比，P0.05。.372023 年 08 月第 20 卷 第 4 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY#*2.5 GMFB的表达对骨肉瘤患者预后的影响情况通过 TCGA 数据库下载骨肉瘤患者的临床信息和GMFB表达数据，KM生存曲线显示GMFB高表达患者的总体生存率明显低于低表达患者（见图7）。列线图则展示了通过年龄、性别、转移情况、放疗情况和GMFB的表达量对骨肉瘤患者的 1 年、3 年和 5 年生存率的预测情况（见图8）。3 讨论既往研究表明，miRNA在成骨方面发挥着重要作用，miRNA是破骨细胞维持骨吸收活性以及成骨细胞增殖和分化过程中的重要调节因子，如miR-29b、miR-141和miR-200a均对成骨细胞的分化起到调节作用7-8。miRNA的失调是骨退化、吸收和骨肿瘤形成等相关骨疾病中的一个重要病理因素9，miR-21在骨肉瘤中过表达，能够参与肿瘤抑制基因和凋亡相关蛋白的调节，如 TPM1、PDCD4 和TIMP3等10。miR-125和miR-143的异常表达也都对骨肉瘤细胞的异常增殖产生影响，与骨肉瘤的发展密切相关11-12。B BA A图5 miR-654-3p模拟物对骨肉瘤细胞中GMFB表达的干预情况：A.PCR实验检测GMFB在mRNA水平的变化；B.Western blot实验检测GMFB在蛋白质水平的变化注：*表示与mimics NC组相比，P0.05。图7 GMFB对骨肉瘤患者生存预后的影响情况 注：蓝色为GMFB低表达患者，红色为GMFB高表达患者。A AB B图6 CCK8实验和CFU实验检测miR-654-3p和GMFB对骨肉瘤细胞增殖的影响：A.CCK8实验检测MG-63和HOS细胞增殖的变化；B.CFU实验检测MG-63和HOS细胞增殖的变化注：*表示与mimics NC组相比，P0.05；#表示与miR mimics组相比，P0.05。分数年龄性别转移情况放疗情况GMFB总分线性预测1年总体生存率3年总体生存率5年总体生存率图8 基于临床信息和GMFB表达量构建的骨肉瘤患者预后列线图.382023 年 08 月第 20 卷 第 4 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY然而目前对骨肉瘤的发病机制研究仍然不足，已发现的异常表达的miRNA未能在骨肉瘤更深入的治疗中提供有力的指导作用，所以骨肉瘤中miRNA的调控谱仍有待完善。因此，本研究对骨肉瘤中miRNA的调控作用继续进行深入挖掘，为骨肉瘤的发病机制、治疗靶点选择和生存情况预测提供更多的理论依据。本研究首先通过GEO2R在线工具分析GSE70367数据集中骨肉瘤细胞与正常细胞之间的miRNA表达差异，以此来筛选骨肉瘤中异常表达的miRNA。笔者发现在表达差异最明显的前20个miRNA中有4个明显上调，16个明显下调。miR-654-3p 是一种在 2010 年才被首次公开描述的miRNA，其生物学功能在2014年被报道。Geraldo等13发现，miR-654-3p在甲状腺乳头状癌中明显下调，在体外逆转miR-654-3p能够降低癌细胞的增殖和迁移，并且诱导转移相关基因的表达降低，这表明miR-654-3p具有肿瘤抑制作用。Pu等14发现miR-654-3p无论是在非小细胞肺癌患者还是细胞系中的含量都显著降低，并且与患者的肿瘤大小和肿瘤淋巴结转移分期显著相关。miR-654-3p通过负调控靶基因PLK4显著增加癌细胞的凋亡和肿瘤的体内生长。鉴于miR-654-3p作为基因调控分子密切参与其他肿瘤的发生发展，而目前关于miR-654-3p在骨肉瘤中的表达及调控作用尚未见报道，因此笔者聚焦在miR-654-3p展开后续研究。笔者首先通过PCR实验对骨肉瘤细胞中miR-654-3p的表达进行检测，结果发现与人正常成骨细胞hFOB1.19相比，miR-654-3p在人骨肉瘤细胞中均明显下调。随后通过TargetScan网站和miRmap网站对miR-654-3p的靶基因进行预测，在两个网站中都显示miR-654-3p能够与GMFB基因特异性结合。于是，笔者猜测miR-654-3p能够通过调控GMFB的表达来参与骨肉瘤细胞的生物学功能。GMFB是一种生长和分化因子，主要参与脊椎动物大脑的生长和分化、中性粒细胞趋化性、单核细胞迁移、T淋巴细胞迁移和黏附等过程15-17。GMFB在几种神经炎症和神经退行性变情况下上调，而GMFB的表达增加还与包括胶质瘤和卵巢癌在内的多种类型的癌症高度相关，且与肿瘤患者的预后不良相关18-20。Liu等21的研究发现，在高血糖诱导的人视网膜色素上皮细胞中过表达的 miR-5195-3p 负调控GMFB基因的表达，增强细胞凋亡和促炎细胞因子的分泌。本研究中双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，在MG-63和 HOS 细胞中 miR-654-3p 能够与 GMFB 相结合，且被miR-654-3p的模拟物负向调控，因此这说明miR-654-3p在骨肉瘤细胞中作为GMFB的基因表达调控因子来发挥作用，这与笔者的预测是一致的。为了检测miR-654-3p及GMFB是否能对骨肉瘤细胞的增殖发挥作用，笔者进行了CCK8和CFU实验，结果显示miR-654-3p的增加能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，且这种抑制作用能够被GMFB所逆转，这说明miR-654-3pGMFB轴能够参与骨肉瘤细胞增殖的调控过程。探究肿瘤发病的分子机制主要是为肿瘤诊断、治疗和预后判断提供理论依据，而在骨肉瘤的研究中仍然缺乏一个可靠的生存预后预测模型。为了验证本研究中GMFB基因调控作用对骨肉瘤患者生存预后的影响，笔者对TCGA数据库中骨肉瘤患者的GMFB表达和临床信息进行综合分析，结果发现GMFB高表达患者的总体生存率要明显低于低表达患者。此外，笔者构建了一个包含GMFB表达量、年龄、性别、转移情况和放疗情况的生存预后模型，能够根据以上几种因素对骨肉瘤患者的1年、3年和5年生存率进行预测，方便判断骨肉瘤患者的预后生存情况，这为骨肉瘤患者的生存发展方向及治疗选择提供了更加丰富可靠的数据支持。综上所述，本研究发现骨肉瘤细胞系中表达降低的miR-654-3p能够调控靶基因GMFB的表达，且二者的调控作用影响骨肉瘤细胞的增殖能力。本研究还构建了通过GMFB基因表达量来预测骨肉瘤患者生存预后情况的列线图模型。研究揭示了miR-654-3pGMFB轴在骨肉瘤中的作用，为miR-654-3p和GMFB可能作为骨肉瘤诊断标志物提供了理论依据。参考文献1 Belayneh R,Fourman MS,Bhogal S,et al.Update on osteosarcomaJ.Curr Oncol Rep,2021,23(6):71.2 Whelan JS,Davis LE.Osteosarcoma,chondrosarcoma,and chordomaJ.J Clin Oncol,2018,36(2):188-193.3 Tian H,Cao J,Li B,et al.Managing the immune microenvironment of osteosarcoma:The outlook for osteosarcoma treatmentJ.Bone 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