鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究.pdf

第38 卷第3期2023年7 月文章编号：2 0 9 6-47 49(2 0 2 3)0 3-0 30 0-11引文格式：李成，刘春敬，柳月，李博文，谢建治.鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究J.林业与生态科学，2 0 2 3，38（3）：30 0-310.LI Cheng,LIU Chunjing,LIU Yue,LI Bowen,XIE Jianzhi.Primary research of broad-spectrum and biodegradationpathways of phthalic acid esters by Acinetobacter baumannii DP-2J.Forestry and Ecological Sciences,2023,38(3):300-310.鲍曼不动杆菌 DP-2 降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究林业与生态科学FORESTRY AND ECOLOGICAL SCIENCESDOI:10.13320/ki.hjfor.2023.0038Vol.38 No.3Jul.2 0 2 3李成1,刘春敬1，柳月1,李博文1,谢建治1（1河北农业大学资源与环境科学学院，河北省农田生态环境重点实验室，河北保定0 7 10 0 1；2省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室，河北保定0 7 10 0 1)摘要：微生物降解是修复邻苯二甲酸酯(PAEs)污染土壤的有效途径，本研究以15种邻苯二甲酸酯（PAEs)为目标污染物,研究鲍曼不动杆菌DP-2对直链、侧链及环状取代PAEs的生物降解特性和降解途径。研究结果表明，直链取代PAEs中，随着烷基碳原子数增加,DP-2对PAEs的降解率逐渐升高，其对邻苯二甲酸二丁酯（DBP)降解率最高，为9 4.52%；对邻苯二甲酸二甲酯（DMP)的降解率最低，为42.30%；侧链取代PAEs中,DP-2对邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基已基）酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丙烯酯（DAP)、邻苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP)的降解率分别为9 2.33%、52.2 2%、7 7.31%和2 7.7 5%；环状取代PAEs中,DP-2对邻苯二甲酸丁酯（BBP）、邻苯二甲酸二苯酯（DPHP）、邻苯二甲酸二环已酯(DCHP)的降解率分别为8 9.8 7%、8 0.56%和6 2.9 1%。在此基础上，以DBP为代表性PAEs，采用GC-MS对DP-2的主要降解产物进行了鉴定，主要由DMP、M BP、PA 和苯甲酸衍生物组成,DBP主要通过转酯化和水解2 个途径转化为DMP和MBP,进一步转化为PA,继续被降解为BA。通过对不同取代PAEs降解途径分析,进一步证实了菌株DP-2对PAEs的降解途径。本研究结果表明DP-2降解PAEs具有较好的广谱性，在土壤PAEs污染修复领域具有较好的应用前景。关键词：邻苯二甲酸酯；生物降解；广谱性；降解途径中图分类号：X592Primary research of broad-spectrum and biodegradation pathways ofphthalic acid esters by Acinetobacter baumannii DP-2文献标志码：ALI Cheng 2,LIU Chunjing,LIU Yue,LI Bowen,XIE Jianzhil(1 College of Resources and Environmental Science,Hebei Agricultural University,KeyLaboratory for Farmland Eco-Environment of Hebei Province,Baoding 0710ol,China;2 State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation,Baoding 071ool,China)Abstract:Microbial degradation was an effective way to repair soil contaminated withphthalate esters(PAEs).In this study,a total of fifteen phthalic acid esters(PAEs)were收稿日期：2 0 2 3-0 1-18基金项目：国家自然科学基金项目（519 0 8 18 9）；河北省自然科学基金（2 0 2 2 2 0 40 2 9）。第一作者：李成（19 8 2-），男，河北保定人，硕士研究生，助理研究员，研究方向为土壤环境质量评价与监控。通信作者：谢建治（19 6 9-），男，安徽安庆人，博士，教授，研究方向为农业环境保护。第3期李成，等.鲍曼不动杆菌DP2 降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究selected as target pollutants to investigate the biodegradation characteristics and degradationpathways of different straight-chain,side-chain and cyclic-chain PAEs by strain Acinetobact-er baumannii DP-2.The results indicated that the degradation rate of PAEs by DP-2 in-creased gradually with the increasing of alkyl carbon atom number in straight-chain PAEs.The highest degradation rate appeared in the dibutyl phthalate(DBP)treatment with thevalue of 94.52%while the lowest value appeared in the dimethyl phthalate(DMP)treatmentwhich was 42.30%.For the studied side-chain PAEs,the degradation rates of disobutylphthalate(DIBP),di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP),diallyl phthalate(DAP)and di-methoxyethyl phthalate(DMEP)of DP-2 were 92.33%,52.22%,77.31%and 27.75%,respectively.For the studied cyclic-chain PAEs,the degradation rates of butyl benzylphthalate(BBP),diphenyl phthalate(DPHP)and dicyclohexyl phthalate(DCHP)of DP-2were 89.87%,80.56%and 62.91%,respectively.Taking DBP as the representative PAEs,the intermediate metabolites of DP-2 were identified by GC-MS,which were mainly com-posed of DMP,MBP,PA and benzoic acid derivatives.DBP was firstly degraded into DMPand MBP via transesterifification and hydrolysis,further converted into PA,continued to bedegraded into BA.The degradation process of PAEs by DP-2 was further confirmed by ana-lyzing the degradation pathway of different substituted PAEs.The above results proved DP-2 had quite broad spectrum and had good application potential for soil PAEs remediation.Keywords:phthalic acid esters;biodegradation;broad-spectrum;degradation pathway邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PA Es)是一类由邻苯二甲酸与不同碳链结构的醇形成的酯，主要包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP）、邻苯二甲酸二丁酯(DBP）、邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)等。该类物质能够增强塑料产品的弹性和柔韧性，通常作为增塑剂被广泛用于农用塑料薄膜、食品包装袋，也可作为添加剂用于建筑材料、玩具、化妆品、农药等2 。其中,DMP、DnBP和DEHP这3种PAEs由于具有典型的内分泌干扰性和潜在的“三致”效应，被美国环保署和中国国家环境监测中心列人“优先控制污染物 3。由于PAEs在农业、工业和生活领域的广泛使用，导致其在土壤、水、空气、污泥等环境介质和生物体内残留严重，已经成为环境中最普遍存在的有机污染物之一,对生态系统和人体健康构成严重威胁-6 。土壤是PAEs重要的储藏库和中转站，科学修复土壤中PAEs污染对于降低生态环境风险和维系土壤健康具有重要意义7。微生物修复由于成本低廉、环境友好被认为是最有前景的PAEs修复技术之一8 。目前，国内外有关PAEs微生物降解的研究很多，研究者陆续从土壤、污泥、河道底泥等不同环境介质中分离筛选出DBP高效降解菌株Pseudomonas sp.YJB6和No-vosphingobium sp.DNB-S3L0-10,DEHP高效降解菌株Acinetobacter sp.SN13和Pseudomonas sp.301XB，上述研究主要侧重于单一短链二烷基类或长链二烷基类邻苯二甲酸酯的微生物降解效果和机理9-12 。此外，一些学者也针对同一降解菌株开展了多种PAEs污染物的降解研究，Chen等从沉积物中筛选分离一株能够以DBP和DEHP作为唯一碳源的降解菌 Cupriavidus oalaticus E313;Zhang等从土壤中筛选分离1株BacillusmojavensisB1811,可以对7 种PAEs进行生物降解14；梁浩花等从设施菜地土壤中筛选分离1株MicrobacteriumSp.MB1,其能够对DMP、D BP和DEHP生物降解15。在土壤中往往是各种PAEs共存，DMP、DEP、D BP、D EH P、BBP等污染物在土壤中的浓度和检出频率均较高，因此，针对同一降解菌株，开展多种PAEs污染降解研究尤为重要。课题组前期从张家口某污水处理厂活性污泥中筛选出1株DBP高效降解菌鲍曼不动杆菌DP-2（以下简称:DP-2）。本研究以DP-2为供试菌株，采用批式培养试验，比较分析该菌株对不同结构类型（直链、侧链和环状)PAEs的降解效果，并以DBP为代表性降解底物,解析该菌株的降解途径,研究结果可为PAEs污染土壤的生物修复提供理论支持。1材料与方法1.1材料供试菌株为课题组前期从污水处理厂活性污泥302中分离筛选的高效DBP降解菌：鲍曼不动杆菌DP-2（保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号No.22236)。1.2仪器、药品和培养基气相色谱一质谱联用仪（GCM S，7 8 9 0 B7000C,美国Agilent公司）；紫外分光光度计（UV-5100B，上海元析仪器有限公司）；超声清洗器（K Q 52 0 0 D B，昆山超声仪器有限公司）；高压灭菌器（G R8 5D A，厦门致微仪器有限公司）；大容量全温振荡器（DHZ-DA，太仓实验设备厂）。15种PAEs标准品邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPRP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP）、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸二王酯(DINP）、邻苯二甲酸二癸酯(DIDP）、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP）、邻苯二甲酸双（2 一乙基已基)酯(DEHP）、邻苯二甲酸二丙烯酯（DAP）、邻苯二甲酸二(2 一甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二环已酯（DCHP)（分析纯标准品GC99%，上海源叶生物科技有限公司）（见附表）。试验中其他化学试剂均为分析纯，所有溶剂均为色谱纯。牛肉膏蛋白培养基（LB)：牛肉膏5g/L，蛋白陈10g/L,NaCl 5 g/L,pH 值为 7.2 7.4。无机盐培养基（MSM)：K,H PO 45.1g/L,KHzPO4 2.5 g/L,（NH 4)2 SO 4 2.0 g/L,M g C l20.16g/L,微量元素溶液1.0 mL。微量元素溶液：CaCl20mg/L，Na 2 M o O 42H2O 2.4 mg/L,FeSO4:7H2O 1.8 mg/L,MnCl2:4 H,0 1.5 mg/L。1.3菌悬液的配制将菌株DP-2（甘油保存)接入已灭菌的LB液体培养基中，放人摇床进行富集，培养2 4h，然后，将富集培养好的菌液离心15min，转速为50 0 0rpm，离心后收集离心管底部菌体，将菌体用灭菌的磷酸缓冲液反复冲洗2 3次，再次离心收集菌体，最后，用磷酸缓冲液将菌体重悬，将菌悬液密度调至OD600=1.0（平板计数菌密度约为3.0 10 个/mL),待用。1.4菌株DP-2对不同结构PAEs降解试验1.4.1菌株DP-2对不同直链PAEs降解试验试验选取的直链PAEs主要包括DMP、D EP、DPRP、D BP、D NO P、D O P、D I NP 和 DIDP,将上述各PAEs分别配制成浓度为1g/L的正已烷母液，待用。向盛有50 mL无机盐培养基的锥形瓶中加林业与生态科学人0.5mL配制好的1g/L的正已烷母液，使PAEs的最终浓度为10 mg/L,再按10%的接菌量将菌株DP-2加入上述无机盐培养基中，每个处理3次重复，此外，每组试验设置不接菌的无机盐培养基溶液作为对照（CK），30、150 r p m 下，封口膜密封培养6d,每隔2 4h取样，紫外分光光度计测定菌株DP-2的OD60o值,GC-MS测定锥形瓶溶液中的PAEs浓度,计算 DP-2对 PAEs的降解效率16 1.4.2菌株DP-2对不同侧链PAEs降解试验试验选取的侧链PAEs主要包括DIBP、D EH P、DAP和DMEP,将上述PAEs分别配制成1g/L的正已烷母液，待用。试验过程同1.4.1。1.4.3菌株DP-2对不同环状PAEs降解试验试验选取的环状PAEs主要包括DPHP、BBP和DCHP,将上述PAEs分别配制成1g/L的正已烷母液，待用。试验过程同1.4.1。1.5样品的提取待降解完成后，将50 mL正已烷加入锥形瓶中，超声萃取30 min，对溶液进行分液并收集有机相,通过加入4g无水硫酸钠对有机相进行干燥，浓缩至0.5mL,最后用正已烷对干燥过的有机相进行定容至1mL,放2 mL样品瓶中，用于GC-MS分析16 。1.6降解产物的提取选取降解反应时间在48、7 2 h，分别提取DP-2的降解中间产物（方法同1.5），通过GC一MS检测，将结果比对NIST14数据库进行定性分析。1.7仪器工作条件气相色谱条件：Agilent HP5M SU I 色谱柱(30m0.25mmX0.25m)；进样口温度为2 8 0；程序升温：初始柱温8 0，保持1min，以2 0/m i n 上升至2 8 0，保持4min；载气：氮气，流速1mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1uL。质谱条件：电子轰击离子源模式（EI），离子源温度30 0，四极杆温度150，MSD传输线温度30 0,电子能量7 0 eV;扫描范围50 550 m/z16。1.8数据分析采用Oringin9.0和SPSS28.0软件对试验数据进行统计分析。2统结果与分析2.1菌株DP-2对不同直链取代PAEs的降解特征分析2.1.1菌菌株DP-2菌体细胞浓度的动态变化菌株DP-2降解不同直链PAEs过程OD600的变化规律见图1。第38 卷第3期李成，等.鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究1.21.00.80.60.40.20.050图1DP-2降解不同直链PAEs过程ODoo的变化规律Figure 1Variation law of ODoo during the cultivation ofDP-2 degrading different straight-chain PAEs本试验选用8 种不同的直链取代PAEs作为降解底物，比较分析了菌株DP2 在培养过程的菌体细胞浓度（OD600）动态变化。由图1可见，菌株DP-2能够以试验选取的8 种PAEs为底物进行生长。从总体趋势来看，菌株DP2 在培养的第1天即进人对数增长期；到第2 天后，各处理的OD600达到最大值，为0.8 30.9 6；培养3d后进入衰亡期，各处理的OD60o开始下降；到第6 天培养结束时，各处理的OD60维持在0.410.50 左右。各处理的OD600在对数增长期无显著性差异（P0.05），进入衰亡期后有些不同，具体表现在以DNOP和DINP为底物的处理具有较高的OD600。例如，在第4天时，DNOP处理的OD600为0.6 9，显著高于其他试验处理(P0.05)。2.1.2菌株DP-2对直链取代PAEs降解率的动态变化菌株DP-2降解不同直链PAEs过程PAEs降解率的变化规律见图2。100r80%/率博划604020图2DP-2降解不同直链PAEs过程PAEs降解率的变化规律Figure 2Variation law of PAEs degrading ratesduring the cultivation of DP-2 degradingdifferent straight-chain PAEs由图2 可见，菌株DP-2对试验选取的8 种直链取代PAEs的降解率存在显著不同。经过6 d的培养，菌株DP-2对DBP和DOP的降解率最高，303DMP分别为9 4.52%和8 7.46%，显著高于其他试验处理DEPDPRPDBPDNOPDOPDINPDIDP412时间/dTime32时间/dTime（P 0.0 5），而DMP和DEP的降解率最低，分别为42.30%和49.8 7%，显著低于其他试验处理（P0.05)。2.2菌株DP-2对不同侧链取代PAEs的降解特征分析35456DMPDEPDPRPDBPDNOPDOPDINPDIDP62.2.1菌株DP-2菌体细胞浓度的动态变化菌株DP-2降解不同侧链PAEs过程OD60o的变化规律见图3。1.21.00.80.60.40.20.00图3DP-2降解不同侧链PAEs过程ODoo的变化规律Figure 3 Variation law of ODoo during the cultivation ofDP-2 degrading different side-chain PAEs选取DIBP、D EH P、D A P、D M EP作为典型侧链取代PAEs，研究了菌株DP一2 降解不同侧链取代PAEs过程OD6oo的变化规律。由图3可见，与直链取代PAEs基本相似，培养2 d后各处理的ODoo值均达到最大，为0.8 50.9 6。各处理间的OD600值无显著性差异（P0.05），表明菌株DP-2能够以DIBP、D EH P、D A P、D M EP作为碳源和能源维持其生长代谢。2.2.2菌株DP-2对侧链取代PAEs降解率的动态变化菌株DP-2降解不同侧链PAEs过程PAEs降解率变化规律见图4。10080%/索撕刺604020图4DP-2降解不同侧链PAEs过程PAEs降解率变化规律Figure 4 Variation law of PAEs degrading rate during thecultivation of DP-2 degrading differentDIBP.DEHPDAPDMEP12时间/dTimeDIBPDEHPDAPDMEP一3时间/dTimeside-chain PAEs344566304菌株DP-2对4种侧链取代PAEs呈现不同的降解规律，各处理间的PAEs降解规律存在显著不同（P 0.0 5），只有在第2 天，BBP处理的OD600值为0.5,显著高于其他试验处理。此外，菌株DP-2降解环状取代PAEs的最大值为0.40.5低于直链和侧链取代PAEs作为底物的OD600，推测原因是菌株DP-2以环状取代PAEs为底物时开环困难，因此生长速率较低。2.3.2菌株DP-2对环状取代PAEs降解率的动态变化菌株DP-2降解不同环状取代PAEs过程PAEs降解率的变化规律见图6。林业与生态科学100DPHPBBPDCHP80%/率想刻6040200O图6DP-2降解不同环状取代PAEs过程PAEs降解率的变化规律Figure 6Variation law of PAEs degrading rate during thecultivation of DP-2 degrading different cyclic-chain PAEs由图6 可见，菌株DP-2可以利用供试的3种不同环状取代的PAEs作为碳源生长。DP-2在以DPHP、BBP、D C H P为降解底物时的降解率存在显DPHPBBPDCHP12时间/dTime第38 卷一2时间/dTime著不同（PMBP-PA)。在此过程中,DBP通过水解，然后再进一步水解生成PA。同时，试验还检测到苯乙酮、苯甲酸乙烯酯、苯甲酸苯基酯和苯甲酸2 一乙基已酯，保留时间分别为10.9 0 7、13.6 19、19.0 6 3、19.7 51min，这些物质是苯甲酸衍生物,可以推断,邻苯二甲酸通过脱羧反应生成苯甲酸。此外,在培养的2 412 0 h内，未发现积累的中间产物，表明菌株DP-2对中间代谢物MBP、D M P和PA可有效降解。菌株DP-2对15种PAEs主要降解产物的鉴定见表1。表1DP-2对15种PAEs主要降解产物的鉴定Table 1 Identification of 15 PAEs main degradation products by DP-2质荷比/保留时间/(m z-1)minMass chargeRetentionratetime16313.413149,17715.21014917.62514920.153149,16727.253149、16 727.30214920.13714920.15314918.916149,16727.27514917.26014920.648149,16726.88214924.95614926.905水解产物离子Hydrolysate ion产物缩写质荷比/Product Acronyms(m 2-1)Mass chargerateMEP163MPRP163MBP163MNOP163MOP163MINP163MIDP163MIBP163MEHP163MAP163MMEP163MPHP163MBeP163MCHP163(MPRP）、邻苯二甲酸单丁酯（MBP）、邻苯二甲酸单正辛酯（MNOP）、邻苯二甲酸单辛酯（MOP）、邻苯二甲酸单壬酯（MINP）、邻苯二甲酸单癸酯（M I D P）、邻苯二甲酸单异丁酯（MIBP）、邻苯二甲酸单（2 一乙基已基)酯（MEHP）、邻苯二甲酸单丙烯酯（MAP）、邻苯二甲酸单（2 一甲氧基）乙酯保留时间/minRetentiontime13.40213.41313.40813.43013.43513.41913.44013.41913.42913.40313.45113.45113.47813.430306（M M EP）、邻苯二甲酸单苯酯（MPHP）、邻苯二甲酸单丁苄酯（MBeP）、邻苯二甲酸单环已酯（M C H P），上述降解产物表明菌株DP-2对PAEs的降解更倾向于图7 所示的降解途径b，但试验过程并没有检测到其他中间代谢产物，推测原因主要与菌株DP-2降解PAEs反应速率较快有关。3讨论3.1菌株DP-2对不同直链取代PAEs降解的动态分析在试验过程中发现不同直链取代PAEs的降解动态分为2 大类：一类是PAEs降解效率先快速升高，然后降低再升高，例如DMP、D EP、D PRP、DNOP、D O P、D I D P各处理在第2 天的PAEs降解率达到峰值后，降解率有所下降，而后逐渐升高；第二类降解动态则表现为PAEs降解率随培养时间逐渐升高的规律，以DBP作为代表。分析原因为菌株DP-2对PAEs的降解包括生物吸附和生物降解2个过程。生物吸附是细菌降解PAEs等疏水性有机污染物的重要步骤和决定因素，细菌在利用疏水性有机物的过程中，首先会将其吸附在菌体表面，然后再经过跨膜运输进人到细菌体内，在降解酶的作用下代谢转化成为自身的营养物质17 。推测第一种类型反应过程吸附速率大于生物降解速率，当培养体系吸附饱和以后，微生物的降解速率还比较低，则会有吸附的PAEs脱附重新进人溶液内，表现为PAEs降解效率下降，随后，当菌株进入对数增长期后，生物降解速率快速提高，导致生物降解速率大于吸附速率,最终表现为培养体系的PAEs降解率逐渐升高。相反,由于菌株DP2 的分离筛选是以DBP为底物,致使该菌株能够在短时间内具有较高的生物降解速率,能够跟吸附速率相平衡,则导致以DBP为底物时，降解率没有出现明显的下降。此外，本试验还发现，其他直链PAEs随着取代基碳原子数量增加，降解率依次升高。相关研究表明，Acinetobacter sp.strainM673对中等长度侧链的DBP、D PP和DPrP的降解效率比对短侧链的DMP、D EP降解效率高18 。也有报道指出，菌株Camelimonas sp.能够降解DBP，但不能在短于DBP烷基链的PAEs上生长，如DMP和DEPL19。林业与生态科学本研究中DP-2对 DMP、D EP的降解率远低于其他PAEs，虽然DMP具有邻苯二甲酸酯的较短烷基链。从结果可以看出，菌株DP-2对较长烷基链PAEs具有较高的亲和力。3.2菌株DP-2对不同侧链取代PAEs降解的动态分析在菌株DP-2对不同侧链取代PAEs降解试验中，由于侧链含碳原子以及取代烷基官能团的差异,4种PAEs表现出不同的降解效果。前期菌株筛选试验中，以DBP为驯化底物，菌株DP-2对DBP具有较高的降解率，而从结构组成来看,DIBP为DBP的同分异构体。因此,理论上讲,DP-2对DBP的异构体应该也有很好的降解效果。DEHP的烷基数量比DIBP多，但是降解效果较低，据报道，含有大体积烷基侧链、官能团的PAEs不易被降解2 0 。此外，由于DAP、D M EP侧链分别含有丙烯基(不饱和双键）、甲乙醚基，从酯基取代官能团结构来看,DAP酯基含有丙烯基，不饱和度高，较易断裂，而DMEP不易被降解，所以降解率较低。3.3菌株DP-2对不同环状取代PAEs降解的动态分析菌株DP-2对不同环状取代PAEs的降解率有显著差异，有研究发现，Sulfobacillusacidophi-lusDSM10332的酯酶对苄基或环已烷的大体积烷基侧链的PAEs无降解能力2 0 。从结构组成看，BBP的酯基带有苄基和丁基，空间位阻较小,因此具有相对较高的PAEs降解率；而DPHP的酯基带有2 个苯环,属于不饱和芳香烃，而DCHP的酯基带有2 个六元环，结构比较稳定，导致菌株DP-2对DPHP和DCHP的降解率较低。因此,菌株DP-2对PAEs降解的难易程度与PAEs取代基结构的空间位阻效应及取代基的不饱和度有关。从菌株DP-2对直链、侧链和环状不同取代基PAEs的动态降解试验看，菌株DP-2对PAEs的降解有较好的广谱性，具有应用于复合PAEs污染环境修复的潜力。Li等研究发现，HS-NH1对PAEs的底物广谱性试验中，微生物对长链的PAEs降解效果优于短链PAEs，该菌株在含有长链的DOP、D EH P和BBP的培养基里生长良好，虽然能利用DMP、D EP和DBP，但生长情况不如在长链第38 卷第3期李成，等.鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究PAEs好；鉴于微生物对PAEs的碳源利用特性，理论上它们具备较强的PAEs耐受能力和降解能力2 1。还有报道指出，微生物降解PAEs与侧链产生的空间位阻直接关系2 2 ；菌株B1811在4d内能完全降解50 0 mg/L的DEHP、D BP、BBP和DPP，但是仅能去除约43%的DEP和5.9%的DMPL14。杨统一等接种菌株 XHYG,能很好地利用DOP和DEHP,菌株XHYG对DOP的降解较DEHP要好2 3 3.4菌株DP-2对DBP的生物降解途径确定PAEs降解菌的生物降解途径对于降解菌在PAEs污染环境修复中的应用至关重要。本研究通过GC-MS对DP-2培养结束后的中间产物分析结果表明,通过一氧化和转酯化,将DBP(m/z=149)转化为DMP（m/z=16 3），然后通过水解脱酯产生PA（m/z=10 4)。此外,DP-2可将DBP水解为MBP（m/z=149），然后进一步反应转化为PA。形成上述降解途径并得到PA被认为是好氧微生物降解途径2 41。同时，GC-MS检测结果表明，检测到4种苯甲酸衍生物，可以推测,DP-2通过厌氧途径将PA转化为苯甲酸。据报道，在有氧条件下，兼性厌氧菌可以将PA转化为BAL25。也有报道指出，PA被一种兼性厌氧菌Bacillus mojavensisB1811降解为BA14。上述结果与本研究结果一致，这证明了菌株DP2 可以在好氧和厌氧条件下生长，具备兼性生长特征。在培养初期，菌株DP-2在氧气充足环境下降解DBP，随着降解过程持续进行，氧气浓度逐渐降低，导致培养系统内形成了厌氧环境，在厌氧途径下该菌株继续降解中间产物。PCA被认为是PAEs生物降解的重要代谢产物，然而,在本研究中未检测到PCA。原因可能是菌株DP-2对DBP的降解反应较快,PCA被环裂解酶降解，产生已二酸，然后，进人TCA循环2 3.2 6 。对于PAEs的生物降解，有报道称PAEs转化为PA是细菌降解的关键步骤2 1,2 5.2 7 。大多数PAEs和PAEs降解中间代谢产物可能会导致突变、发育毒性和增殖毒性,其中还有一些污染物被视为持久性污染物3。因此，一项安全的生物降解技术不应产生此类物质。有研究表明，一些菌株只能将PAEs降解为PA,因为这些菌株不能将PA作为维持菌株307生长的碳源19 。从GC-MS测试结果来看，MBP、DMP和PA3种成分的特征离子对应的丰度要比DBP小得多,在2 412 0 h内没有发现积累的中间产物，表明菌株DP-2可以利用MBP、D M P和PA作为碳源有效降解DBP。因此,菌株DP-2可以利用DBP并完成生物降解。此外，下一步还需对PAEs底物如何实现矿化过程进行解析，并开展菌株DP-2全基因测序研究工作，挖掘酯酶参与的反应过程,进一步验证降解效果的差异,明确菌株DP-2对PAEs的降解机制。4结论以高效降解菌DP-2为供试菌株，选取不同种类PAEs(直链、侧链、环状)作为降解底物，比较分析了菌株DP-2在培养过程的OD6o的动态变化规律以及对不同取代PAEs降解的广谱性。(1)菌株DP-2能够以试验添加的PAEs作为底物生长代谢，其在直链和侧链PAEs的OD6oo高于环状取代PAEs；在直链取代PAEs降解中，随烷基碳链增加,PAEs 降解效率提高；在侧链取代、环状取代PAEs降解中,由于酯基官能团不同,降解效率呈现显著的差异。菌株DP-2对不同种类PAEs降解具有良好的广谱性。(2)采用GC-MS测定分析了DP-2降解DBP的中间产物，主要有DMP、M BP、PA 及4种苯甲酸衍生物,从而推测了菌株DP-2对DBP的降解途径；通过对不同取代PAEs降解途径分析，进一步证实了菌株DP-2对PAEs的降解过程，该结果验证了对不同取代PAEs降解过程中的关键步骤，为研究DP-2对PAEs的降解机制提供了可靠的理论依据。参考文献：1李金荣，郭瑞昕，刘艳华，等.五种典型环境内分泌干扰物赋存及风险评估的研究进展J.环境化学，2 0 2 0，39（10）：2 6 37-2 6 53.2 CHOU K,WRIGHT R O.Phthalates in food and medical de-vicesJJ.Journal of the American College Medical Toxicology:Official,2006,2(3):126-135.3 ZHAO H M,DU H,FENG N X,et al.Biodegradation of di-n-butylphtha late and phthalic acid by a novel Providencia sp.2Dand its stimulation in a compost-amended soilJ.Biology andFertilityof 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