Leptosphaeria sp.CXY48来源苯并吡喃酮类化合物的研究.pdf

山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，August 2023，Vol.44 No.8Leptosphaeria sp.CXY48来源苯并吡喃酮类化合物的研究张明宇 刘晓霖 孔祥传 毕静 鲁欣怡 潘国军山东第一医科大学（山东省医学科学院）生命科学学院，山东 泰安 271016摘要：目的目的从泰山白首乌的根际土壤中分离出优质真菌，以期得到具有较好药理作用的天然产物。方法方法将真菌菌株Leptosphaeria sp.CXY48在大米培养基中静置发酵，以活性为导向，利用正、反相硅胶及高效液相色谱等方法进行单体化合物的分离纯化，并利用质谱、核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）等光谱技术对化合物结构进行鉴定。结果结果从泰山白首乌根际真菌Leptosphaeria sp.CXY48的次级代谢产物中分离得到4种苯并吡喃酮类化合物，通过光谱和理化性能的分析，确定其为Fusaraisochromanone 2（1），Clearanol I（2），Banksialactone A（3），（R）3，4dihydro4，6，8trihydroxy4，5dimethyl3methyleneisochromen1one（4），对化合物1 4进行了抗菌活性测试，发现化合物1和4对大肠杆菌标准菌株（E.coli ATCC25922）的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值分别为3.89和70 g/mL，对金黄色葡萄球菌标准菌株（S.aureus ATCC33591）的MIC值分别为187和250 g/mL。结论结论通过分离Leptosphaeria sp.CXY48的次级代谢产物，获得的4个化合物，其中有2个化合物有一定的抑菌活性。关键词：泰山白首乌；真菌；苯并吡喃酮；抑菌活性doi：10.3969/j.issn.2097-0005.2023.08.002Benzopyranones from the Fungus Leptosphaeria sp.CXY48ZHANG Mingyu，LIU Xiaolin，KONG Xiangchuan，BI Jing，LU Xinyi，PAN GuojunCollege of Life Sciences，Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，Taian 271016，ChinaAbstract：Objective：To isolate High-quality fungi from the rhizosphere soil of Cynanchum bungei Decne in order to obtain natural products with good pharmacological effects，which laid a material foundation for the development of new drugs with high efficiency and low toxicity.Methods：The fungal strain Leptosphaeria sp.CXY48 was fermented in rice medium by static fermentation，and the compounds were isolated and purified using normal and reversed-phase silica gel and high performance liquid chromatography，and the structures of the compounds were identified using mass spectrometry and NMR spectroscopic techniques.Results：Four benzopyrones were isolated from the secondary metabolites of Leptosphaeria sp.CXY48 from Cynanchum bungei Decne，and were identified by spectroscopic and physicochemical property analysis as Fusaraisochromanone 2（1），Clearanol I（2），Banksialactone A（3），and（R）-3，4-dihydro-4，6，8-trihydroxy-4，5-dimethyl-3-methyleneisochromen-1-one（4）.The antibacterial activity of compounds 1 4 was tested.It was found that the MIC values of compounds 1 and 4 were 3.89 and 70 g/mLforE.Coli ATCC25922，and 187 and 250 g/mLforS.aureus ATCC33591，respectively.Conclusion：Four compounds are obtained by isolating the secondary metabolites of Leptosphaeria sp.CXY48，two of which show some antibacterial activity.Key words：Cynanchum bungei Decne；fungi；benzopyranones；antibacterial activity泰山白首乌，也叫泰山何首乌，是泰安道地药材。目前，对白首乌的研究主要集中在其化学成分和药理作用，如抗肿瘤、抗衰老等方面 1。但对其根际微生物及其次级代谢产物的研究却鲜有文献报道 2。苯并吡喃酮及其衍生物属于有机杂环化合物3-4，为白色晶体或结晶性的粉末，又称香豆素，广泛分布于药用植物中。由于其种类繁多，结构复杂，其生理功能多样，如抗凝血、抗炎、抗癌症5、抗基金项目：2022年国家级大学生创新创业训练计划（202210439005，202210439008）。作者简介：张明宇，山东第一医科大学（山东省医学科学院）2020 级生物工程本科，研究方向：天然产物发现与结构修饰，E-mail：。通信作者：潘国军，博士，副教授，研究方向：生物制药研究，E-mail：。565山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，August 2023，Vol.44 No.8艾滋病毒6、抗肿瘤、治疗皮肤病等7-8，已广泛应用于人们的生活中9。此外，香豆素本身也是一种香料，广泛分布于曲霉菌、草木犀、香豆、熏衣草和菊芸香科等植物界10。本文从白首乌的根际土壤中分离得到一株真菌Leptosphaeria sp.CXY48，并从其发酵产物中分离得到4种苯并吡喃酮类化合物，通过光谱和理化性质分析，确定其结构。如前所述，本文以泰山白首乌根际土壤真菌为研究对象，筛选获得天然菌株 Leptosphaeria sp.CXY48（图1），选择最适的培养条件，通过大批发酵获得次级代谢产物，分离获得单体化合物并进行结构鉴定，最后评价其生物活性，为新型抗菌药物先导化合物开发提供新的思路。1材料与方法1.1实验材料1.1.1试剂与仪器，如表1所示。1.1.2样品来源白首乌根际土壤取自山东省泰山市泰山之上，距地表5 20 cm的白首乌地下根茎土壤。样本采集时间为2020年3月1日。1.1.3培养基类型分离培养基：PDA固体培养基，孟加拉红培养基；发酵培养基：ISP2培养基，真菌1号培养基，真菌2号培养基，真菌3号培养基，马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基，大米培养基；分析培养基：LB培养基。1.1.4 实 验 菌 株 以 金 黄 色 葡 萄 球 菌（S.aureusATCC33591）和大肠埃希菌（E.coliATCC25922）进行抑菌活性实验。1.2实验方法1.2.1样品处理在无菌环境下，采用倍数稀释法将泰山白首乌根际土壤悬液（1.0 g/L）并稀释成101、102、103和104 g/L 4个不同浓度。28，摇床24 h后，取100 L涂布在PDA和孟加拉红培养基上，然后在28 下倒置培养。1.2.2菌株的分离与纯化涂布3天后，用接种环将单个菌株挑出，在培养基上分区划线，分离纯化得到单菌落培养基，挑取单菌落3点培养，进一步观察其形态。1.2.3菌株排重与筛选将所分离出的单菌落接种到大米培养基，28 静置发酵25 d，用等量乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗提物，并配制成1.0 g/L甲醇溶液；根据形态特征、HPLC指纹图谱分析，排除重复菌株；以环丙沙星0.1 g/L作为阳性对照，测试次级代谢产物（10 L）的抗菌活性：以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，在37 培养箱中进行倒置培养一夜后，观察抑菌圈的大小。筛选出5株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性的菌株，并通过指纹图谱分析，确定天才菌株为CXY48。1.2.4菌株鉴定将确认的CXY48菌株在PDA平板上，倒置培养3 5 d，并测试ITS保守序列。基于基因测序的结果，在GenBank数据库中进行BLAST比对，查找同源的序列，选择有代表性菌株序列展开分析，构建系统进化树（图 2）。CXY48 菌株与Leptosphaeria sp.CPP-4具有高度的同源性，结合对其形态特征的分析，鉴定CXY48为小球腔菌属。图1实验菌株Leptosphaeria sp.CXY48表1实验所用试剂与仪器以及厂家信息试剂环丙沙星色谱甲醇C18键合相硅胶（40 60 m）硅胶（200 300 目）分析甲醇厂家信息天津市永大化学试剂有限公司天津市永大化学试剂有限公司上海博势生物科技有限公司青岛海洋化工有限公司天津永大化学试剂有限公司仪器质谱仪旋转蒸发仪核磁共振仪超净工作台高压蒸汽灭菌锅生化培养箱半制备高效液相色谱仪仪器型号/厂家信息Micromass Autospec-uitima-TOFRE-2000/上海亚荣生化仪器厂Bruckmercury Plus-400BSC-1000A2/苏净集团苏州安泰空气技术有限公司MLS-3781L-PC/松下健康医疗器械株式会社SPX-25085H-/上海新苗医疗器械制造有限公司Waters 600 Pump，600 controller，2487双波长检测器566山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，August 2023，Vol.44 No.81.2.5培养条件优化与发酵选取真菌1号、真菌2号、真菌3号、真菌4号、ISP2、PDB和大米培养基进行发酵培养基的筛选，并对培养时间、温度等条件进行优化。试验结果表明，在28 条件下，大米培养基静置发酵30 d最佳。取-80 冷冻保藏的 Leptosphaeria sp.CXY48菌种，无菌条件下，接种于PDA液体培养基中，28 摇床活化培养3 d。将活化好的菌种按照1%的接种量接种到灭完菌的大米培养基，共计140瓶，培养箱中静置发酵30 d。1.2.6粗提物的富集发酵结束后，用等量乙酸乙酯浸泡一夜，反复3次浸提，合并有机相减压浓缩得到粗提物。将粗提物溶于2 L乙酸乙酯溶解后，将其倒入分液漏斗中，用1/3体积自来水萃洗以除水溶性杂质，反复3次；乙酸乙酯相减压旋蒸得粗提物，用2 L 90%甲醇水溶液溶解后，加入1/3体积石油醚进行脱油处理，反复3次，甲醇水溶液浓缩后，得到最终粗提物。1.2.7代谢产物分离纯化采用减压硅胶柱层析技术，对其进行正、反向极性分段，以活性为导向确定分离的组分，并结合TLC、HPLC、硅胶柱层析和半制备色谱等进行次级代谢产物的分离与纯化，从而获得活性单体化合物。50 g粗提物利用减压硅胶柱层以乙酸乙酯：石油醚（v/v）10 1、8 1、6 1、4 1、2 1、1 1和0 1进行阶段梯度洗脱，经过HPLC分析合并得到5个馏分（Fr.1 5）。在十八烷基硅胶（ODS）中，馏分Fr.2（15.7105 g）和馏分 Fr.3（21.1076 g）以甲醇：水图2CXY48菌株的系统进化树567山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，August 2023，Vol.44 No.8（10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、100%）梯度洗脱，馏分Fr.2得到7个亚馏分（Fr.2-1 Fr.2-7）。将亚馏分Fr.2-2（2.8467 g）采用 HPLC（50%MeCN/H2O，v/v）得到化合物 1（tR 7.3 min，7.8 mg）和化合物4（tR 10.2 min，24.9 mg）；馏分Fr.3得到8个亚馏分（Fr.3-1 Fr.3-8）。将亚馏分Fr.3-3采用HPLC（47%MeOH/H2O，v/v）得到化合物2（tR 26 min，29.6 mg）和化合物3（tR 27 min，9.2 mg）。2结果2.1抑菌活性测试采用药敏纸片法测定了化合物1 4的抗菌活性，以环丙沙星（0.1 g/L）为阳性对照，结果如表1所示。其中，化合物1和化合物4对大肠杆菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值为3.89和70 g/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为187和250 g/mL，结果如表2所示。2.2活性代谢产物的结构鉴定将化合物1 4用核磁共振氢谱（1H-NMR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）和质谱（MS）等进行结构解析。化合物1：淡黄色固体，1 H NMR显示1个螯合羟基质子（H 11.28），1个羟基质子（H 7.87），1个单态芳香族质子（H6.43），1个羟甲基质子（H 4.22），1个甲氧基（H3.88），2个单态甲基（H2.11，1.80），1个双态甲基（H 0.93），13 C NMR和DEPT 135光谱显示了1个内酯碳基（171.5）、六季（165.4、156.5、149.9、112.2、103.0 和 91.9）、2 个甲基（98.2 和表24种化合物抗菌活性评价化合物编号化合物1化合物2化合物3化合物4环丙沙星指示菌株MIC值（E.coli ATCC25922）/（g mL1）3.89NONO7016.83（S.aureus ATCC33591）/（g mL1）187NONO2504.21表3化合物1 4 13CNMR（100MHz）在CDCl3中的数据位置1234567891011124a8a化合物1 C171.5，C-71.0，CH91.9，C112.5，C165.4，C98.2，CH156.5，C17.8，CH321.2，CH311.2，CH356.3，CH3149.9，C103.0，C化合物2 C171.5，C-86.1，CH71.7，C116.2，C165.9，C102.2，CH163.9，C60.9，CH220.6，CH312.2，CH3-147.9，C99.5，C化合物3 C168.7，C-103.1，C36.0，CH115.4，C164.9，C97.57，CH163.1，C65.6，CH215.6，CH310.1，CH355.84，CH3141.7，C99.2，C化合物4 C166.9，C-160.5，C72.1，C114.2，C166.2，C102.7，CH162.6，C95.3，CH229.1，CH311.8，CH3-143.8，C99.2，C表4化合物1 41H NMR（400 MHz）在CDCl3中的数据位置123456789101112C3OHC4OHC8OH化合物1 H（J in Hz）4.22，s6.43，s0.93，dd（6.6）1.80，s2.11，s3.88，s7.87，s11.28，s化合物2 H（J in Hz）-4.26，dd（2.1，7.7）-6.28，s-4.06，dd（2.1，11.9）3.85，dd（7.7，11.9）1.37，s2.29，s-化合物3 H（J in Hz）-3.27，q（7.0）-6.39，s-4.12，d（11.9）3.64，d（11.9）1.15，d（7.0）2.08，s3.86，s4.72，s-11.18，s化合物4 H（J in Hz）-6.40，s-5.10，d（1.7）4.97，d（1.7）1.74，s2.44，s-11.20，s568山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences，August 2023，Vol.44 No.871.0）和4个甲基（56.3、21.2、17.8和11.2）碳的共振，ESI-MS：m/z 275 M+Na+。以上数据和文献中Fusaraisochromanone 2一致，此化合物被鉴定为Fusaraisochromanone 211。化合物2：淡黄色固体，1 H NMR显示出2个伯甲基（H 1.07，2.07）、1个甲氧基（H 3.86）、1个亚甲基（H 3.90，3.80）、2个次甲基（H 3.29，4.50）和1个芳香质子（H 6.43）的信号，13 C NMR和DEPT光谱显示出13个碳共振，由3个甲基（1个氧化）、1个氧化亚甲基、3个次甲基（1个氧化和1个芳族）和6个非质子化碳（1个羰基和5个烯属）组成，ESI-MS：m/z 275 M+Na+。以上数据和文献中Clearanol 一致，此化合物被鉴定为Clearanol I12。化合物3：淡黄色固体，1 H NMR显示两组密切相关的信号，比率为5.8 1，1个芳族甲氧基的存在（c 56.0；H 3.84），1个单线态芳甲基（c 9.8；H 2.00），和1个单线态芳香质子（c 97.0；H 6.45），结合紫外光谱，表明是1个等色酮骨架。1 H核磁共振剩余的信号光谱为双峰甲基（c 16.3；H 1.06）偶联到苄型次甲基（c 35.0；H 3.28）和1个CH2OH基团（c 63.6；H 3.64，3.72），EI-MS：m/z 269.1023 M+Na+。以上数据和文献中Banksialactone A一致，此化合物被鉴定为Banksialactone A 13。化合物4：淡黄色固体，1H NMR显示1个单态芳香族质子（H6.40），2个单态甲基（H2.44，1.74），1个乙烯基（H5.10，4.97），1个酚羟基（H 11.20），13 C NMR光谱中，C-6共振出现在166.2 处，表明在该位置有酚官能团，C-9（c 95.3）表明该位置有1个烯烃，EI-MS：m/z 237.0773 M+Na+。以上数据和文 献 中（R）-3，4-dihydro-4，6，8-trihydroxy-4，5-dimethyl-3-methyleneisochromen-1-one（1）一致，此化合物被鉴定为（R）-3，4-dihydro-4，6，8-trihydroxy-4，5-dimethyl-3-methyleneisochromen-1-one（1）14。3结论本研究以泰山白首乌根际土壤中筛选出一种富含次级代谢产物且具有良好活性的Leptosphaeria sp.CXY48菌株，采用薄层层析法、HPLC、减压柱层析法和正/反相硅胶等手段，分离纯化，并用质谱、NMR等光谱技术对其进行了结构鉴定和活性评估；目前，共分离鉴定出4个单体化合物，其中2个具有抗菌作用。综上，可推断何首乌根际泥土中埋藏着丰富的真菌资源，是新型活性天然产物的重要泉源，为开发高效低毒的新型药剂提供思路。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献：1彭蕴茹，丁永芳，李友宾，等.白首乌研究现状 J.中草药，2013，44（3）：370.2张艳琪，周甜甜，彭川岳，等.泰山白首乌根际土壤真菌分离纯化及抗菌活性研究J.中国抗生素杂志，2021，46（6）：552.3董社英，李辉，李靖.香豆素衍生物合成研究进展 J.化学世界，2009，50（8）：494.4郭萍.香豆素和香豆素类的合成方法及研究进展 J.辽宁化工，1998（2）：18.5Sethna SM，Shah NM.The chemistry of coumarinsJ.Chem Rev，1945，36（1）：1.6Brun MP，Bischoff L，Garbay C.A very short route to enantiomerically pure coumarin-bearing fluorescent amino acids J.Angew Chem Int Ed Engl，2004，43（26）：3432.7Yeh TF，Lin CY，Chang ST.A potential low-coumarin cinnamon substitute：Cinnamomum osmophloeum leaves J.J Agric Food Chem，2014，62（7）：1706.8胡丽娜.苯并吡喃酮衍生物的设计、合成及其生物活性研究 D.上海：第二军医大学，2011.9常丽萍.苯并吡喃酮修饰的萘酰胺衍生物的合成及其抗肿瘤活性的评价 D.开封：河南大学，2018.10蔡淑颖.苯并吡喃酮化合物的合成反应研究 D.杭州：浙江大学，2012.11Boonyaketgoson S，Trisuwan K，Bussaban B，et al.Isochromanone derivatives from the endophytic fungus Fusarium sp.PDB51F5 J.Tetrahedron Lett，2015，56（36）：5076.12Luo X，Lin X，Salendra L，et al.Isobenzofuranones and isochromenones from the deep-sea derived fungus Leptosphaeria sp.SCSIO 41005 J.Mar Drugs，2017，15（7）：204.13Chaudhary NK，Pitt JI，Lacey E，et al.Banksialactones and banksiamarins：isochromanones and isocoumarins from an Australian fungus，Aspergillus banksianusJ.J Nat Prod，2018，81（7）：1517.14Tayone WC，Honma M，Kanamaru S，et al.Stereochemical investigations of isochromenones and isobenzofuranones isolated from Leptosphaeria sp.KTC 727 J.J Nat Prod，2011，74（3）：425.（收稿日期：2023-01-26）569