基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物.pdf

学校代码 10459学号或申请号学1512263044密 级_却刷上多硕士学位论文国家自然科学基金资助项目基于甲基化芯片及测序技术筛选 缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物学科门类：理学专业名称：遗传学培养院系：基础医学院 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年 月 日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年 月 日本论文获得国家自然科学基金面上项目资助项目名称：力0X54。基因启动子区CpG-SNPs与DNA甲基化互作 对缺血性脑卒中易感性的影响项目编号：81571154基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物研究生：张旭冉导师：郑红教授郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系 河南郑州450001摘要研究背景和目的：脑卒中(Stroke)是一种急性的脑血管疾病，是由于局部血液循环障碍所导 致的神经功能缺损综合症，具有死亡率高、发病率高、致残率高的特点，是全 世界第二大死亡原因，也是成年人致残的主要原因。脑卒中按照病因可分为缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)和出血性脑卒 中(Hemorrhagic Stroke,HS),IS约占脑卒中总数的87%。在我国，脑血管疾 病的死亡率和发病率显著高于心血管疾病，因此，脑卒中患者需要大量的社会 关注和医疗资源投入，寻找防治缺血性脑卒中的生物标志物尤为迫切。Ana M.Gomez-Uriz的研究小组发现，在肥胖的缺血性脑卒中患者中，KCNQ1启动子区甲基化水平可作为诊断IS的生物标志物。周淑宇等人的研究发 现，在缺血性卒中患者中CDKN2B甲基化水平能够影响主动脉弓的钙化程度。已有大量研究表明，许多疾病以及重要的生物过程受到表观遗传的调控。因此，从DNA甲基化的角度研究其对缺血性脑卒中的影响为我们提供了新的思路。DNA特定位点的甲基化修饰广泛存在于原核生物和真核生物中，能引起染色质 T的结构、DNA构象、DNA的稳定性及DNA与蛋白质的相互作用方式的改变,从而调控基因的表达，参与代谢途径调节。DNA的甲基化主要发生在基因启动 子区CpG岛，其甲基化状态的确定可以通过DNA甲基化测序的方法来实现。目前，从全基因组水平对IS的DNA甲基化水平进行研究未见有报道。因 此，本课题应用 Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip（850K 芯片）及 MethylTarget（目的区域甲基化水平测序），对IS患者与正常人外周血全基因组 甲基化的差异水平进行分析，筛选IS患者DNA甲基化水平显著变化的基因，最终，利用生物信息学的方法进行数据分析和挖掘，以期寻找与IS发生、发展 相关基因的DNA甲基化分子标志物。IS甲基化分子标志物的发现不仅有助于全 面揭示IS发生的表观遗传分子机制，更重要的是可为IS的预防、诊断、个体化 治疗及预后提供非常有价值的线索及可靠的科学依据。材料与方法：1.1缺血性脑卒中患者的筛选根据WHO发布的缺血性脑卒中的诊断标准，并排除其它疾病，自2017 年3月至2017年10月，在河南中医药大学第一附属医院住院的缺血性脑卒中 患者中，按照严格的纳入标准进行选取，其中：第一步初筛人群包括：3例IS患者，分别是2例男性和1例女性，平均年 龄为57岁。第二步验证人群包括：60例IS患者，分别是36例男性和24例女性，平 均年龄为55岁。1.2健康对照组的选取随机收录与IS组同一时间段体检的受试者，其中：第一步初筛人群包括：对照组为3例，分别是2例男性和1例女性，平均 年龄53岁。第二步验证人群包括：对照组为60例，分别是31例男性和29例女性，平均年龄58岁。1.3实验方法1.3.1利用Illumina 850K DNA甲基化芯片对初筛的3例缺血性脑卒中患者和3 例健康对照者的外周血液样本进行全基因组DNA甲基化位点检测。对比两组具 II有显著差异(p GO 分析(Gene Ontology Analysis,GO)进行生物信息学分析，选择与IS相关并有DNA甲基化 表达差异的基因。1.3.2扩大样本量至60例IS样本与60例健康对照，进行MethylTarget(目的区 域甲基化水平测序)以验证。结果：1.850K DNA甲基化芯片检测得到：622个有统计学意义的甲基化差异CpG 位点，共涉及278个基因(Diffscore值小于-13或大于13；且Delta_ Beta 大于0.1 7或小于-0.1 7,即为差异甲基化基因)。2.DNA目的片段甲基化测序对19个候选基因ERCC5,TGFBI,ABCG1,ATP10A,CYP2E1,HOXA4,PCDHB7,ARL4C,KLF1L SULF2,AD ARB 2,GDF15,CDH15,CAMTAI,SMG6,RNF144b)验证后得至IJZBCZ/,ADARB2,ATP10A,CAMTAI,CDH15,COL9A2,TGFB1共计7个基因，在病例和对照组之间的甲基化水平差异具有统计学 意义。(P-value0.05(Ttest)&P-value0.05(Utest)&P-value0.05(Logistic)3.目的片段甲基化测序结果显示：在IS患者组较健康对照组甲基化 程度升高，ffi ABCAh AD ARB 2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFB1 在 IS患者组较健康对照组甲基化程度降低。结论：1.本课题应用全基因组甲基化芯片及目的区域甲基化水平测序，对IS患者与正 常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析，筛选出ABCALADARB2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFBL 共 7 个基因启动子区的 CpG岛甲基化水平可能成为缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物。2.通过生物信息学分析，ADARB2,ABCA1,Z7P/0Z和TGF5/可能分别通过 介导胆固醇转运、磷脂转运以及调节基因表达等功能成为缺血性脑卒中的保 护因素。CDH15,COL9A2,可能通过介导细胞间粘附作用、参与胶原蛋白的合成与分解等功能而成为缺血性脑卒中的危险因素。III关键词：缺血性脑卒中 850KDNA甲基化芯片分子标志物IVDNA Methylation Molecular Markers ScreeningFor Ischemic StrokeBy Beadchip and Sequencing TechnologyPostgraduate:Xuran Zhang Supervisor:Prof.Hong Zheng Department of Medical Genetics and Cell Biology School of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University Zhengzhou,450001AbstractBackground and Purpose:Stroke is an acute cerebrovascular disease,it is a neurological deficit syndrome caused by local blood circulation disorders.It has the characteristics of high mortality,high morbidity and high disability rate.It is the second leading cause of death in the world.It is also the main cause of adult lead to be disability.Stroke generally can bedivided into Ischemic Stroke(IS)and Hemorrhagic Stroke(HS),while IS takes part in 87%of the total.In China,the mortality and morbidity of cerebrovascular disease is significantly higher than that of cardiovascular disease.Therefore,stroke patients need a lot of social attention and medical resources to find biomarkers to prevent and treat ischemic stroke.The Ana M.G 6 mez-rizs team found that methylation levels in the KCNQ1 promoter region could be used as biomarkers in the diagnosis of IS in obese ischemic stroke patients.Zhou Shuyu and his team found that CDKN2B methylation levels in ischemic stroke patients can affect calcification of the aortic arch.Many studies have shown that many diseases and important biological processes are regulated by epigenetics.Therefore,the study of the effect of DNA methylation on disease provides us with a new idea.Methylation modification at specific sites of DNA exists widely in prokaryotes and eukaryotes,which can induce the stability of chromatin conformation and the change of interaction between DNA and protein,thus regulating gene expression,participate in the regulation of metabolic pathway.The methylation of DNA occurs mainly in the CpG island of gene promoter region,and its methylation status can be determined by the method of DNA methylation sequencing.Therefore,our study apply technique of Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850K Chip)and MethyTarget(regional methylation sequencing)for differential DNA methylation analysis of IS patients and normal controls.The aim is to select genes that significantly methylated altered in DNA methylation,and followed by gene functional analysis as to search for molecular markers of DNA methylation related to the occurrence and development of IS genes.Research object:1.1 Selection of IS patientsAccording to the diagnostic criteria of WHO ischemic stroke and excluding other diseases,strict selection was made among the IS patients hospitalized in The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine from March 201 7 to October 201 7.Step l.The primary screening crowd included 2 cases were male(66.7%),1 case was female,the average age was 57 years old.Step 2.A total of 60 people were examined,including 36 males and 24 females,with an average age of 55 years.1.2 Selection of control groupSubjects who were randomly selected for physical examination in the same time period as the IS group:VIStep l.The primary screening crowd included 3 cases in the control group,including 2 males(66.7%)and 1 female(mean age 53 years).Step 2.The examined people included 60 cases in the control group,of which 31 cases were males,29 cases were females with an average age of 58 years.1.3 Methods1.3.1 Illumina 850K DNA methylation microarray was used to detect the genomic DNA methylation sites in peripheral blood samples from 3 patients with ischemic stroke and 3 healthy controls.The methylation sites of the two groups were significantly different(P ATP10A.CYP2E1 HOX4A、PCDHB7.ARL4C、KLF11.SULF2、AD ARB 2、GDF15、CDH15、CAMTAI、SMG6.RNF144b were selected,a total of 7 genes were obtained from ABC Al ADARB2、ATP10A CAMTAI CDH15、COL9A2、TGFBI.The difference of DNA methylation level between cases and controls was statistically significant(P value 0.05 Ttest&P-value 0.05 U test&P-value VIIATP10A、CDHI5、COL9A2、TGFBI in IS group was lower than that in the healthy control group.Conclusion:1.There are seven genes have different levels of DNA methylation in peripheral blood of ischemic stroke patients and healthy people,they are ABC Al,ADARB2,ATP10A,CAMT AL CDH15,COL9A2,TGFBI.The methylation level ofCpG island in the promoter region of these genes may be used as molecular markers of DNA methylation for the prevention and treatment of ischemic stroke.2.The genes(ADARB2,ABCA1,ATP10A,TGFB 1)were able to inhibit ischemic stroke by mediating cholesterol transport,phospholipid transport,and regulating gene expression,respectively.The genes(CDH15,COL9A2,CAMTAI)were able to increase the risk of ischemic stroke by mediating intercellular adhesion and participating in the synthesis and decomposition of collagen by bioinformatics analysis.Key words:Ischemic Stroke 850K BeadChip Molecular MarkersVIII目录甲J舌.1材料和方法.51研究对象.51.1 IS病例组的选取.51.2 正常对照组选取.52实验仪器及试剂.62.1 实验仪器.62.2 实验试剂.73实验方法.83.1 外周血基因组DNA的提取与纯化.83.2 应用Illumina 850K甲基化芯片检测全基因组甲基化水平.93.3 使用MethylTarget目的区域甲基化测序对候选基因进行验证.124生物信息学分析.14结果.161 Illumina 850K甲基化芯片检测结果.161.1 芯片数据处理流程.161.2 芯片数据质控结果.161.3 芯片数据评价.201.4 差异CpG位点筛选.21IX2候选基因目的区域甲基化水平测序结果.322.1 目的区域甲基化水平测序数据.322.2 验证人群IS组和对照组甲基化水平的比较结果.362.3 候选基因与IS的关联性分析结果.39讨论.40结论.48参考文献.49综述.52致谢.71个人简历.72X英文缩略词表英文缩写英文全称中文译名ISIschemic Stroke缺血性脑卒中HSHemorrhagic Stroke出血性脑卒中BMIBody Mass Index体质指数GOGene Ontology基因本体论KEGGKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因与基因组百科全书PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应TOASTTrial of Org 1 01 72 in AcuteStroke Treatment脑卒中分型CISSChinese Ischemic StrokeSubstence中国缺血性脑卒中亚型CpGCytosine-phosphate-GuanineCpG二联核甘酸5-mC5-methyl cy to sine5甲基胞口密咤gDNAgenomic DNA基因组DNAWGBSWhole Genome BisulfiteSequencing全基因组甲基化测序GWASGenome-Wide AssociationStudy全基因组关联研究TIATransient cerebral IschemicAttacks短暂性脑缺血发作HTHemorrhagic Transformation出血性转化RAASRenin-Angiotensin-Aldosterone肾素-血管紧张素-醛固酮System系统XI基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物研究生：张旭冉导师：郑红教授 郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系河南郑州450001前言缺血性脑卒中（Ischemic Stroke,IS）是一种急性的脑血管病，是指由于脑 部血液循环障碍、缺血、缺氧等原因而导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软 化。IS约占全部急性脑血管病的87%，是世界第二大死亡原因，也是成年人 致残的主要原因。在我国，脑血管疾病的死亡率和发病率显著高于心血管疾病。由于缺血性脑卒中具有高致残率，约有20%的脑卒中幸存者需要依赖他人的帮 助来完成日常生活甚至行走。因此，脑卒中患者需要大量的社会关注和医疗资 源投入，寻找防治缺血性脑卒中的生物标志物尤为迫切。脑卒中是由多种因素引起的复杂疾病，虽然IS的发病机制至今尚不完全清 楚，但是目前普遍认为IS与遗传因素、环境因素以及其相互作用有关。Ana M.G6mez-Uriz的研究小组发现，在肥胖的缺血性脑卒中患者中，KCN0/启动子区 甲基化水平可作为诊断IS的生物标志物。周淑宇等人的研究发现，在缺血性 卒中患者中CDKN2B甲基化水平能够影响主动脉弓的钙化程度。CN Hales的 研究小组发现，改变父亲的饮食（高脂肪，或低蛋白饮食），或孕期中母亲的营养 不良，都会增加后代出现代谢疾病的风险。Shaunrick Slolkleng等人发现，血 管内（包括RAAS系统、血管壁和血管内的特定细胞类型）的表观遗传变化通 I过综合机制参与高血压的发展。在后基因组时代，表观遗传学已成为一门新的 分子和医学遗传学分支，其过程涉及染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化、基因表达的重编程以及非编码RNA的调节等多个环节，可发生在各种组织器官 和重要的发育阶段，调控机体许多重要的生物功能如I表观遗传学在细胞发育 和功能中起着关键作用，表观基因组的改变能够介导遗传和环境等危险因素对 复杂疾病的影响。Andrew P.Feinberg的研究指出，DNA甲基化(DNA methylation)是人类疾病研究中非常有用的表观遗传标记，并且可作为档案存于石蜡块标本 中口叫DNA特定位点的甲基化修饰广泛存在于原核生物和真核生物中，能够引起 DNA稳定性、染色质结构、DNA构象及DNA与蛋白质之间相互作用方式的改 变，从而调控基因表达，参与代谢途径调节。CpG二联核昔酸是最为主要的甲 基化位点，它在基因组中的分布不均匀。在一些区域内，CpG通常成簇存在，人们将这段富含CpG二联核甘酸的DNA称为CpG岛(CpG Islands)o CpG岛 常位于转录调控区附近，在基因组中，约有60%以上基因的启动子区含有CpG 岛，CpG岛的甲基化与基因的转录调控有密切的关系。Katherine J Dick等人发 现，欧洲成年人BMI增加与血细胞和脂肪组织中HIF3A启动子区位点的甲基化 水平增高有关口引。目前虽然在IS相关的甲基化异常基因研究方面取得了一些进展，但大部分 只是针对几个或一群基因作为候选基因的研究方法，研究结论也较为局限。迄 今为止，尚无学者对IS的异常甲基化在全基因组层面上进行直接、全面系统地 分析。同时，在以往的研究中，研究者从已知的或相关文献中筛选出基因进行 甲基化检测，并不确定能得到甲基化差异的结果。因此，我们对研究策略进行 了优化。首先，选择诊断明确、病例资料完整的缺血性脑卒中患者全血样本3 例(2男1女)以及健康对照者全血样本3例(2男1女)进行全基因组DNA 甲基化测序，筛选出两组间具有统计学意义的差异基因及位点。第二阶段采用 目的区域甲基化测序对筛选出的候选基因进行大样本量验证。最终，利用生物 信息学的方法进行数据分析和挖掘，以期寻找与IS发生、发展相关的基因及DNA 甲基化分子标志物，初步建立IS的甲基化谱。目前，甲基化检测的技术手段成熟多样，选择合适的方法能为研究者提供 良好的实验数据口支Illumina Infinium Methylation BeadChip是目前应用比较广泛 2的新一代的甲基化检测芯片，其中包含了原450K芯片90%以上的位点，并增加 7 413745个位点。850K芯片不但保持了对CpG岛和基因启动子区的全面覆盖，还特别增加了增强子区(新增探针覆盖ENCODE及FANTOM5数据库中的增强 子)以及基因编码区的探针覆盖。此芯片获得的数据优势明显，具有质量高、重复性好、准确性好和灵敏度高等特点，并且该芯片技术操作流程简单，检测 位点数多，通量高。然而到目前为止，应用850K芯片对缺血性脑卒中DNA甲 基化水平的研究尚未见报道。随着基因测序技术尤其是甲基化芯片技术的发展和成本的降低，使得我们 的大规模测序和检测成为可能，然而，所产生的大量数据也为我们带来了挑战。在如今的科学研究领域，基因组序列数据在生物科学大数据中所占的比例越来 越大，选择合适的生物信息学分析技术就显得十分重要。GO分析(Gene Ontology)是全面分析基因本体功能的有效方法，对于DNA 甲基化来说，GO分析能够对有甲基化差异的CpG位点所关联的基因从生物过 程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和细胞组成(Cellular Component)三方面对该基因本身所涉及的功能进行全面系统的注释。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一个将基因组信息与基 因高级功能信息联系起来的系统分析基因功能的数据库。该数据库收集了所有 完全测序的基因组和部分基因组的基因目录，并对基因功能进行了最新的注释。KEGG包含三个子数据库，高级功能信息存储在通路数据库(Pathway)中，其 中包含了细胞代谢、膜转运、信号转导和细胞周期等过程的详细图表。因此，我们能够利用KEGG通路数据库，对具有组间甲基化差异的位点所对应的基因 进行通路分析，同时通过统计学方法计算出每个通路条目中所含基因富集的显 著性，探索具有组间甲基化差异的基因可能与哪条细胞通路的改变有关。综上所述，本研究在第一阶段初筛中应用Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip甲基化检测芯片，对缺血性脑卒中患者的全基因组甲基化水平进行检 测，筛选出候选基因，基于初筛的实验结果，对众多候选基因的甲基化水平进 行大样本量研究则更有针对性和可行性。使用亚硫酸盐将DNA进行修饰后，结 合目的区域富集和二代测序技术，对候选基因目的区域甲基化水平测序(MethylTarget)可同时对成百上千个区域进行甲基化程度分析，可以获得目标 区域内所有C碱基的甲基化数据,适用于大样本多区域的DNA甲基化水平检测o 3因此，在第二阶段我们采用MethylTarget甲基化测序对筛选出的候选基因进行大 样本量验证。最终，利用生物信息学的方法进行数据分析和挖掘，以期寻找与 IS发生、发展相关的基因及DNA甲基化等分子标志物（图1）,初步建立IS的甲 基化谱。IS甲基化谱的建立不仅有助于全面揭示IS发生的表观遗传分子机制，更重要的是可为IS的预防、诊断、个体化治疗及预后提供非常有价值的线索及 可靠的科学依据口文图1课题研究流程图4材料和方法1研究对象1.1 IS病例组的选取1.1.1 入选标准根据WHO提供的缺血性脑卒中的诊断标准，自2017年3月至2017年10 月，在河南中医药大学第一附属医院住院的缺血性脑卒中患者中进行选取。其中：第一步初筛人群包括：有代表性的IS患者3例，其中男性2例，比例为 66.7%,女性1例，平均年龄为57岁。第二步验证人群包括：IS患者为60例，其中男性36例，比例为60%,女 性44例，平均年龄为58.312.1岁。1.1.2 排除标准所选病例组均无手术史和输血史，排除心脏病、糖尿病、传染性疾病、肿 瘤、全身免疫性疾病、血液系统疾病及其他非IS疾病；此外，IS病例组患者 均为首次发病并在入院第一时间采集血液样本，样本采集后逐步置于-20保存 并于当天提取全血DNA。1.2 正常对照组选取收集IS病例组的同时，随机收集同一时间段体检的受试者，并且要求受试 者与IS组的性别和年龄相匹配、且无心脑血管等疾病的个体作为对照组。其中：第一步初筛人群包括：对照组3例，其中男性2例，比例为66.7%,女性 1例，平均年龄53岁。第二步验证人群包括：对照组60例，其中男性31例，比例为52%,女性29例，平均年龄51.314.8岁。5所有受试者均为河南汉族人，无血缘关系。本研究获得郑州大学及河南中 医药大学第一附属医院伦理委员会的批准，所有参与的个体均签署知情同意书2实验仪器及试剂2.1实验仪器实验仪器生产厂家微型离心机 超净工作台 台式低速离心机TD5A-WS 台式微量高速离心机 烘箱台式微量高速离心机H1 650-W 涡漩震荡仪器4c低温离心机 电子天平 药物天平立式压力蒸汽灭菌器 NanoDrop2000超微量核酸蛋白 测定仪涡漩震荡仪器 电热恒温鼓风干燥箱DNA浓度检测仪NanodropOneC 板式常温离心机Megafugel.O 冰箱 BCD-239VC 振荡器Vortex-2 恒温水浴锅 漩涡混匀器QT-1 微量加样器ORAGONLAB长沙湘仪离心机仪器有限公司 长沙湘仪离心机仪器珠海有限公司ORAGONLABThermo德国湘仪离心机仪器长沙有限公司ORAGONLAB德国Eppendorf公司余姚纪铭称重校验设备有限公司 上海申安医疗器械有限公司 上海复日科技有限公司美国Thermo公司上海精宏实验设备有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 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的充分振荡混匀。（3）使用水浴锅，进行10分钟以上的65c水浴孵育，孵育其间需要震荡 混匀3-4次从而帮助血液的细胞膜充分裂解（注意高温加热可能会导致的15毫 升离心管密封不严，导致血液震荡溢出）。（4）水浴裂解之后，需冷却至室温，添加2毫升以上的无水乙醇，然后 使用震荡仪进行完全混匀，此时可能出现絮状沉淀物，无需处理，不会影响实 验结果（无水乙醇所致的核酸脱水聚集）。（5）第4步得到的溶液带有絮状沉淀，取出新的带有吸附柱的15毫升收 集管，将一半溶液移入其中并3500rpm离心4min,然后取出吸附柱（取出时 8需要注意不要污染内壁），倒掉上面的废液后再将吸附柱放回到收集管中。将 另剩余溶液移入到上一步的吸附柱中，然后重复操作一遍。（6）将适量的无水乙醇与GD缓冲液混合，将2.5毫升混合后的GD缓冲 液加入到吸附柱CB5中并进行离心5000rpm/3min,将废液弃掉。将吸附柱CB5 放回到收集管中，将适量无水乙醇与PW缓冲液混合，将3毫升混合之后的PW 缓冲液加入到吸附柱CB5中并进行离心5000rpnV2min,将废液弃掉。（7）将上一步所得的吸附柱放回到收集管中，将无水乙醇与PW缓冲液 混合并加入3毫升到吸附柱中，然后进行离心5000rpm/1 5min,完成后弃掉15 毫升收集管。室温下放置吸附柱CB5大于5分钟以保证吸附柱CB5中残余的 无水乙醇彻底晾干。（8）取出新的15毫升离心管并将吸附柱CB5放入其中，滴加200-300回 的TB洗脱液到吸附柱的内硅胶膜中，室温下放置大于5分钟，放置后进行离 心5000rpm/3min（将离心后的洗脱液再次加入到吸附柱中，室温下放置5分钟 后，然后再进行离心，可提高浓度），及时分装收集到的DNA然后放至4c冷 藏2小时，冷藏后移入至-20C保存，以备使用。（9）DNA的浓度和纯度测量在所有步骤完成后，用Nanodrop超微量DNA 浓度纯度测定仪进行测量。3.2应用Illumina 850K甲基化芯片检）则全基因组甲基化水平3.2.1芯片检测流程（图2）数据分析图2 Illumina850K芯片检测流程图3.2.2操作步骤3.2.2.1预处理：首先利用亚硫氢酸盐处理DNA,制备BCD和MSA4：碱变性-基因组全扩增，依次进行：断裂-沉淀-重悬-杂交，洗涤-延伸-染色-扫描。3.2.2.2芯片操作：(1)准备Wash Dish并将Wash Rack放入其中(注意需完全浸没于PB1)。(2)将携带芯片的Hyb Chamber inserts从杂交盒中取出并从芯片中取出 inserts,将IntelliHyb Seal撕掉并立即把芯片放入Wash Rack中。(3)对含有芯片的Wash Rack进行1分钟的提拉，注意操作过程中保持缓 慢轻柔，同时注意每次操作都需要将其离开液面。(4)准备另一个Wash