DB22∕T 3495-2023 露地辣椒疫病诊断与防治技术规程(吉林省).pdf

ICS 65.020 CCS B 05 22 吉林省地方标准 DB22/T 34952023 露地辣椒疫病诊断与防治技术规程 Technical code of practice for integrated managenment of pepper phytophthora blight in open field 2023-09-28 发布 2023-11-16 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 34952023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林农业大学提出。本文件由吉林省农业农村厅归口。本文件起草单位：吉林农业大学。本文件的主要起草人：王晓梅、陶淑霞、刘世杰、齐红岩、叶雪凌、李宏侠、尹广喜、王瑶、张丹、孙西琳、王国宇。DB22/T 34952023 1 露地辣椒疫病诊断与防治技术规程 1 范围 本文件确立了露地辣椒疫病诊断与防治的程序，规定了病害诊断、综合防治等阶段的操作指示，描述了记录与档案的追溯方法。本文件适用于辣椒疫病诊断及露地辣椒疫病的综合防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则 NY/T 1276 农药安全使用规范 总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。辣椒疫病 pepper phytophthora blight 由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）侵染辣椒引起的一种卵菌病害。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 用于体外扩增特定 DNA 序列的技术。交替用药 alternative application 选择作用机制不同的、无正交互抗性的药剂交替使用。混合用药 mixed application 选择作用方式和机制不同、有减量增效作用的两种药剂混合使用。4 辣椒疫病诊断与防治技术程序的构成 辣椒疫病诊断与防治程序主要包括以下几个阶段，流程见图 1。DB22/T 34952023 2 图1 辣椒疫病诊断与防治程序流程 5 病害诊断 症状诊断 5.1.1 病害样本采集 在田间采集有代表性的发病植株，用于症状识别与病原菌鉴定。5.1.2 苗期症状 主要在根和茎基部发病，呈暗绿色水渍状病斑，病部变软、变褐、缢缩，病株猝倒和湿腐，有时也呈立枯状死亡。5.1.3 成株期症状 成株期的根、茎、叶和果实都能发病。具体表现如下：a)根部染病，发病初期呈淡褐色湿腐状病斑，逐渐变为黑褐色，导致根部及根颈部韧皮部腐烂，木质部变淡褐色，引起整株萎蔫死亡，典型症状参见图 A.1；b)茎枝染病，发病初期病斑为水浸状，环绕茎枝表面扩展，导致茎枝黑杆，病部以上枝叶迅速凋萎，典型症状参见图 A.2；c)叶部染病，产生边缘不明显的黄绿色病斑，病斑呈圆形或近圆形，病叶很快湿腐脱落，参见图 A.3；d)果实染病，发病部位始于蒂部，发病初期产生暗绿色水浸状病斑，后期逐渐扩大可遍及整个果实，病果迅速变褐软腐，湿度大时，表面长出灰白色霉层，干燥后形成暗褐绿色僵果，残留在枝上，典型症状参见图 A.4。DB22/T 34952023 3 病原菌诊断 5.2.1 显微观察 5.2.1.1 徒手制片 5.2.1.1.1 取洁净的载玻片，在中间滴一滴清水，用洁净的解剖针等直接挑取病部或培养基上的霉状物，置清水中，使病原物分散；5.2.1.1.2 加盖盖玻片，使盖玻片一侧边缘与水滴边缘接触，并慢慢放下盖玻片，避免产生气泡，待显微观察。5.2.1.2 镜检 在普通光学显微镜物镜 1010 倍的视野下进行形态观察：a)菌丝无色，无隔膜，形态图参见图 B.1；b)游动孢囊梗 3 根5 根成束由叶背气孔伸出，具 3 个4 个分枝，其顶端膨大形成游动孢子囊，游动孢囊梗膨大呈节状，顶端尖细,形态图参见图 B.2；c)游动孢子囊单胞无色，卵圆形，顶端有乳头状突起，大小为（2340）m（1822）m,形态图参见图 B.3。5.2.2 分子检测 5.2.2.1 病原菌分离 5.2.2.1.1 采集具有典型疫病症状的发病组织，在病健交界处剪成 5 mm210 mm2 小块，在超净工作台上浸于 75%酒精中表面消毒 30 s，再用 3%次氯酸钠消毒 2 min3 min，用无菌水漂洗 3 次；5.2.2.1.2 取 4 小块病叶置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，在 25 光暗交替培养 2 d4 d，切取单根菌丝顶端移至新的 PDA 培养基上纯化培养。菌落图参见图 B.4。5.2.2.2 DNA 提取 按 C.1 方法提取辣椒疫霉菌基因组 DNA。5.2.2.3 ITS 区域 PCR 扩增 以基因组 DNA 为模板，采用通用引物 ITS 4/ITS 5（ITS 4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3/ITS 5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）对病原物 ITS 区域扩增，PCR 反应体系按 C.2 的要求执行。PCR 扩增产物检测结果表明 ITS 序列长度约为 800 bp，检测结果参见图 C.1。5.2.2.4 BLAST 比对 PCR 产物进行测序，测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 比对分析，确定辣椒疫病分离菌株(编号为 LJ10)为辣椒疫霉菌（P.capsici Leonian），其 ITS 序列长度为 821 bp，详细序列参见 C.4。采用 mega 7 邻接法方法，基于 ITS 序列建立了辣椒疫霉菌(编号为 LJ10)的系统发育树，参见图 C.2。6 综合防治 防治原则 DB22/T 34952023 4 病害防治应采取“预防为主，综合防治”的原则。在优先选用抗病品种的基础上，加强栽培管理，突出绿色防控，科学使用化学农药。防治方法 6.2.1 选择抗病品种 根据栽培习性及气候条件，选择抗病品种，优先选择兼抗两种以上辣椒病害的品种。6.2.2 农业防治 6.2.2.1 合理轮作 与玉米、大豆及十字花科蔬菜、葱蒜类蔬菜等非茄科作物进行 3 年以上轮作。6.2.2.2 清洁田园 定植前彻底清理前茬作物的残株、烂叶及杂草等。6.2.2.3 水肥管理 移栽前畦面覆盖地膜，采用膜下滴灌控制水分，保持土壤湿润，增温保墒。结合整地，施入适量腐熟好的有机肥作基肥；或每 667 m2 施用商用有机肥 200 kg、过磷酸钙 30 kg、硫酸钾型复合肥 30 kg，N:P:K=1:0.5:1.2，适量增施中量元素及微量元素。蹲苗结束后，浇一次透水，视辣椒生长情况，随膜下滴灌追施全营养水溶肥，或高钙高钾水溶肥，并交替使用。6.2.2.4 植株调整 及时摘除门椒及门椒以下的侧枝，并疏花疏果和整枝打杈。及时拔除田间病株。6.2.3 化学防治 6.2.3.1 农药的选择和使用 采用交替用药和混合用药的方式。农药使用应符合 GB/T 8321（所有部分）和 NY/T 1276 的规定。药剂管理按附录 D 的要求执行。6.2.3.2 种子消毒 播种前，首先是用 55 60 温水浸种 20 min，再用清水浸种 10 h12 h，28 条件下催芽，每隔 10 h 用清水洗 1 次，发芽后适时播种。6.2.3.3 喷雾法 发病前或发病初期，采用喷雾法均匀施药。每 7 d10 d 喷洒 1 次，交替用药，连续喷施 2 次3 次。主要农药种类、作用方式、使用时期及施药量参见表 D.1。7 记录与档案 应及时详细做好诊断与防治各环节的记录，并建立档案，保存完好，档案保存期限不低于 2 年，做到可追溯。DB22/T 34952023 5 A 附录A （资料性）辣椒疫病症状图片 A.1 辣椒疫病不同发病部位典型症状 辣椒疫病典型症状图片见图 A.1A.4。图 A.1 根部症状 图 A.2 茎枝部症状 图 A.3 叶部症状 DB22/T 34952023 6 图 A.4 果实症状 DB22/T 34952023 7 B 附录B （资料性）病原菌显微形态及纯化菌落形态 B.1 病原菌显微形态 病原菌形态见图 B.1B.3。图 B.1 病原菌菌丝的形态(显微镜 1010 倍数)图 B.2 病原菌游动孢子囊梗(显微镜 1010 倍数)图 B.3 病原菌游动孢子囊(显微镜 1010 倍数)DB22/T 34952023 8 B.2 病原菌纯化的菌落形态 病原菌在 PDA 培养基上生长的菌落见图 B.4。图 B.4 病原菌在 PDA 培养基上的菌落形态 C DB22/T 34952023 9 D 附录C （规范性）CTAB 法提取病原菌基因组 DNA C.1 CTAB 法提取基因组 DNA 具体操作步骤 C.1.1 将灭菌的研砵，研杵及药匙备用，配置好的CTAB提取液置于 65 水浴中预热。C.1.2 先加入少量灭菌的石英砂于适量扩繁的病菌菌丝体中迅速研磨后分装于离心管中，再加入事先预热的 CTAB 700 L，反复颠倒震荡，使其充分混溶，65 水浴 1 h，期间每隔 15 min 拿出颠倒摇匀一次，并开盖放气，防止因为气体受热膨胀而使盖子崩开。C.1.3 取出冷却后，加入等体积的苯酚氯仿，轻轻翻转，混匀后，常温离心 10 min（12000 rpm）。C.1.4 移取上清液至新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，轻轻转动离心管，使 DNA 沉淀，待白色絮状沉淀出现后，放置于-20 冰箱 30 min 以上，常温离心 10 min（8000 rpm）。C.1.5 弃上清液，吸取适量 75%的酒精于离心管中，轻轻摇匀，离心 5 min（8000 rpm），漂洗 2 次，晾干后，加适量TE缓冲液，4 溶解。C.1.6 用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。C.2 PCR 反应体系和参数 C.2.1 反应体系 ITS4 和 TIS5 引物各加 1 L，PCR mix 12.5 L，DNA 模 板 1 L，dd H2O 9.5 L，无菌水补足至 25 L。C.2.2 反应参数 C.2.2.1 94 预变性 3 min，94 变性 30 s，57 退火 30 s，72 延伸 1 min 共 35 个循环，72 延伸 10 min ；将反应混合物冷却至 4 ，加入 10 mmol/L 的 EDTA。C.2.2.2 PCR 产物检测使用 1.5 的琼脂糖凝胶，用 0.5TBE 电泳缓冲液，100 V 电泳 3040 min；C.2.2.3 在凝胶成像系统进行电泳结果观察，判断是否为预扩增长度的条带，无非特异性条带，且浓度大于 50 ng/L。C.2.2.4 交由生物公司纯化并测序。C.3 PCR 产物检测 电泳检测病原菌 ITS 序列（样品）片段大小约为 800 bp。DB22/T 34952023 10 M M 样品样品 图 C.1 ITS 经 PCR 扩增后产物电泳检测结果 C.4 辣椒疫霉菌（P.capsici Leonian）的 ITS 全序列 PCR 产物测序，确定了辣椒疫霉菌 ITS 序列片段大小为 821 bp。1 CGGTTTCCGT AGGTGAACCT GCGGAAGGAT CATTACCACA CCTAAAAAAC TTTCCACGTG 61 AACCGTATCA ACCCTTTTAG TTGGGGGTCT TGTACCCTAT CATGGCGAAT GTTTGGACTT 121 CGGTCCGGGC GAGTAGCTTT TTGTTTTAAA CCCATTTCAC AATTCTGATT ATACTGTGGG 181 GACGAAAGTC TCTGCTTTTA ACTAGATAGC AACTTTCAGC AGTGGATGTC TAGGCTCGCA 241 CATCGATGAA GAACGCTGCG AACTGCGATA CGTAATGCGA ATTGCAGGAT TCAGTGAGTC 301 ATCGAAATTT TGAACGCATA TTGCACTTCC GGGTTAGTCC TGGGAGTATG CCTGTATCAG 361 TGTCCGTACA TCAAACTTGG CTTTCTTCCT TCCGTGTAGT CGGTGGAGGA TGTGCCAGAT 421 GTGAAGTGTC TTGCGTGTTG TCCTTCGGGT CGACTGCGAG TCCTTTTAAA TGTACTGAAC 481 TGTACTTCTC TTTGCTCGAA AAGCGTGGTG TTGCTGGTTG TGGAGGCTGC CTGCGTGGCC 541 AGTCGGCGAC CGGTTTGTCT GCTGCGGCGT TTAAAGGAGG AGTGTTCGAT TCGCGGTATG 601 GTTGGCTTCG GCTGAACAGG CGCTTATTGA ATGCTTTTCC TGCTGTGGCG TGATGGGCTG 661 GTGAACCGTA GCTGTGTTTG GCTTGGCTTT TGAATCGGCT TTGCTGTTGC GAAGTAGAGT 721 GGCGGCTTCG GCTGTCGAGG GTCGATCCAT TTTGGGAATT TTGTGTGCAC TTCGGTGCGC 781 ATCTCAATTG GACCTGATAT CAGGCAAGAT TACCCGCTAT A C.5 辣椒疫霉菌（P.capsici Leonian）发育系统树 基于 ITS 序列，采用 mega 7 邻接法方法建立了辣椒疫霉菌（编号为 LJ10）的系统发育树，见图 C.2。DB22/T 34952023 11 图 C.2 基于 ITS 序列利用 Mega 7.0 构建的系统发育树 DB22/T 34952023 12 E 附录D （规范性）田间防治辣椒疫病的制剂 D.1 15 种适用于田间防治辣椒疫病的制剂 具体药剂及使用方法等参见表 D.1。表 D.1 15 种田间防治辣椒疫病的症状 序号序号 制剂及剂型制剂及剂型 制剂作用方式制剂作用方式 制剂使用时期制剂使用时期 制剂用药量制剂用药量 g g（mLmL）/667m/667m2 2 1 50%烯酰吗啉 可湿性粉剂 治疗性杀菌剂 发病初期 35 g40 g 2 35%烯酰氟啶胺 悬浮剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 60 mL70 mL 3 34%氟啶嘧菌酯 悬浮剂 保护性杀菌剂 发病前或发病初期 25 mL35 mL 4 440 g/L 精甲百菌清 悬浮剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 75 mL165 mL 5 50%嘧菌酯 水分散粒剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 20 g36 g 6 80%烯酰吗啉 水分散粒剂 治疗性杀菌剂 发病初期 20 g25 g 7 70%丙森锌 可湿性粉剂 保护性杀菌剂 发病前或发病初期 150 g200 g 8 72%霜脲锰锌 可湿性粉剂 保护性杀菌剂 发病前或发病初期 140 g167 g 9 500 g/L 氟啶胺 悬浮剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 25 mL33 mL 10 75%甲硫锰锌 可湿性粉剂 兼具保护和治疗作用 发病初期 80 g120 g 11 20%丁吡吗啉 悬浮剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 125 g150 g 12 47%烯酰唑嘧菌 悬浮剂 保护性杀菌剂 发病前 60 mL80 mL 13 70%代森锰锌 可湿性粉剂 保护性杀菌剂 发病前或发病初期 171 g240 g 14 23.4%双炔酰菌胺 悬浮剂 兼具保护和治疗作用 发病前或发病初期 20 mL40 mL 15 50%锰锌氟吗啉 可湿性粉剂 兼具保护和治疗作用 发病初期 60 g100 g DB22/T 34952023 13 F 附录E （规范性）农药管理 E.1 采购 不得采购国家禁止使用的农药，应从正规渠道采购符合下列要求的农药，并索取发票或购药凭证：a)有资质农药经营单位经营的；b)有农药登记证的；c)有农药生产许可证的；d)有产品质量标准及合格证明的；e)标签内容完整的；f)质量保质期内的；g)国家和进口国允许使用的农药。E.2 贮存 应贮藏于专用场所，由专人负责保管。场所应符合卫生、防火、防水、防雨、防腐、避光、阴凉、干燥、通风等安全条件要求，并配有农药配制量具、急救药箱，出入口处贴有警示标志。不得与食品、农产品、饮料和饲料等混放。E.3 包装物处理 农药包装物应清洗 3 次以上，及时收集并交回农药经营者或农药包装废弃物回收站（点），不能随意丢弃，也不可做他用。