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第 45 卷 第 1 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.45,No.1 2 0 2 4 年2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Feb.,2024 *国家自然科学基金(31972782;32273102)、国家重点研发计划(2018YFD0900103;2018YFD0900404)、中国科学院先导专项(XDA24030105)和财政部和农业农村部:现代农业产业技术体系(CARS-48)共同资助。苏曼文，E-mail: 通信作者：张晓军，研究员，E-mail: 收稿日期:2022-09-01,收修改稿日期:2022-09-28 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220901003 http:/ SU M W,ZHANG X J,YUAN J B,ZHANG X X,YANG M,LI F H.Gene structure and expression analysis of insulin-like peptide in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.Progress in Fishery Sciences,2024,45(1):105117 凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析*苏曼文1,2,3 张晓军1,2,3 袁剑波1,2 张小溪1,2 杨 铭4 李富花1,2,3(1.中国科学院海洋研究所 中国科学院实验海洋生物学重点实验室 山东 青岛 266071；2.海洋生物学与生物技术功能实验室 山东 青岛 266237；3.中国科学院大学 北京 100049；4.福州市海洋与渔业技术中心 福建 福州 350005)摘要 类胰岛素肽(ILP)是胰岛素超家族的成员，具有进化保守性，是影响动物生命活动的重要因子之一。本研究克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ILP1(LvILP1)全长基因，mRNA 长度为812 bp，其中开放阅读框长 543 bp，编码 180 个氨基酸。序列分析显示，LvILP1 蛋白预计分子量为20.81 kDa，理论等电点为 9.45，不稳定系数为 96.20，具有一个信号肽，没有跨膜结构，推导其为碱性、不稳定的分泌蛋白。结构预测显示，该蛋白具有胰岛素超家族保守的 IlGF 结构域，由 N 端信号肽、B 链、C 肽和 A 链组成，同时具有 6 个保守的半胱氨酸位点和 2 个断裂位点。系统进化分析显示，LvILP1 与斑节对虾(Penaeus monodon)ILP7 亲缘关系最近，与甲壳动物 ILP1 聚为一支，然后分别与无脊椎动物 ILP7、脊椎动物松弛素(Relaxin)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因子(IGF)聚在一起。无脊椎动物 ILP7 类与外群海葵(Actinia tenebrosa)ILP 的进化关系最近，表明这类 ILP可能与胰岛素超家族的祖先较为相似。转录因子预测显示，LvILP1 可能的转录因子为叉头框蛋白O3(FoxO3)、糖皮质激素受体(GR)、CAAT 区/增强子结合蛋白(C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(STAT)等；蛋白互作分析显示，LvILP1 与细胞膜上的胰岛素受体(IR)、神经信号分子(VGLUT1、SYT 1_3)、糖蛋白激素(GPHB5)、鞣化激素(Bursicon)等相互作用；对这些转录因子和互作蛋白的生物功能进行分析，进而推测 LvILP1 可能具有调节生长发育、激素刺激反应、神经系统稳态、碳水化合物稳态、蜕皮后组织重建以及生殖发育等作用。分析发现，LvILP1 在凡纳滨对虾早期发育阶段有较高表达，在成体各个组织中均有表达，但在眼柄中表达量最高。本研究结果为深入了解凡纳滨对虾 ILP 的基因结构、进化、功能及表达提供了重要信息，同时为凡纳滨对虾的分子育种和健康养殖提供线索。关键词 凡纳滨对虾；类胰岛素肽；基因结构；功能预测；表达分析 中图分类号 Q173 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2024)01-0105-13 在脊椎动物中，胰岛素超家族由胰岛素(insulin)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、松弛素(relaxin)等成员组成，它们在结构上高度保守，均具有 N 端信号肽、B 链、C 肽和 A 链；在功能上，106 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 这些分子通过与细胞膜上的受体结合激活胰岛素信号通路，从而调节生物新陈代谢、生长发育、繁殖与寿命等关键生理过程(Hoffmann et al,2011)。目前，在无脊椎动物中未发现胰岛素或 IGF，但在果蝇(Drosophila melanogaster)(Riehle et al,2006)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(Liu et al,2016)、东澳岩龙虾(Sagmariasus verreauxi)(Chandler et al,2017)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(Zheng et al,2018)、紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)(Perillo et al,2014)、澳大利亚斑点海葵(Oulactis sp.)(Mitchell et al,2021)等物种中发现了多种胰岛素的类似物类胰岛素肽(insulin-like peptides,ILPs)，这些 ILP 都具有胰岛素超家族保守的结构特征与功能，表明 ILP 是一个古老的胰岛素超家族成员。昆虫 ILP 主要由大脑的神经分泌细胞产生，功能上比脊椎动物胰岛素更加广泛和复杂，在调控代谢、生长、变态、繁殖、免疫、蜕皮和昼夜节律等方面发挥重要作用(Wu et al,2006)。例如，在长红锥蝽(Rhodnius prolixus)和柞蚕(Antheraea pernyi)中，ILP基因的表达能够调节碳水化合物代谢和海藻糖代谢(Li et al,2021;Haddad et al,2022)；在果蝇中过表达DILP1 可以促进蛹期器官组织的生长(Liao et al,2020)；在马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)中干扰 LdILP 表达会导致成蛹时间延长(Fu et al,2016)；在 柑 桔 木 虱(Diaphorina citri)中 干 扰 DcILP1 和DcILP2 表达会导致产卵数量显著减少，且卵巢空泡化使其发育受到极大的抑制(Wang et al,2022)；在蓖麻蚕(Samia cynthia ricini)中 ScILP 能够刺激促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)的活性，从而进一步调控蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的合成与释放(Nagata et al,1999)；而在果蝇中敲除 DILP5会严重影响昼夜节律的周期(Yamaguchi et al,2022)。甲壳动物中 ILP 基因的相关研究较少。已有的研究结果显示，ILP 主要在脑、眼柄、性腺和触角腺等组织中表达(Chandler et al,2017;Jiang et al,2020)。在功能方面，ILP 参与调控代谢、生长、免疫和生物与环境相互作用等生命活动。例如，在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和 中 华 绒 螯 蟹(Eriocheir sinensisis)中过表达 LvILP1 能够降低血淋巴中葡萄糖的含量(Su et al,2022;Wang et al,2020)；罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中干扰 ILP 表达能够降低肝胰腺中海藻糖和糖原水平(Jiang et al,2020)；在日本沼虾(Macrobrachium nipponense)中干扰 ILP 表达显著减缓了其生长速度(Li et al,2019)；中华绒螯蟹中 EsILP 在眼柄和血细胞中高表达以参与机体对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的免疫反应(Wang et al,2020)；而 在 飞 马 哲 水 蚤(Calanus finmarchicus)中鉴定出 4 种 CfILP 前体，研究发现，其可能参与控制生物体与环境的相互作用，例如季节性亚成体滞育的调节(Christie et al,2016)。凡纳滨对虾因具有生长快、出肉率高、抗病性强、耐粗饲料等诸多优点，已成为我国和世界上最具经济价值的水产养殖虾类。作为重要的水产经济物种，其生长性状的遗传学基础一直倍受关注(方振朋等,2020;刘峻宇等,2021)。在最近的研究中，本课题组鉴定了凡纳滨对虾胰岛素信号通路中的一些重要基因，如胰岛素受体(insulin receptors,InRs)、胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs)，以及通路下游的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)、叉头框蛋白 O(forkhead box O,FoxO)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK3)等基因，初步的功能研究显示，干扰这些基因的表达会影响对虾的生长速度(Pang et al,2021a、b)，由此确认对虾中存在胰岛素信号通路，该通路可以调控虾类的生长。而作为激活该信号通路的开关分子 ILP，其基因结构、系统进化以及分子功能尚不清楚。本研究从凡纳滨对虾转录组数据中鉴定出一条 ILP 基因，通过生物信息学分析方法预测其结构、系统进化、转录因子、互作蛋白等，并通过实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测该基因在各组织中的相对表达量，这些研究结果可为后续对虾ILP 的结构与功能研究及筛选胰岛素信号通路基因作为分子遗传育种的靶点提供基础。1 材料与方法 1.1 实验材料 本实验所用的凡纳滨对虾来自山东日照养殖基地，在中国科学院海洋研究所(山东青岛)的水族楼中养殖至少 1 周以稳定其生存状态。养殖海水清洁无菌，氧气充足，温度为(25.00.2)，盐度为 30，pH值为 7.50.1。每日 09:00、15:00 和 21:00 分别使用颗粒饲料(烟台大乐饲料公司)喂食一次，每日更换一次养殖海水。1.2 组织采集 选取 9 尾健康雌性对虾，体长为(6.70.8)cm，体重为(4.50.7)g。取样组织为眼柄、卵巢、表皮、肌肉、胃、脑、肠、鳃、肝胰腺、腹神经、血细胞、胸神经节、淋巴器官和心脏，共计 14 种组织。将每第 1 期 苏曼文等:凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析 107 3 尾虾的相同组织混为 1 个样品(确保样品量足够后续分析)，共取 3 个生物学重复。取样完成后，将样品迅速放入液氮中冷冻，最后将所有样品放置80 超低温冰箱储存。1.3 实验方法 1.3.1 LvILP1 基因序列鉴定 从本实验室前期获得的凡纳滨对虾基因组和转录组数据中筛选并提取所有注释为 ILP 基因的序列。所获得的序列作为query，在 NCBI Blast 网站(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对，筛选出与其他物种 ILP 基因相似度较高的序列。将这些序列提交至 ExPASy translatetool 网站(http:/web.expasy.org/translate/)，得到翻译后的氨基酸序列。所有的氨基酸序列提交至SMART 网站(http:/smart.embl-heidelberg.de/)，预测其是否具有典型的功能结构域。最后，对这些序列的结构域进行筛选，最终鉴定出一条 ILP 基因序列，并命名为 LvILP1。将 LvILP1 基因的 cDNA 序列在对虾基因组网站(http:/ BLASTN 比对，获得该基因在基因组上的位置信息。根据比对结果，当某段序列和基因组的比对率在 97%以上时被认定为精确匹配，从而得到基因的结构信息。1.3.2 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 将收集的样品进行预处理，体积较大的组织(如肌肉、肝胰腺)，采用液氮研磨法处理，其他体积较小的组织低温匀浆处理。将处理好的对虾组织样品使用RNAiso Plus 试剂(TaKaRa,日本)提取总 RNA，通过Nanodrop 2000 分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国)和 1.5%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分别检测 RNA 的浓度和质量，最后使用反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,日本)将 RNA 反转录为 cDNA。1.3.3 LvILP1 基因克隆 将 LvILP1 基因序列提交至 Primer 3 Plux 网站(https:/ 1)。以脑组织的 cDNA 作为模板，使用 PCR 仪进行扩增。PCR 程序：95 预变性 2 min；95 变性 20 s，60 退火 40 s，72 延伸 20 s，40 个循环；72 延长 10 min。获得的 PCR产物经 1.5%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，验证条带大小一致后，使用 MiniBEST DNA fragment purification试剂盒(TaKaRa,日本)进行纯化。纯化后的 DNA 连接到 pMD19-T vector(TaKaRa,日本)中，连接体系：pMD19-T vector 0.5 L,Solution 5.0 L 及 DNA纯化产物 4.5 L，置于 16 水浴锅中连接 12 h。之后转入 E.coli Trans DH5 感受态细胞(TaKaRa,日本)中过夜培养，筛选阳性单克隆并进行菌落 PCR 鉴定，将含有目的基因的菌液进行测序(上海生工)。1.3.4 LvILP1 基因序列分析 通过在线网站工具推断 LvILP1 基因的核苷酸序列与氨基酸序列所包含的 生 物 学 信 息，采 用 ExPASy 中 的 ProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的相对分子质量、等电点、不稳定系数和平均疏水率(Wilkins et al,1999)；SignalIP-5.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测信号肽；TMHMM Server 2.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)预测蛋白质有无跨膜结构域；PSORT Prediction(https:/psort.hgc.jp/form2.html)预测蛋白质亚细胞定位；SMART 预测蛋白质结构域；SOPMA(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预 测 蛋 白 质 二 级 结 构；QUARK(https:/zhanggroup.org/QUARK/)预测蛋白质三级结构，预测结果用 SAVES v6.0(https:/saves.mbi.ucla.edu/)进行质量评估；Neuropred(http:/stagbeetle.animal.uiuc.edu/cgi-bin/neuropred.py)预测形成成熟多肽的断裂位点；MethPrimer(http:/www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预 测CpG 岛；AnimalsTFDB 3.0(http:/ PROMO(http:/alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&calledBy=alggen)预测转录因子(Messeguer et al,2002)；STRING(https:/cn.string-db.org/)预 测 互 作 蛋 白；Jalview软件比对 LvILP1 与其他物种及胰岛素超家族基因在序列上的保守性；SMART 预测获得 LvILP1及胰岛素超家族成员的结构域区段序列，使用MEGA-X 软件中的邻接法(Neighbor-Joining)对这些序列进行系统进化分析，同时使用 MEME 网站(https:/meme-suite.org/meme/)预测序列保守的 motif。1.3.5 LvILP1 基因在发育时期的表达特征 凡纳滨对虾早期发育过程大体可分为胚胎期、无节幼体期、溞状幼体期、糠虾幼体期和仔虾期 5 个阶段。本实验室前期收集了凡纳滨对虾早期发育各阶段多个时期的混合样品作为检测样品，完成了早期发育 5 个阶段的转录组测序(Wei et al,2014)，并获得每个转录本的相对表达量 FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值。本研究从中提取 LvILP1 基因在每个发育时期的 FPKM 值，并导入 GraphPad Prism 7.0 软件绘图。1.3.6 LvILP1 基因组织表达的实时定量分析 在Primer 3 Plux 网站上设计荧光定量的引物(表 1)，设置检测片段长度为 200 bp 左右。将组织样品的 cDNA 稀释至适当浓度，使用 Eppendorf Mastercycler ep realplex 108 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 表 1 本研究所用引物 Tab.1 The primers used in this study 引物 Primer 引物序列 Primer sequence(53)用途 Purpose LvILP1-F CCGAAAAGATGGTGATGTCGATG PCR LvILP1-R GCCAATAGATACACTGGTGCAAA PCR rtLvILP1-F TGACTTCGTTCGACAGATTGAGA 定量 Quantitative rtLvILP1-R TCATCAGACTCTGCCGGAAG 定量 Quantitative 18S-F TATACGCTAGTGGAGCTGGAA 定量内参 Quantitative internal 18S-R GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT 定量内参 Quantitative internal (Eppendorf,德国)仪器进行 RT-qPCR 检测 LvILP1 在各组织中的相对表达量，同时 18S rRNA 的表达量作为参照。RT-qPCR 程序：95 预变性 2 min；95 变性 20 s，56 退火 20 s，72 延伸 20 s，40 个循环；72 延长 10 min。每个样品有 4 个技术重复，引物的熔融曲线被作为 PCR 产物特异性的依据。最后，使用 2Ct法计算基因的相对表达量。2 结果与分析 2.1 LvILP1 基因序列分析 从凡纳滨对虾转录组数据中筛选得到一条与斑节对虾(Penaeus monodon)ILP 有 87.93%相似性的序列，SMART 预测显示，其具有完整的 IlGF 结构域，该结构域是胰岛素超家族的特征结构域，由此我们确认该基因为凡纳滨对虾 ILP 基因，将其命名为 LvILP1(GenBank 登录号：ON973859)。在凡纳滨对虾基因组网站上进行 BLASTN 比对，发现 LvILP1 基因位于基因组的 LVANscaffold_2976 上，由 6 个外显子组成。序列分析显示，LvILP1 基因 mRNA 全长为 812 bp，开放阅读框为 543 bp，编码 180 个氨基酸。ProtParam预测其编码的蛋白分子量为 20.81 kDa，理论等电点为 9.45，不稳定系数为 96.20，平均疏水率为0.795，由此推测，LvILP1 为碱性不稳定的亲水蛋白。TMHMM Server 2.0、SignalIP-5.0 和 PSORT Prediction 预测显示，LvILP1 没有跨膜结构，有一个N 端信号肽，且定位在细胞膜外，属于分泌型蛋白。Neuropred 预测显示，LvILP1 存在 KR 和 RRRR 两个可能的断裂位点，蛋白水解酶通过断裂位点将其中间的序列(C 肽)切割以形成成熟的多肽；信号肽之后与KR 断裂位点前的序列为 B 链，RRRR 断裂位点之后的序列为 A 链，A 链、B 链上分别存在 4 个和 2 个保守的半胱氨酸，其中，Cys156-Cys162 由 A 链内的二硫键相连，Cys47-Cys157 和 Cys59-Cys171 由链间二硫键相连，共形成 3 个二硫键(图 1 和图 2A、B)。SOPMA 和 QUARK 预测显示，LvILP1 的 A、B 链均主要由 2 个-螺旋结构组成，A 链的-螺旋由 1 个Loop连接，B链内的2个-螺旋由-转角连接(图2C)。2.2 LvILP1 多序列比对及系统进化 通过 Jalview 软件将推导的 LvILP1 氨基酸序列与其他物种 ILP 及胰岛素超家族基因编码的氨基酸 图 1 LvILP1 基因序列 Fig.1 LvILP1 gene sequence 蓝色字体代表信号肽序列；红色加粗字体代表保守的氨基酸位点；黑色加粗字体代表断裂位点；绿色方框内的序列代表 A、B 链，B 链在信号肽序列后；斜体代表 C 肽。A signal peptide sequence is highlighted in blue font;the conserved amino acid sites are indicated in red bold;the cleavage sites are bolded with black font;the sequences in green box represent A-chain and B-chain,and B-chain is following signal peptide;C-peptide is marked in italics.第 1 期 苏曼文等:凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析 109 图 2 LvILP1 的结构模型 Fig.2 Structure model of LvILP1 A：LvILP1 线性结构模型；B：LvILP1 加工为激素的线性结构模型；C：预测的 LvILP1 蛋白三级结构。蓝色代表信号肽，绿色代表 B 链，灰色代表 C 肽，紫色代表 A 链。A:Linear structure model of LvILP1;B:Linear structure model of LvILP1 processing as hormone;C:Predicted 3-D structure of LvILP1 protein.The color blue represents signal peptide,the green represents B-chain,the gray represents C-peptide,and the purple represents A-chain.序列进行比对，结果显示，该序列与斑节对虾 ILP7相 似 性 最 高(87.78%)，其 次 是 东 澳 岩 龙 虾 ILP1(53.20%)、红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)ILP1(52.80%)、蚤状溞(Daphnia pulex)ILP1(40.74%)，与黑腹果蝇 ILP7、人类(Homo sapiens)relaxin、人类 insulin相似性较低(33%以下)，表明 ILP 氨基酸序列在不同物种中及与胰岛素超家族成员之间保守性不高，但它们都具有保守的 6 个半胱氨酸与 2 个断裂位点(图 3)。图 3 LvILP1 多序列比对 Fig.3 Multiple sequence alignment of LvILP1 黄色三角形表示保守的半胱氨酸位点，蓝色三角形表示保守的断裂位点。Yellow triangles indicate the conserved cysteine sites and blue triangles represent the conserved cleavage sites.GenBank accession number:人类 Homo sapiens insulin(AAA59172.1),人类 H.sapiens IGF-(CAA40342.1),斑马鱼 Danio rerio IGF-(AAH85623.1),人类 H.sapiens relaxin(CAA00599.1),斑马鱼 D.rerio relaxin(AEL22115.1),家蚕 Bombyx mori bombyxin(BAA00246.1),黑腹果蝇 Drosophila melanogaster ILP7(NP_570070.1),赤拟谷盗 Tribolium castaneum ILP(EEZ99258.2),罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii ILP1(QIW91885.1),斑节对虾 Penaeus monodon ILP7(XP_037788563.1),红螯螯虾 Cherax quadricarinatus ILP1(AIU40992.1),东澳岩龙虾 Sagmariasus verreauxi ILP1(AIU40991.1),凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei ILP1(ON973859),蚤状溞 Daphnia pulex ILP1(EFX76240.1),日本虎斑猛水溞 Tigriopus japonicus ILP1(AIW65597.1),秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans ILP(AAC33275.1).110 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 将多个物种的胰岛素超家族成员 insulin、IGF-、IGF-、relaxin 和 ILP 的氨基酸序列通过 SMART网站预测结构域，显示它们均具有 IlGF 结构域；不同的是，IGF-比其他成员多了一个 Pfam IGF2 结构域(图 4A)。选取结构域区段序列采用邻接法构建系统进化树(图 4B)，结果显示，以海葵 ILP 作为外群，该进化树可以分为 3 个大支：一是凡纳滨对虾 ILP 与斑节对虾 ILP7、红螯螯虾 ILP1、东澳岩龙虾 ILP1、美洲鲎ILP7、果蝇ILP7、肩突硬蜱ILP7以及柱头虫ILP7亲缘关系最近，聚为一支；二是脊椎动物与棘皮动物Relaxin 聚为一支；三是脊椎动物 IGF-、IGF-及Insulin 聚为一支，然后依次与家蚕 bombyxin、果蝇ILP7 之外的 ILPs 聚为一大支。对这些序列进行 motif预测，发现所有胰岛素超家族成员都具有 motif1、motif2 和 motif3，而 motif4 仅存在于 IGF-，motif5仅存在于甲壳动物中。对 motif 序列进行分析发现，图 4 LvILP1 的系统进化树及 motif 预测 Fig.4 Evolutionary tree and predicted motif of LvILP1 A：胰岛素超家族成员的 IlGF 结构域；B：LvILP1 的系统进化树；C：胰岛素超家族成员预测的 motif。A:The IlGF domain of insulin superfamily members;B:Evolutionary tree of LvILP1;C:Motif predicted with insulin superfamily members.GenBank accession No.:Danio rerio IGF-(NP_571900.1),Ictalurus punctatus IGF-(AAZ28918.1),Homo sapiens IGF-(CAA40342.1),H.sapiens IGF-(NP_001278791.1),Micropterus salmoides IGF-(ACS92730.1),D.rerio IGF-(AAH85623.1),H.sapiens insulin(AAA59172.1),Oreochromis aureus insulin(XP_031615350.1),D.rerio insulin(CAC20109.1),Bombyx mori bombyxin(BAA00246.1),Drosophila melanogaster ILP4(NP_648361.1),D.melanogaster ILP5(NP_996037.2),D.melanogaster ILP6(NP_570000.1),D.melanogaster ILP1(NP_648359.1),D.rerio relaxin 3a(NP_001032892.1),Takifugu rubripes relaxin 3a(NP_001092112.1),H.sapiens relaxin 3(AAL40345.1),Coscinasterias acutispina relaxin-like(BAU68093.1),Atiria pectinifera relaxin-like(BAQ35470.1),Ixodes scapularis ILP7(XP_029841940.1),Limulus polyphemus ILP7(XP_022245174.1),D.melanogaster ILP7(NP_570070.1),Saccoglossus kowalevskii ILP7(XP_006815151.1),Sagmariasus verreauxi ILP1(AIU40991.1),Cherax quadricarinatus ILP1(AIU40992.1),Penaeus monodon ILP7(XP_037788563.1),Litopenaeus vannamei ILP1(ON973859),Actinia tenebrosa ILP1-like(XP_031575451.1).第 1 期 苏曼文等:凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析 111 motif1 具有 2 个高度保守的半胱氨酸位点，存在于 B链；motif2 存在多个保守的精氨酸位点，为 A 链前端的 RxxR 断裂位点；motif3 具有 4 个高度保守的半胱氨酸位点，存在于 A 链(图 4C)。2.3 LvILP1 基因的 CpG 岛预测 通过 MethPrimer 程序预测，在 LvILP1 基因的转 录起始位点上游NW_020870482.1 c38863-36863区域(启动子区域)内存在一个 CpG 岛，大小为 203 bp，GC 含量大于 50%，包含 16 个 CpG 位点(图 5)。2.4 LvILP1 基因的转录因子预测 从 AnimalTFDB 3.0 和 PROMO 网站上同时预测LvILP1 基因 5侧翼区 2 Kb 序列上的转录因子结合位点，AnimalTFDB 3.0 预测的转录因子设定 P1013，PROMO 预测的转录因子设置最大矩阵相异率(容错率)为 0。选取最优预测的前 12 个转录因子，统计其参与的生物过程，并进行功能归类。结果显示，LvILP1 图 5 LvILP1 启动子区域内的 CpG 岛 Fig.5 CpG island in the promoter region of LvILP1 图 6 LvILP1 的转录因子及功能预测 Fig.6 Transcription factor and functional prediction of LvILP1 112 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 基因的转录因子主要具有 5 类功能，分别是转录调节、生长与发育调节、对类固醇激素的反应、碳水化合物代谢、生殖发育。此外，预测的转录因子叉头框蛋白 O3(forkhead box O3,FoxO3)是胰岛素通路的下游基因，糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)是胰岛素的转录因子，CAAT 区/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein,C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)是 IGF-的转录因子(图 6)。2.5 LvILP1 基因的互作蛋白预测 通过 STRING 在线数据库检索与 LvILP1 相互作用的蛋白，要求最低的交互分数为 0.4。如图 7 所示，LvILP1 与多个胰岛素超家族的受体 INSR(insulin receptor)、InR(insulin-like receptor)、Putative ILP receptor、IGF-1R(insulin like growth factor 1 receptor)，胰岛素受体底物(insulin receptor substrate 2-B,IRS-2B)以及 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)等相互作用，同时也与含特定结构域(STTK、BZIP)的蛋白质，神经相关的蛋白 VGLUT1(vesicular glutamate transporters 1)、putative SYT 1_3(synaptotagmin)，表皮与骨架相关的蛋白 Bursicon alpha、DSPP(dentin sialophosphoprotein)，糖蛋白激素(glycoprotein hormone beta 5,GPHB5)，胰岛素通路下游蛋白 PI3K、Akt(threonine/serine protein kinase)相互作用。对这些互作蛋白参与的生物过程进行分析，从而推测 LvILP1 参与了跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞对激素刺激的反应、葡萄糖稳态、脂质稳态、对饥饿的反应、正向调节生长发育以及正向调节边界卵泡细胞的迁移等生物过程。图 7 LvILP1 互作蛋白及其参与的生物过程 Fig.7 Interacting proteins of LvILP1 and the biological processes involved 2.6 LvILP1 基因的表达 凡纳滨对虾早期发育阶段的转录组数据显示，LvILP1 在早期不同的发育阶段均有表达，在溞状幼体时期表达量最高，之后表达量逐渐下降(图 8A)。RT-qPCR 分析凡纳滨对虾成体不同组织中 LvILP1 的表达特征，结果显示，LvILP1 在凡纳滨对虾各组织中均有表达，但表达量有差异，在眼柄中表达量最高，其次是卵巢、表皮、肌肉、胃、脑、肠等组织(图 8B)，这表明 LvILP1 基因表达广泛，在多种组织中具有重要的生物学作用。3 讨论 本研究鉴定了一种凡纳滨对虾 ILP 基因，蛋白理化性质分析结果显示 LvILP1 属于碱性不稳定的亲水性蛋白。在脊椎动物中，胰岛素是通过与细胞表面的糖蛋白受体结合从而发挥作用(Kahn,1985)，与之一致的是，LvILP1 定位在细胞膜外，可能与胰岛素一样通过与细胞膜上的受体结合从而发挥生物学功能。结构分析显示，LvILP1 具有胰岛素超家族典型的IlGF 结构域，由 N 端信号肽、B 链、C 肽、A 链组成，说明 LvILP1 属于胰岛素超家族成员。Pierce 等(2001)将秀丽隐杆线虫中的40种ins基因根据其二硫键的排列顺序分为、和 三种类型；LvILP1 在 A 链上有4 个保守的半胱氨酸，其中第 1 个保守的半胱氨酸通过