大菱鲆类胰岛素生长因子3基因的克隆和表达分析.pdf

第 45 卷 第 2 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.45,No.2 2 0 2 4 年4 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Apr.,2024 *国家自然科学基金(31972811)和中国水产科学研究院基本科研业务费(2020TD51)共同资助。张家荣，E-mail： 通信作者：贾玉东,研究员,E-mail: 收稿日期:2022-11-22,收修改稿日期:2023-01-09 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20221122001 http:/ 3 基因的克隆和表达分析.渔业科学进展,2024,45(2):220232 ZHANG J R,QIN H Y,XIE T,ZHANG X Y,LI F X,L J X,JIA Y D.Cloning and expression analysis of IGF3 in turbot(Scophthalmus maximus).Progress in Fishery Sciences,2024,45(2):220232 大菱鲆类胰岛素生长因子 3 基因的 克隆和表达分析*张家荣1,2,3 秦宏宇2,3 谢 婷2,3 张效宇2,3 李飞霞2,3 吕俊贤2,3 贾玉东2,3(1.上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所山东 青岛 266071；3.崂山实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 山东 青岛 266237)摘要 类胰岛素生长因子 3(insulin-like growth factor 3,IGF3)在硬骨鱼类性别分化过程中扮演重要角色，但其是否影响卵巢发育尚不明确。本研究以欧亚养殖良种大菱鲆(Scophthalmus maximus)为实验材料，通过 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术，获得了 IGF3 全长 cDNA 序列，分析了其生物信息学特征，预测了其与 IGF 特异性受体(IGF receptors,IGF-1R,IGF-2R)结合情况，查明了其组织和卵巢不同发育时期表达规律。结果显示，大菱鲆 IGF3 cDNA 全长为 1 255 bp，编码 259 个氨基酸。生物信息学分析发现，IGF3 为亲水性蛋白，具有典型的 IGF 特异性结构域和信号肽序列，同狭鳞庸鲽(Hippoglossus stenolepis)同源性最高；蛋白质三级结构域由 3 个 螺旋串联而成，同 IGF-1R 和 IGF-2R 紧密结合。组织表达分析显示，igf3 在大菱鲆各个组织中均有分布，雌、雄大菱鲆表达规律显著不同，但皆在脑组织中表达最高。在卵巢发育过程中，igf3 在卵黄生成后期表达量显著上升，在核迁移期达到最高，在闭锁期显著下降。以上结果表明，大菱鲆 IGF3 具有典型的 IGFs 家族结构特征，作为局域性内分泌因子，在组织中广泛分布且具有显著的性别二态性，同时参与调控了卵巢发育和成熟。相关结果为深入解析 IGF3 对大菱鲆卵巢发育和卵母细胞成熟的影响及其作用机制奠定了基础，也为探究鱼类 IGF3 新功能提供了重要思路。关键词 大菱鲆；IGF3；基因克隆；组织表达；卵巢发育 中图分类号 S96 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2024)02-0220-13 类胰岛素生长因子系统(insulin-like growth factors,IGFs)在鱼类和其他脊椎动物的生长、繁殖、早期发育、细胞分化和增殖等生物过程中发挥着关键性调控作用(Canosa et al,2020;Hasanpoor et al,2020;Qin et al,2020;Triantaphyllopoulos et al,2020)。在哺乳动物的研究中发现，IGFs 家族由 IGF1 和 IGF2 2 个亚型组成(Annunziata et al,2011)。Wang 等(2008)在斑马鱼(Danio rerio)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中首次发现了 1 个新的 IGFs 家族基因 IGF3。随后，在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)(Yang et al,2015)、第 2 期 张家荣等:大菱鲆类胰岛素生长因子 3 基因的克隆和表达分析 221 翘嘴鲌(Culter alburnus)(郑建波等,2021)和双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)(林权卓等,2016)等多种鱼类中也陆续证实了该基因存在。IGF3 具有 B、C、A和 D 4 个 IGFs 家族特异性结构域，尽管同 IGF1 和IGF2 序列之间同源性较低，但都有着相似的三级结构(Li J et al,2021)。IGF3 在鱼类的性腺发育过程中扮演着重要的角色，显著影响性别分化。在斑马鱼和尼罗罗非鱼中发现，igf3 仅在性腺(精巢和卵巢)特异性表达，且在精巢和卵巢发育过程中呈现出不同的表达规律(Wang et al,2008;Berishvili et al,2010)。银鱼(Pampus argenteus)的性腺发育过程中，IGF3 参与调控卵黄发生和精原细胞增殖(Gu et al,2021)。此外，伴随着斑马鱼卵母细胞成熟，igf3 转录水平在卵巢中呈显著上升趋势，重组 IGF3 可修复促黄体生成素 亚型(luteinizing hormone,LH)缺失的卵母细胞成熟缺陷(Li et al,2011;Li et al,2015)，且 IGF3 抗体蛋白可显著抑制人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadtrophin,HCG)诱导的排卵过程(Li et al,2018)。以上研究表明，IGF3 除了参与调控鱼类性别决定和分化过程外，可能也参与调控卵母细胞生长和成熟，进而影响卵巢发育。大菱鲆(Scophthalmus maximus)自 1992 年由中国水产科学院黄海水产研究所雷霁霖院士引进中国以来，经过 30 年的发展，养殖年产量稳定在 5 万 t 左右，约占大菱鲆世界总养殖产量的 80%，成为海水鱼类良种引进典范(国家海水鱼产业技术体系年度报告2021;谢婷等,2023)。在工厂化种苗繁殖过程中，大菱鲆不能自发性产卵，经过光温调控、激素催熟后，需要通过人工挤卵的方式获取成熟卵子进行体外受精孵化，因此，深入研究和系统阐明其卵母细胞发育调控机制将为批量获取高质量卵子提供重要理论依据。目前，对大菱鲆雌性亲鱼营养需求(Lavens et al,1999;李庆华等,2013)、激素诱导(Alvario et al,2001;Huang et al,2019)、光温调控(Imsland et al,2003;Polat et al,2021)、卵质评价(Jia et al,2015a、b)和下丘脑垂体性腺(hypothalamus-pituitary-gonad,HPG)轴关键基因功能(Jia et al,2014、2016、2019;Hu et al,2018;Gao et al,2019)进行了较为系统的研究。IGFs作为重要的局域性内分泌因子，参与调控大菱鲆早期发育和繁殖过程。Duval 等(2002)首次克隆获取了大菱鲆 IGF1 和 IGF2 的全长 cDNA 序列，并证实其重组活性肽可显著抑制垂体细胞生长激素的分泌。IGF1和 IGF2 在大菱鲆胚胎发育和早期变态发育过程中发挥重要功能(Wen et al,2015;Meng et al,2016)。igf3可调控大菱鲆性别决定相关基因的表达(赵珊珊,2022)，但 IGF3 是否影响其卵巢发育尚不明确。本课题组的前期研究检测了目前已知的大菱鲆 IGF 系统家族成员(IGF1、IGF2、IGFBP1、IGFBP2 和 IGF-1R)在卵巢发育过程中的表达，发现上述家族成员通过复杂的内分泌、自分泌和旁分泌的方式参与调节卵母细胞的生长、成熟和排卵(Jia et al,2019)。基于此，本研究克隆获取大菱鲆 IGF3 的全长 cDNA 序列，并利用生物信息学工具初步预测其功能，分析其在不同组织和卵巢发育过程中的表达变化，旨在为后续研究IGF3 在大菱鲆性腺分化和卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础数据支撑。1 材料与方法 1.1 实验材料 不 同 规 格 雌 性 大 菱 鲆 各 10 尾 10 月 龄，(800150)g；15 月龄，(1 500200)g；20 月龄，(2 000 200)g；24 月龄，(2 500200)g；26 月龄，(3 000200)g和雄性大菱鲆 10 尾10 月龄，(700150)g由烟台开发区天源水产有限公司提供。实验鱼分别置于 6 个循环水养殖桶中(10 尾/桶，50 L)暂养 2 周。暂养期间，保持循环水温度(15.00.5)，溶解氧(DO)(4.5 2.0)mg/L，pH 为(7.90.3)，盐度为(30.01.0)，每日08:00 和 16:00 进行饱食投喂商品饲料(三通生物工程有限公司)。RNA提取试剂盒(SteadyPure Universal RNA extraction kit)和 qRT-PCR 试剂盒(SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit)购自艾科瑞生物科技有限公司。反转录试剂盒(Prime Script RT reagent kit)、PCR高保真酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)、RACE克隆试剂盒(SMARTer RACE 5/3 kit)和凝胶电泳Marker(DL2000 Marker)购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。1.2 样品采集和组织形态学观察 取样前禁食 24 h，分别从每个养殖水桶中随机挑选 6 尾实验用鱼，MS-222(100 mg/L)深度麻醉后，迅速解剖取出心、肝、脾、肾、胃、肠、鳃、性腺(卵巢和精巢)、脑和垂体组织保存于液氮，用于基因克隆和表达分析。另取部分性腺(卵巢和精巢)组织于 4%多聚甲醛中固定，用于组织形态学观察，确定不同规格大菱鲆卵巢和精巢发育阶段。性腺组织固定 24 h后取出，经酒精梯度脱水(50%、75%、85%、95%和100%)和二甲苯透明后进行石蜡包埋，然后在切片机(湖北阔海医疗有限公司，KH-Q 330)上进行连续切片222 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 (5 m)，再经展片、烘干、脱蜡后进行苏木素伊红(HE)染色、中性树脂胶封片。组织切片在显微镜(徕卡，DM 500)下进行形态学观察。1.3 igf3 全长 cDNA 序列克隆 使用 RNA 提取试剂盒获取组织总 RNA，用NanoDrop 2000(Thermofisher，美国)测定 RNA 浓度。取 1 g 总 RNA 使用反转录试剂盒合成 cDNA，根据已知鱼类 IGF3 保守序列，利用 CodeHop 原理(Rose et al,2003)设计简并引物(IGF3-F0 和 IGF3-R0)，使用高保真酶进行 PCR，获得 IGF3 部分 CDS 序列。扩增体系：12.5 L PrimeSTAR Max DNA Polymerase，8.5 L ddH2O，2 L cDNA，上下游引物各 1 L。反应条件：94 5 min；94 30 s，55.5 40 s，72 40 s，30 个循环；72 10 min。根据保守序列利用Primer Premier 5 设计特异性 GSP 引物(5IGF3 race、5IGF3 nest、3IGF3 race 和 3IGF3 nest)，利用 RACE试剂盒进行全长基因克隆。本实验所用引物见表 1。表 1 本研究所用引物 Tab.1 Primers used in the present study 引物 Primers 引物序列 Primer sequence(53)用途 Purpose 产物长度 Product/bp IGF3-F0 TGTGTGTTCAGATCATGTGTCT IGF3-R0 CAAAGAGCCCACAGAAAACCAC IGF3 cDNA 片段扩增 cDNA fragment of IGF3 259 5IGF3 race GTGGTTTTCTGTGGGCTCTTTG 5-RACE 5IGF3 nest CGAACCTTTACCGAAATAGATC 5-RACE 194 3IGF3 race GGTACGGATCTCCTCAGCGACCTC 3-RACE 3IGF3 nest TGTGCCAAACCAAAGAGCCCACAG 3-RACE 968 IGF3-F CTCCTCAAGCTGCTCCTCTG IGF3-R GGACCACGAACCTTTACCGA qRT-PCR 183-actinF ACTGGGACGACATGGAGAAG-actinR TCACACCATCACCAGAGTCC qRT-PCR 138 1.4 IGF3 生物信息学分析 克隆所得全长 cDNA 序列在 NCBI 数据库中进行BLAST(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对和同源性分析，利用 ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推断开放阅读框和氨基酸序列。ExPASy(https:/web.expasy.org/protparam/)预 测 蛋 白 理 化 性质。SMART(smart.embl-heidelberg.de)预测序列信号肽结构和保守结构域。DNAMAN 对氨基酸序列进行多重比对。采用邻近法(Neighbor-joining,NJ)，通过MEGA5.0 软件构建系统发育树。其他鱼类 IGFs 氨基酸序列下载自 NCBI(表 2)，使用 SWISS-MODEL(https:/swissmodel.expasy.org/interactive)构建三级结构模型。IGF1R(code 5U8R)和 IGF2R(code 6UM2)三级结构从 Protein Data Bank(PDB)(https:/www.rcsb.org/)下载获得。使用 Vakser Lab(https:/vakserlab.ku.edu/)预测 IGF3 和 IGFRs 的结合位点，并采用 Discovery Studio 4.5 软件进行可视化修饰。1.5 igf3 组织表达分析和数据处理 使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测igf3在大菱鲆不同组织和卵巢发育过程中的表达。根据克隆所得全长 CDS 序列，使用 Primer Premier5 软件设计特异性引物(IGF3-F 和 IGF3-R)，参考本实验室之前研究，选用-actin 为内参基因(Gao et al,2020)，利用 表 2 不同物种 IGF 分子氨基酸序列 GenBank 登录号 Tab.2 The GenBank number of different species IGFs 蛋白Protein物种 Species 登录号 Accession No.IGF1大菱鲆 Scophthalmus maximus XP_035474340.1IGF1斑马鱼 Danio rerio AAI14263.1 IGF1狭鳞庸鲽 Hippoglossus stenolepis XP_035003443.1IGF1尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus ABY88872.1 IGF1大西洋鲑 Salmo salar NP_001117095.1IGF1青鳉 Oryzias latipes ATY35168.1 IGF2大菱鲆 Scophthalmus maximus AEJ89913.1 IGF2a 斑马鱼 Danio rerio AAH85623.1 IGF2b 斑马鱼 Danio rerio AAL06080.1 IGF2狭鳞庸鲽 Hippoglossus stenolepis XP_035013219.1IGF2尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus ABY88873.1 IGF2大西洋鲑 Salmo salar ABO36528.1 IGF2青鳉 Oryzias latipes XP_023811944.1IGF3斑马鱼 Danio rerio NP_001108522.1IGF3狭鳞庸鲽 Hippoglossus stenolepis XP_035014523.2IGF3尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus NP_001266565.1IGF3大西洋鲑 Salmo salar XP_014001555.1IGF3青鳉 Oryzias latipes QGX02415.1 IGF3翘嘴鲌 Culter alburnus QJI54811.1 IGF3鲻 Mugil cephalus XP_047428370.1IGF3大菱鲆 Scophthalmus maximus OP 028637 第 2 期 张家荣等:大菱鲆类胰岛素生长因子 3 基因的克隆和表达分析 223 ABI7500 实时荧光定量 PCR 仪(Applied Biosystems,美国)进行 qRT-PCR。采用 2Ct法(Livak et al,2001)计算 igf3 在不同组织和卵巢发育中的相对表达水平。每个样品进行3次重复实验。所得数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan 法进行组间多重比较，所有结果用平均值标准误(MeanSE)的方式表示，P70%，深蓝色表示序列完全匹配。大菱鲆 IGF3 氨基酸序列用红色箭头标注。蓝色下划线为结构域 B，绿色下划线为结构域 C，黄色下划线为结构域 A，紫色下划线为结构域 D。Position with 70%similarity are shaded in magenta,while completely conserved positions are shaded in navy.Turbot IGF3 is marked with a red arrow.Domain B is underlined in blue,domain C is underlined in green,domain A is underlined in yellow,and domain D is underlined in purple.氨基端有一个高度保守的结构域，可划分为 B、C、A 和 D 四部分，大菱鲆与所有鱼类在该结构域高度同源，其中，大菱鲆与斑马鱼、翘嘴鲌、青鳉(Oryzias latipes)、鲻(Mugil cephalus)、大西洋鲑(Salmo salar)、尼罗 罗 非鱼、鲤 鱼(Cyprinus carpio)和狭 鳞 庸鲽(Hippoglossus stenolepis)IGF3 序列相似度分别 为17.04%、16.73%、25.66%、30.19%、16.67%、28.30%、17.45%和 37.45%(图 2)。系统发育树分析发现，不同IGFs 家族成员分为 IGF1，IGF2 和 IGF3 三个分支簇，其中,IGF3 分支又可分为 2 个分支，大西洋鲑、斑马鱼、鲤鱼和翘嘴鲌同属一支，而青鳉、尼罗罗非鱼、鲻、大菱鲆和狭鳞庸鲽同属一支，其中，大菱鲆同狭鳞庸鲽同源性最高(图 3)。2.3 大菱鲆 IGF3 蛋白三级结构及受体结合性分析 根据大菱鲆 IGF3 序列利用 SWISS-MODEL 构建三级结构模型，结果发现，大菱鲆 IGF3 由 3 个 螺旋串联而成，并且通过弯曲盘绕使得 3 个 螺旋区空间位置相互靠近(图 4)。在 PDB 数据库下载 IGF1R 和IGF2R 三级结构，利用 Vakser Lab 预测 IGF3 与受体第 2 期 张家荣等:大菱鲆类胰岛素生长因子 3 基因的克隆和表达分析 225 的对接模型。结果显示，大菱鲆 IGF3 的 螺旋区可同 IGF-1R 和 IGF-2R 结合，且有多个连接键位，其中，与 IGF-1R 末端结构域结合，与 IGF-2R 中心区域多个结构域结合(图 4)。2.4 大菱鲆 igf3 在各组织中相对表达分析 通过观察雌性大菱鲆10 月龄，(800150)g和雄性大菱鲆10 月龄，(700150)g性腺组织形态学结构，确定其发育阶段，利用 qRT-PCR 技术检测不同性别大菱鲆各组织 igf3 相对表达水平。组织形态学观察结果显示，大菱鲆精巢由精小囊组成，精小囊内主要为初级精母细胞和次级精母细胞；卵巢内卵母细胞紧密排列，核仁位于生发泡周围；表明大菱鲆处于性腺发育早期(图 5B)。组织相对表达分析发现，igf3 在不同性别大菱鲆中表达水平不同，在肝、肾、胃、性腺 和 脑 中 雄 性 大 菱 鲆 中 表 达 量 显 著 高 于 雌 性(P0.05)，在心、肠和垂体中，雌性大菱鲆表达量显著高于雄性(P0.05)；在雄性大菱鲆各组织中，igf3 在脑中表达量最高，且显著高于其他组织(P0.05)，在雌性大菱鲆各组织中，igf3 在脑和肠中表达量最高，显著大于其他组织(P0.05)(图 5A)。2.5 大菱鲆 igf3 在卵巢发育过程中相对表达分析 组织形态学观察确定不同规格雌性大菱鲆卵巢发育阶段，组织表达分析 igf3 在卵巢发育过程中的mRNA 水平变化。结果显示，大菱鲆卵巢分为 5 个不同时期，卵黄生成前期，核仁位于生发泡外围；卵黄 图 3 IGF3 氨基酸序列 NJ 系统进化树 Fig.3 The NJ phylogenetic tree of IGF3 amino acid sequence 橙色节点代表 1 000 自展(Bootstrap)检验置信值；红色箭头为大菱鲆。Orange node indicates the percentage of 1 000 bootstrap replicates;Red arrow:Turbot.226 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 图 4 大菱鲆 IGF3 三级结构以及受体结合预测 Fig.4 Tertiary structure of turbot IGF3 and docking prediction with IGF1R and IGF2R IGF-Rs 不同结构域用不同颜色标注，大菱鲆 IGF3 用红色标记。Different domains of IGF-Rs are marked with different colors,and turbot IGF3 is marked in red.图 5 大菱鲆 igf3 mRNA 在不同组织中相对表达(A)及性腺组织结构(B)Fig.5 The relative expression of igf3 mRNA in different tissues(A)and the histologic of gonadal(B)of turbot 1：心；2：肝；3：脾；4：肾；5：胃；6：肠；7：性腺；8：鳃；9：脑；10：垂体。：雄性，箭头指示精小囊内初级精母细胞和次级精母细胞；：雌性，箭头指示卵母细胞核位于生发泡外围。不同小写字母表示差异显著(P0.05)。1:Heart;2:Liver;3:Spleen;4:Kidney;5:Stomach;6:Intestine;7:Gonad;8:Gills;9:Brain;10:Pituitary.:Male,arrows indicate that the seminal vesicles are dominated by primary spermatoblasts and secondary spermatoblasts;:Female,the arrow indicates the nucleoli are on the periphery of the germinal vesicle.Different lowercase letters indicate significant differences(P0.05).生成早期，卵黄颗粒在中部累积，细胞质出现滤泡；卵黄生成晚期，卵黄颗粒几乎充满卵母细胞，细胞核还未开始转移；核迁移期，卵黄充满整个卵母细胞，细胞核不明显；闭锁期，卵母细胞开始收缩和塌陷(图 6B)。mRNA 相对表达分析发现，大菱鲆 igf3 表达量随着卵巢发育过程变化，在卵黄生成后期显著上升(P0.05)，在核迁移期继续升高且达到最大值，在闭锁期显著降低(P0.05)(图 6A)。3 讨论 IGFs 是一类和胰岛素高度同源的生长因子蛋白，由 5 个保守结构域 B、C、A、D 和 E 组成(Sachdev et al,2001)，作为分泌性蛋白，经过转录翻译修饰后需利用信号肽转运到细胞外，通过内分泌、旁分泌和自分泌的方式参与调控生命活动(Laviola et al,2007;Vincent et al,2002)。本研究结果显示，大菱鲆 IGF3总平均亲水系数为0.368，N 末端有 33 个氨基酸组成的信号肽序列。亲水性有利于 IGF3 在体液中运输，而信号肽序列是蛋白翻译修饰后转运到胞外所必需的结构(Izard et al,1995)。序列比较结果显示，大菱鲆 IGF3 与其他鱼类只在 B、C、A 和 D 4 个保守结构域相似度较高，而总体相似度较低，这可能是因为目前已知 IGF3 序列来自与大菱鲆亲缘性较远的物种，且保守结构域在整个蛋白中占比较低。IGFs 分子的结构域 E 会在形成成熟肽时被切除，因此，同源性较低，难以根据氨基酸序列划分，高同源性的 IGF 特异性结构域也表明，这是 IGFs 分子发挥功能必备的结构(Li J et al,2021)。物种发育树结果显示，所有鱼类IGF3 单独聚为一支，且根据物种亲缘性可划分为多个小分支，大菱鲆 IGF3 与狭鳞庸鲽同源性最高。可见 IGF3 系统进化关系同物种分类高度一致，大菱鲆在进化关系上与狭鳞庸鲽最接近。以上结果表明，大菱鲆 IGF3 具有典型的 IGFs 家族结构特征，为高度保守的新型大菱鲆 IGF 分子，作为分泌型蛋白发挥其生理调控功能。IGFs 主要通过与其特异性受体(IGF-1R,IGF-2R)结合，诱导细胞内信号级联反应，发挥其生理调控功能(Denley et al,2005)。IGF-1R 属于酪氨酸激酶受体，与配体 IGFs 结合后可激活 PI3 信号通路和 MAPK 信号通路(Chitnis et al,2008)参与多种细胞功能调节。IGF-2R 属于甘露糖 6-磷酸受体，被认为是生长抑制因子，主要与 IGF2 结合发挥功能，并且参与溶酶体的形成和细胞内吞作用(Brown et al,2008)。蛋白质在转录翻译后还需要折叠成正确的三级结构才能发挥 第 2 期 张家荣等:大菱鲆类胰岛素生长因子 3 基因的克隆和表达分析 227 图 6 大菱鲆 igf3 mRNA 在卵巢发育过程中相对表达(A)及卵巢组织学变化(B)Fig.6 The relative expression of igf3 mRNA(A)and the histologic of ovarian(B)during turbot ovarian development 1：卵黄生成前期，箭头指示核仁位于生发泡外围；2：卵黄生成早期，细胞质出现滤泡，卵黄开始积累；3：卵黄生成 晚期，箭头指示卵黄颗粒几乎充满细胞，细胞核还未迁移；4：核迁移期，卵黄颗粒充满细胞，细胞核已经迁移；5：闭锁期，箭头指示卵母细胞收缩塌陷。不同小写字母表示差异显著(P0.05)。1:Previtellogenesis,arrows indicate the nucleoli are on the periphery of the germinal vesicle;2:Early vitellogenesis,arrows indicate gradually accumulations of yolk granules in the central region 3:Late vitellogenesis,arrows indicate the yolk granules almost fill the ooplasm,and the nucleus has not yet begun to migrate peripherally;4:Migratory nucleus,arrows indicate the yolk granules have attained their maximum size just prior to spawning,and the nucleus is not evident;5:Atresia,arrows indicate the oocyte shrinkage and collapse.Different lowercase letters indicate significant differences(P0.05).特定的生物学功能，通过预测蛋白质的三级结构以及其对接模型有助于探究其作用机制(Eswar et al,2008;Bonvin,2006)。本研究发现，大菱鲆 IGF3 的三级结构由 3 个 螺旋串联而成，其 螺旋结构域可分别与IGF-1R 的末端结构域以及 IGF-2R 的中心区域结合，且有多个连接位点。人类 IGF1 的三级结构已被解析，与上述结果相似(Vajdos et al,2001)。此外，人类 IGF1与 IGF-1R 的对接结果(Xu et al,2018)以及牛的 IGF2与 IGF-2R 对接结果(Wang et al,2020)也与大菱鲆IGF3 对接预测位置类似。以上结果表明，大菱鲆 IGF3与其他 IGFs 分子高度同源，拥有相似的三级结构，可通过 IGF 信号系统发挥相应生物学功能。在斑马鱼和尼罗罗非鱼的研究中发现，IGF3 为性腺特异性表达蛋白，参与性别决定和分化过程(Wang et al,2008)，同时，igf3 在斜带石斑鱼(Yang et al,2015)、鲤 鱼(Song et al,2016)、圆 尾 金 翅 鲷(Chrysiptera cyanea)(Li Z et al,2021)和金钱鱼(Scatophagus argus)(Rizky et al,2020)性腺外多个组228 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 织广泛分布。本研究发现，igf3 在性腺发育早期雌、雄大菱鲆各组织中均有表达，且呈现不同表达规律，但均在脑中表达最高，这表明与大多数鱼类一样，大菱鲆 IGF3 具有广泛的组织分布，在脑中的高水平表达预示其可能参与了更为复杂的神经内分泌调控。脑是控制中心，通过下丘脑垂体性腺(HPG)轴与 GH(growth hormone)/IGF 轴调控脊椎动物的生长和繁殖过程(Servili et al,2020;徐永江等,2017)。在哺乳动物脑中发现 IGF1 与雌激素协同参与生殖功能调节(Quesada et al,2002)。此外，Margaret 等(2002)发现，外源 GH 可以提高幼年鲤鱼脑中 igf1 和 igf2 的表达水平。在草鱼中发现，igf3 在下丘脑和小脑中高表达，可能参与生长摄食调控(Yang et al,2022)。林权卓等(2016)发现，随着性腺发育，igf3 在不同性别双棘黄姑鱼脑中的表达变化规律不同，脑可能参与了 igf3在性腺表达的反馈调节。此外，本研究还发现，IGF3分别在雌、雄大菱鲆肠组织和胃组织中高表达；对罗非鱼和金头鲷(Sparus aurata)的研究发现，IGF1 和IGF2 在肠道渗透调节以及消化道早期发育过程中发挥重要功能(Link et al,2010;Perrot et al,1999)。IGF3作为新型 IGFs 分子，可能在大菱鲆肠道中也扮演重要角色。以上结果表明，IGF3 在性腺发育早期大菱鲆组织中广泛分布，存在显著性别二态性差异，可能通过 HPG 轴参与调控生长繁殖过程，同时作为重要的局域性内分泌因子，在维系胃肠道正常生理功能过程中发挥重要作用。IGF3 作为鱼类性腺特异性分子，在卵母细胞成熟过程中扮演着重要角色(Li J et al,2021)。在斑马鱼的研究中已经证明 IGF3 受到 LH 的调控，并且通过IGF-1R 信号系统参与调控卵母细胞成熟过程(Li et al,2011;Li et al,2015)。大多数鱼类的卵母细胞会在第一次减数分裂前期的双线期停滞，直到细胞内积累足够的卵黄后，随着体内促性腺激素水平的上调，恢复减数分裂过程(Patio et al,2002)。根据卵母细胞组织形态可将大菱鲆卵巢划分为 5 个不同发育时期：卵黄生成前期、卵黄生成早期、卵黄生成晚期、核迁移期和闭锁期(Jia et al,2014)。本研究发现，igf3 表达水平在大菱鲆卵巢卵黄生成后期显著上升，在核迁移期继续上升达到最大值，随后在闭锁期降低。在金钱鱼和圆尾金翅雀鲷的卵巢发育过程中也发现 igf3 转录水平在卵黄生成后期显著上调(Rizky et al,2020;Li Z et al,2021)。对青鳉的研究发现，igf3 转录水平随着卵母细胞成熟逐渐上升，并且原位杂交实验结果证实其主要分布于卵黄生成后期和核迁移期卵巢内的颗粒细胞和膜细胞中(Xie et al,2020)。大菱鲆 igf3 在卵黄生成后期和核迁移期卵巢内显著高表达，预示其在恢复卵母细胞减数分裂、促进卵母细胞成熟过程中发挥重要功能。在一些养殖鱼类中已经发现，IGF1 和IGF2 的转录水平会随着卵子老化而显著下调，可以作 为 评 估 卵 子 质 量 的 指 标(Sullivan et al,2015;Aegerter et al,2005)。IGF3 作为参与调控卵母细胞成熟的重要 IGFs 家族成员，进一步探明其作用机制，可为评估卵子质量提供新的研究思路。4 结论 综上所述，本研究首次克隆了大菱鲆 IGF3 全长cDNA 序列，通过生物信息学分析验证了其序列保守性，并初步预测了其编码蛋白的功能、三级结构以及与 IGF 受体的结合模型，同时检测了其在性腺发育早期大菱鲆各组织中的分布和卵巢各发育阶段的表达水平。结果发现，大菱鲆 IGF3 cDNA 全长序列为1 255 bp，编码 259 个氨基酸，同狭鳞庸鲽同源性最高；蛋白质三级结构域由 3 个 螺旋串联而成，可同IGF-1R 和 IGF-2R 紧密结合；igf3 在大菱鲆各个组织中均有表达分布，且呈显著性别二态性；在卵巢发育过程中，igf3 表达水平随着卵母细胞成熟逐渐升高，在排卵后下降。相关结果为研究 IGF3 在大菱鲆卵巢发育和卵母细胞成熟过程中的作用机制奠定了基础，同时也为探究鱼类 IGF3 功能提供了重要参考。参 考 文 献 AEGERTER S,JALABERT B,BOBE J.Large scale real-time PCR analysis of mRNA abundance in rainbow trout eggs in relationship with egg quality and post-ovulatory ageing.Molecular Reproduction and Development:Incorporating Gamete Research,2005,72(3):377385 ALVARIO J M R,REBOLLAR P G,OLMEDO M,et al.Effects of melatonin implants on reproduction and growth of turbot broodstock.Aquaculture International,2001,9(6):477