第6章 吸光光度法.pdf

河南师范大学 第6章 吸光光度法 教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。教学重点：Beer 定律；光度分析的应用。教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。6.1 概述 6.1 概述 6.1.1 吸光光度法的特点 6.1.1 吸光光度法的特点 1光的基本性质 紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50m 单色光：单一波长的光。复合光：由不同波长的光组成的光。互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见 p216。溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。两互补色按一定比例混合后，可得到白色。2吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有选择性。分子能级图，p215，图 61。吸收光谱曲线：AC 曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。a.max 与 c 无关 b.Ac 6.1.2 光吸收的基本定律 6.1.2 光吸收的基本定律 1 朗伯比尔定律 1760 年，Lambert 用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光程成正比。1852 年，Beer 研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。吸光度：0lgIAKbcI=透光率：0ITI=01lglgIAIT=2摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度（1）摩尔吸收（光）系数 AKbc b：cm c：mol/L A=bc :摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1.mol-1 物理意义：一定下，b1cm，c1 mol/L 时的吸光度。实际工作中不能用c1 mol/L的溶液测吸光度(A0.2-0.7)。能反映方法的灵敏度，光度法测定：104，一般:105已很灵敏。（2）桑德尔灵敏度指数：S（g/cm2）在max 时，A=0.001 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。61河南师范大学 S与的关系：A0.001bc，bc0.001/S=b(cm)c(mol/dm3)M(g/mol)106g/g30.00110MM=(g/cm2)Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，1.1104，灵敏度高灵敏度高 Fe2+与磺基水杨酸络合物，5.8103，双硫腙与Pb的6.8104，SM/207/6.8104=0.0030(g/cm2)双硫腙与Cu的4.52104，SM/63.5/4.52104=0.0014(g/cm2)灵敏度高灵敏度高 3吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1，A2，An，则总吸光度为：A=A1+A2+An （据此可进行多组分的测定）6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1.目视比色法目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯比尔定律也可用目视比色法，因为比较的是透过光。2.光电比色法光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。3.吸光光度法吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。4.分光光度计及其基本部件分光光度计及其基本部件：光源单色器比色皿（吸收池）检测器显示器（1）光源 钨丝灯：可见、红外 4001000nm 氢灯或氘灯：紫外 160350nm（2）单色器 a 滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。b 棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见 c 光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm,衍射、干涉原理（3）吸收池：玻璃:可见,石英:紫外、可见（4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。（5）显示器：检流计：72 型。数字显示：722 型。数字打印：UV240。6.2 光度分析法的设计 6.2 光度分析法的设计 6.2.1 显色反应：6.2.1 显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。MLML 1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，104；（3）有色化合物ML要稳定，不分解；（4）ML 的组成要一定（只 ML 无 MLn）；（5）ML 与 L 颜色差别大,吸收峰波长差：60nm.2显色剂：满足以上要求。有机显色剂 6.2.2 显色条件的选择 6.2.2 显色条件的选择 1.溶液的酸度：MLML（显色剂L存在酸效应L（H）a 影响显色剂的溶度 b 影响 M 的存在状态 c 影响ML的组成和稳定性，如Fe3磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色 2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。62河南师范大学 4溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。6干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。干扰的消除：（1）制一定酸度，使干扰组分不生色。（2）掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。（3）选择适当的波长。（4）选择适当的参比液 （5）分离干扰组分 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1测量波长的选择(1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图 67 2.吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T 为 65%-15%）(相对误差较小)6.2.4 参比溶液的选择 6.2.4 参比溶液的选择 1M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。2.L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。3.L 有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。4L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。5 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。6.2.5 标准曲线的制作标准曲线的制作 配制一系列标准溶液，作 Ac 曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。6.3 光度分析法的误差光度分析法的误差 6.3.1 对朗伯比尔定律的偏离对朗伯比尔定律的偏离 1非单色光 121201021101222021201020102120102lg,10lg,10AlglgAAc1010bcbcbcbcIIAbcIIAbcIIIIIIIIIIII=1212 若 ，则 bc,若，与 不成线性关系 2介质不均匀引起的偏离 3由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 6.3.2 吸光度测量的误差吸光度测量的误差 光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差T 为定值。一定的T，T，对应的c c不同，相对误差c/c不同。c c小，T T引起的c c小，c/c大；c c大，T T引起的c c大，c/c大。0.434dTdA0.434dT0.434dTA=-lgT=0.434lnT dA=-=-=TAT(-lgT)T lgT?相对误差：0.434lgcAdAdTREcAATT=?63河南师范大学 6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用 6.4.1示差吸光光度法 6.4.1示差吸光光度法 1原理(高浓度示差吸光光度法)选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。()()00000,xxxxxAc bAAAAb ccb cbcAb ccb cAc b=相对相对定量基础：xa.先做Ac 标准曲线；b.测待测溶液的A；c.从标准曲线查出相应的c；d.cx=c0+c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x%普通光度法结果：cc%xxcx，示差光度法结果：cc()0%xx6.4.2 双波长吸光光度法双波长吸光光度法 1原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物试样的分析 2应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。6.4.3 酸（碱）离解常数的测定酸（碱）离解常数的测定 HB =H+B在某波长下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B均有吸收，液层厚度b=1cm）则()(),lHBHBaHBHBBBaaHBHBHBaBBBcHcKAHBBKHKHAAAc AcpKpHAA+=+=+=g 6.4.4 络合物组成的测定络合物组成的测定 （1）饱和法(又称摩尔比法)（2）连续变化法(又称等摩尔系列法)固定一种组分(通常是金 cM+cR=c，改变cM和cR的相对量，属离子 M)的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物 剂(R)的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列 R/M比值不同的溶液，溶液的吸光度。当溶液中络合物 并配制相应的试剂空白作 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。参比液，分别测定其吸光度。当cM/c为 0.5 时，络合比为 1:1；以吸光度A为纵坐标，R/M为横坐标作图。当cM/c为 0.33，络合比为 1:2；作业：P作业：P238238 3,5,6 P 3,5,6 P239239 8,11,12 P 8,11,12 P240240 15,17,19 15,17,19 64