病毒的纯化与保存.pptx

病毒纯化和保留病毒的纯化与保存第1页病毒纯化目标(了解)n为了了解病毒结构、传染与免疫、遗传与变异等性质，经常需要高纯度病毒病毒的纯化与保存第2页病毒纯化原理病毒纯化原理(熟悉熟悉)n利用物理或化学方法尽可能地去除宿主细胞中组分，将病毒从其宿主细胞内提纯出来，在纯化过程中保持病毒生物活生物活性性和感染性感染性。病毒的纯化与保存第3页病毒纯化普通标准病毒纯化普通标准(熟悉熟悉)n1、释放病毒到胞外、释放病毒到胞外1.1 轻易释放病毒(培养液/尿囊液)1.2 不轻易释放病毒(细胞破碎)n2、去除细胞碎块、去除细胞碎块低速离心，以6000r/min离心3040分钟，可除去90以上细胞碎片和杂质 n3、病毒悬液浓缩、病毒悬液浓缩病毒的纯化与保存第4页细胞破碎方法细胞破碎方法(熟悉熟悉)n超声破碎：密集小气泡快速炸裂，破坏细胞n高压匀浆：机械切割力n高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂n酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶n化学渗透：渗透压改变使细胞破裂n重复冻融：形成冰晶，使细胞膨胀破裂病毒的纯化与保存第5页 病毒纯化方法病毒纯化方法聚乙二醇(PEG)浓缩法nPEG是环氧乙烷和水缩合而成水溶性非离子聚合物，无毒、无刺激性。n平均分子量不一样，性质也有差异。分子量200600者常温下是无色无臭粘稠液体，分子量在600以上者就逐步变为半固体状、蜡状固体。n伴随分子量增大，其吸湿能力对应降低。病毒的纯化与保存第6页不一样分子量PEG性质比较病毒的纯化与保存第7页病毒的纯化与保存第8页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n分子量6000PEG用于病毒浓缩nPEG可使病毒颗粒形成多聚体，较低离心力即可沉淀n(1)直接加入法 病毒悬液量少时候使用此法；病毒悬液中加入8%-10%PEG病毒的纯化与保存第9页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n(2)液体浓缩法 病毒的纯化与保存第10页聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)n(3)固体浓缩法 将PEG固体覆盖于装有病毒悬液透析袋上，进行浓缩。透析袋孔径大小病毒的纯化与保存第11页超出滤法(熟悉)n原理：利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。n超滤膜孔径要比病毒颗粒小n只能去除比病毒小细胞碎块病毒的纯化与保存第12页吸附法(熟悉)n原理：病毒颗粒表面离子与吸附剂有亲和性，病毒吸附之后，使用适当条件将病毒洗脱下来。n吸附剂必须具备特点：较大表面积和吸附能力；较高吸附选择性；便于洗脱；性质稳定；病毒的纯化与保存第13页凝胶吸附法-磷酸钙凝胶n惯用凝胶，由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物，用0.001 mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于445天，使之充分沉淀后应用。病毒的纯化与保存第14页凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶n是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5)制备，在制备后数小时内较稳定。n方法：将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使它们形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/LEDTA(pH8.5)解离回收病毒。病毒的纯化与保存第15页凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶n是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/LMgCl2，以2：10(体积)百分比在室温中迟缓滴加混合而取得较稳定焦磷酸镁凝胶。n将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/L盐水洗2次，最终用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒很好地回收于水相中。病毒的纯化与保存第16页红细胞吸附法(熟悉)n用于一些与红细胞吸附病毒浓缩n选择适宜动物红细胞：鸡红细胞n基本步骤：1)1%-3%红细胞与病毒悬液混合，2吸附1h以上；2)1000r/min离心10分钟，沉淀吸附病毒红细胞，弃上清，生理盐水洗涤2次；3)用1/50原体积磷酸缓冲液重悬红细胞沉淀，在37保温2-3h；4)1000r/min离心10分钟，上清即是浓缩病毒悬液。病毒的纯化与保存第17页葡聚糖柱层析法(熟悉)n葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成凝胶。n最常见是Sephadex系列，主要型号是G-10G-200，后面数字是凝胶吸水率(单位是mL/g干胶)乘以10。如SephadexG-50，表示吸水率是5mL/g干胶。病毒的纯化与保存第18页葡聚糖柱层析法(熟悉)nSephadex亲水性很好，在水中极易膨胀，不一样型号Sephadex吸水率不一样，它们孔穴大小和分离范围也不一样。数字越大，排阻极限越大，分离范围也越大。G-25分离范围1000-5000适合用于脱盐、肽与其它小分子分离；G-200分离范围5000-600000适合用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。病毒的纯化与保存第19页葡聚糖柱层析法n将初步浓缩材料，经过葡聚糖G150或G200柱层析，然后用0.020.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部搜集，测定280nm波优点OD值，滴定各部分效价，将含病毒各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯病毒。nNagano(1989年)用Sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。病毒的纯化与保存第20页葡聚糖柱层析法病毒的纯化与保存第21页病毒的纯化与保存第22页差速离心法(掌握)n原理：不一样大小和比重粒子有不一样沉降速度n适合分离沉降速度差异较大粒子n适合用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放病毒悬液中提纯病毒。n优点：能快速处理大量样品，作为病毒提纯精制第一步病毒的纯化与保存第23页n惯用方法(熟悉)：以低速(-3000r/min)及中速(10000r/min)离心20-30分钟去除较大宿主细胞碎片、污染细菌及其它较大杂质，再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。差速离心法病毒的纯化与保存第24页密度梯度离心n原理：将样品加在惰性密度梯度介质上进行超速离心，在一定离心力下把样品颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中，吸出目标颗粒所在介质层，从而到达分离纯化目标。n惯用介质为氯化铯CsCl、蔗糖病毒的纯化与保存第25页1040蔗糖密度梯度制备n首先配置好不一样百分比(w/v)蔗糖溶液，然后在离心管中先加入浓度最小（10%）溶液，然后用吸管加入浓度稍大溶液，注意，加时吸管要插入离心管底部，迟缓加入，务求界面分明。然后按上法依次分层加入其余各浓度蔗糖溶液，即可配成蔗糖梯度液。n将事先用更低密度蔗糖溶液（小于10%）悬浮样品轻轻加入10%蔗糖溶液表面，进行密度梯度离心即可。病毒的纯化与保存第26页梯度混合仪病毒的纯化与保存第27页等密度梯度离心(掌握)n原理：与密度梯度法相同，但不制备梯度介质，而是在样品中加入CsCl，离心过程中CsCl随离心力而下沉，形成连续密度梯度，样品中颗粒随其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯层中。n每毫升病毒悬液加1gCsCl，混匀，40000g离心24-36h。病毒的纯化与保存第28页病毒蛋白分离SDS-PAGEnPAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳Poly-AcrylamideGelElectrophoresis以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质一个惯用电泳技术。病毒的纯化与保存第29页PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳n聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。n催化聚合惯用方法：化学聚正当。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。病毒的纯化与保存第30页连续与不连续PAGEPAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异及有没有浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。病毒的纯化与保存第31页不连续PAGEn不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不一样孔径和不一样缓冲系统电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。因为浓缩胶堆积（浓缩）作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度凝胶上进行分离。n样品颗粒在电场中泳动不但有电荷效应，分子筛效应，还含有浓缩效应，因而其分离条带清楚度及分辨率均较连续电泳系统佳。病毒的纯化与保存第32页SDS-PAGEnSDS：十二烷基磺酸钠(重点)SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷差异，使各种蛋白质电荷质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。病毒的纯化与保存第33页SDS-PAGEn也称变性PAGEn通常采取不连续垂直型系统浓缩胶、分离胶病毒的纯化与保存第34页浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶病毒的纯化与保存第35页病毒的纯化与保存第36页病毒的纯化与保存第37页首次应用SDS-PAGE论文(了解)nLaemmliUK(1970).CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685.病毒的纯化与保存第38页SDS-PAGE试验步骤(熟悉)1、清洗、烘干、组装电泳器材病毒的纯化与保存第39页SDS-PAGE试验步骤2、1%琼脂封底病毒的纯化与保存第40页SDS-PAGE试验步骤3、配制分离胶病毒的纯化与保存第41页SDS-PAGE试验步骤4、灌注分离胶灌注完后，加水覆盖隔绝空气，同时可使界面平整普通20-30分钟凝固病毒的纯化与保存第42页SDS-PAGE试验步骤5、配制、灌注浓缩胶，插上梳子病毒的纯化与保存第43页SDS-PAGE试验步骤5、往电泳槽加电泳缓冲液，上样2上样缓冲液(样品溶解液 Loading Buffer)：SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚蓝，Tris-HCl缓冲溶液。蛋白样品与上样缓冲液1:1混合，沸水浴3分钟，离心，上样其中一个上样孔：蛋白分子量标准病毒的纯化与保存第44页n电泳缓冲液(电极缓冲液)包含SDSn普通配制成10或5SDS-PAGE试验步骤6、连接电源，电泳开始病毒的纯化与保存第45页SDS-PAGE试验步骤7、电泳结束，剥胶，染色，脱色染色液：考马斯亮蓝；银染法用硝酸银脱色液：甲醇/异丙醇+醋酸病毒的纯化与保存第46页按下式计算相对迁移率：每个蛋白标准分子量对数对它相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白迁移率即可测出其分子量，这么标难曲线只对同一块凝胶上样品分子量测定才含有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝区带中心距加样端距离cm 相对迁移率8、蛋白相对分子质量测定(重点)病毒的纯化与保存第47页 当蛋白质分子量在15,000200,000之间时，样品迁移率与其分子量对数呈线性关系。符合以下方程式：Lg MW =b m R +K 其中，MW 为蛋白质分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 所以经过已知分子量蛋白与未知蛋白比较，就能够得出未知蛋白分子量病毒的纯化与保存第48页SDS-PAGE试验步骤8、蛋白相对分子质量测定病毒的纯化与保存第49页注意问题 蛋白质电泳 惯用SDS-PAGE：单一亚基组成蛋白质 非变性PAGE：多个不一样亚基组成蛋白质 未聚合聚丙烯酰胺含有神经毒性，未聚合聚丙烯酰胺含有神经毒性，操作时要戴手套操作时要戴手套病毒的纯化与保存第50页WesternBlot蛋白质判定nSouthernBlot：DNAnNorthernBlot：RNAnWesternBlot：单向电泳后蛋白质印迹nEasternBlot：双向电泳后蛋白质印迹EdwinMellorSouthern病毒的纯化与保存第51页WesternBlot蛋白质判定n原理(重点掌握)：将SDS-PAGE上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，让第一抗体与膜上目标蛋白质抗原决定簇结合，然后用经过特定酶标识第二抗体结合第一抗体，加入酶显色底物即可检测目标蛋白条带存在是否。病毒的纯化与保存第52页WesternBlot步骤(熟悉)n1、SDS-PAGE电泳结束后，不染色，进行转膜，把SDS-PAGE凝胶上蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝胶和膜放置方向)病毒的纯化与保存第53页WesternBlot步骤2、膜染色(丽春红、氨基黑)判断凝胶上蛋白是否已经转移到膜上；统计蛋白分子量标准/样品位置；病毒的纯化与保存第54页WesternBlot步骤n3、磷酸缓冲液漂洗，进行膜脱色n4、膜封闭 封闭是用高浓度无关蛋白质封闭膜上未被占据表面，使抗体仅仅只能跟特异蛋白质结合而不是和膜结合。惯用封闭液有牛血清白蛋白BSA，脱脂奶粉等，普通用脱脂奶粉。将膜浸没于封闭液中迟缓摇荡一小时。病毒的纯化与保存第55页WesternBlot步骤n5、结合一抗(与目标蛋白结合)将膜转移到含一抗封闭液中，室温下轻摇孵育一小时。缓冲液洗涤三次6、一抗与二抗结合二抗是一抗抗体假如一抗是经过免疫兔子制备，即选择抗兔二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。缓冲液洗涤三次病毒的纯化与保存第56页WesternBlot步骤n7、显色(1)生物素-亲合素系统 生物素(biotin)标识二抗，生物素轻易与亲和素(avidin)结合,而亲和素事先已进行酶标识，如过氧化物酶，则形成 生物素-亲和素-过氧化物酶复合物 加入底物，即可显色病毒的纯化与保存第57页病毒的纯化与保存第58页WesternBlot步骤n7、显色(2)辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)HRP经过碘酸钠氧化而标识到二抗，显色底物：二氨基联苯胺（DAB）、氯萘酚和氨乙基咔唑等。病毒的纯化与保存第59页病毒保留(掌握)n1、低温及超低温保留法低温(-20-60)、超低温(-70以下)冰箱 液氮罐(-150-196)温度越低，保留时间越长；惯用保护剂：脱脂牛奶、5%蔗糖、血清 用保护剂配制病毒悬液或与病毒悬液混合病毒的纯化与保存第60页病毒保留n2、冷冻干燥保留原理：微生物悬液冷冻后，在真空中使水分由固体直接升华为气体，在低温、干燥和缺氧环境下，微生物生长和代谢暂时停顿，所以保留期较长，便于运输。病毒的纯化与保存第61页病毒保留n2、冷冻干燥保留保护剂：脱脂牛奶或血清保护剂作用原理：在冷冻干燥脱水过程中稳定病毒结构，预防病毒受冷冻或干燥而造成损伤。病毒的纯化与保存第62页2、冷冻干燥保留步骤n(1)准备安瓿管(高压灭菌后备用)病毒的纯化与保存第63页2、冷冻干燥保留步骤n(2)制备保护剂：脱脂牛奶取市售新鲜、清洁、无抗生素污染牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在110下灭菌15分钟，冷却后备用。病毒的纯化与保存第64页2、冷冻干燥保留步骤n(3)制备病毒悬液n(4)分装、预冻n(5)真空干燥抽真空前，样品必须处于冷冻状态n(6)封管病毒的纯化与保存第65页小结n掌握：聚乙二醇(PEG)浓缩法、差速离心法、密度梯度法分离病毒原理以及特点；SDS-PAGE原理以及蛋白相对分子质量测定；WesternBlot原理；常见病毒保留方法。n熟悉：病毒纯化标准、其它病毒分离方法原理、SDS-PAGE和WesternBlot主要步骤；病毒的纯化与保存第66页