线粒体功能及其相关毒性作用.pptx

线粒体及其相关毒性作用高度动态细胞器：线粒体大小、数量和分布反应了细胞对能量需求。线粒体基本结构线粒体外膜外膜上分布有孔蛋白（porin）组成桶装通道，直径2-3nm，当孔蛋白通道完全打开时，能够经过相对分子质量高达5000分子。ATP、NAD、辅酶A等相对分子质量小于1000物质均可自由经过外膜。所以，外膜通透性很高，膜间空间中离子环境几乎与胞质相同。线粒体功能及其相关毒性作用第1页线粒体内膜内膜含有很高蛋白质/脂质比，缺乏胆固醇，富含心磷脂。内膜含有极高不透性，所以限制了全部分子和离子自由经过，是质子电化学梯度建立以及ATP合成所必须。线粒体内膜上蛋白主要执行三种功效：1）电子传递链；2）ATP合成；3）转运蛋白。线粒体功能及其相关毒性作用第2页线粒体膜间隙膜间隙宽度通常为6-8nm，在呼吸活跃时，膜间隙可显著扩大。含有可溶性酶类、底物以及辅助因子。其含有腺苷酸激酶能够催化ATP分子末端磷酸基团转移到AMP，生成ADP。线粒体基质线粒体基质富含可溶性蛋白胶状物，含有稳定pH和渗透压。含有催化三羧酸循环、脂肪酸氧化和氨基酸降解相关酶类。含有DNA、RNA、核糖体。线粒体功能及其相关毒性作用第3页 线粒体分离外膜磷脂合成脂肪酸去饱和化脂肪酸链延伸标志酶：单胺氧化酶内膜电子传递氧化磷酸化代谢中间物转运标志酶：细胞色素氧化酶基质丙酮酸氧化三羧酸循环脂肪酸氧化DNA复制、RNA转录蛋白质翻译标志酶：苹果酸脱氢酶膜间空间核苷酸磷酸化标志酶：腺苷激酶线粒体功能及其相关毒性作用第4页线粒体产能（ATP）示意图线粒体功能及其相关毒性作用第5页6糖糖丙酮酸丙酮酸脂肪脂肪脂肪酸脂肪酸CoA三羧酸循环三羧酸循环TCANADH或或FADH2电子传递到电子传递到氧生成水氧生成水形成质子电化形成质子电化学梯度学梯度ATP合成酶合成酶合成合成ATP线粒体内膜丙酮酸载体线粒体功能及其相关毒性作用第6页 线粒体是糖类、脂类和蛋白质最终氧化释能场所，TCA是物质氧化最终共同路径，氧化磷酸化是生物体取得能量主要路径。（一）线粒体中氧化代谢线粒体功能及其相关毒性作用第7页在电子传递过程中，接收和释放电子分子和原子被称为电子载体。由电子载体组成电子传递序列被称为电子传递链。五种类型电子载体：黄素蛋白、细胞色素、泛醌、铁硫蛋白和铜原子。除泛醌外，其它氧化还原中心都是与蛋白质相连辅基。呼吸链中电子载体有严格排列次序和方向，按氧化还原电位由低向高排列(NAD+/NADH最低，O2/H2O最高）。（二）电子传递链与电子传递线粒体功能及其相关毒性作用第8页9线粒体功能及其相关毒性作用第9页电子传递复合物，组成两种呼吸链：NADH呼吸链,FADH2呼吸链，电子传递链各组分在线粒体内膜上不对称分布。电子传递复合物线粒体功能及其相关毒性作用第10页复合物：NADH-CoQ还原酶（既是电子传递体又是质子移位体）组成：含42个蛋白亚基，最少6个Fe-S中心和1个黄素蛋白。作用：催化1对电子从NADH辅酶Q；泵出4 H+复合物：琥珀酸-CoQ还原酶（是电子传递体而非质子移位体）组成：含FAD辅基，2Fe-S中心，作用：催化1对低能电子FADFe-S辅酶Q(无H+泵出)复合物：CoQ-Cyt c还原酶（既是电子传递体又是质子移位体）组成：包含1个cyt c1、1个cyt b、1个Fe-S蛋白作用：催化电子从UQH2cyt c；泵出4 H+（2个来自UQ，2个来自基质）复合物：细胞色素c氧化酶（既是电子传递体又是质子移位体）组成：二聚体，每一单体含13个亚基，三维构象，cyt a,cyt a3,Cu,Fe 作用：催化电子从cyt c分子O2 形成水，2 H+泵出，2 H+参加形成水线粒体功能及其相关毒性作用第11页线粒体负担能量转换实质上就是把H+跨膜电位差和质子浓度梯度形成质子驱动力转换成ATP分子中高能磷酸键。TCA循环提供质子驱动力和高能电子是线粒体合成ATP基本能源。（三）质子转移与驱动力形成Ca2+调控线粒体功能及其相关毒性作用第12页线粒体功能及其相关毒性作用第13页氧化(电子传递、放能)与磷酸化(ADP+Pi，储能)同时进行，亲密耦联，分别由两个不一样结构体系实现。用超声波将线粒体破碎，线粒体内膜碎片可自然卷成颗粒朝外小膜泡，这种小膜泡称为亚线粒体小泡或亚线粒体颗粒。（四）ATP形成机制氧化磷酸化ATP合酶结构与组成ATP合酶是最终生成ATP装置。它分布于细菌质膜、线粒体内膜和叶绿体类囊体膜上。ATP合酶分子由球形头部和基部组成。线粒体功能及其相关毒性作用第14页 线粒体主要功效是高效地将有机物中储存能量转换为细胞生命活动直接能源ATP；与细胞中氧自由基生成，调整细胞氧化还原电位和信号转导、调控细胞凋亡、细胞内各种离子跨膜转运及电解质稳态平衡。线粒体功效小结线粒体功能及其相关毒性作用第15页 线粒体损伤线粒体渗透转变细胞内Ca2+异常ATP合成酶异常自由基产生和积累原发性代谢紊乱相互作用线粒体DNA异常线粒体功能及其相关毒性作用第16页线粒体渗透转变(MPT)1.线粒体摄取Ca2+、渗透势下降，ROS和RNS生成、ATP耗竭和原发性代谢紊乱都会引发线粒体内膜通透性（MPT）突然升高。2.MPT是一个跨越线粒体内外膜间蛋白质孔（巨通道）开放引发。这个通道对于分子质量小于1500溶质可通透，它开放使质子自由内流进入，引发膜电位快速和完全耗散、ATP合成中止以及水渗透内流，造成线粒体膨胀，已经蓄积于基质间隙Ca2+经过此孔大量流出，进入细胞质。这么线粒体不但不能合成ATP，而且因为内膜去极化迫使ATP合酶以相反模式（水解ATP）将余留能源全部耗尽。假如细胞中大部分或全部线粒体都发生渗透转变，细胞溶解坏死将到达巅峰。线粒体功能及其相关毒性作用第17页在动物细胞线粒体膜上存在渗透性转换孔（PTP），当PTP开放时，线粒体内膜对中低分子量化合物渗透性会突然增加，从而造成线粒体基质中分子量小于1.5kD游离物质渗透进入膜间空间，这个过程称为线粒体渗透性转换（mitochondrion permeability transition,MPT）。线粒体功能及其相关毒性作用第18页细胞内钙库细胞内储存Ca2+库包含肌质网、线粒体，负责肌细胞细胞质中钙离子调整，心肌细胞去极化时释放钙离子，复极化时摄取钙离子。心衰时，肌质网功效障碍原因之一是能量缺乏，ATP依赖Ca2+泵功效降低，造成心肌复极化时不能有效摄取钙离子，去极化时又不能及时释放钙离子。线粒体在正常情况下能够摄取细胞总Ca2+量20%，这与线粒体中生物氧化酶功效相关，在心衰出现时，细胞内pH改变影响线粒体内Ca2+稳态，使线粒体摄取钙离子增多，当Ca2+超载时，引发线粒体功效障碍。19线粒体功能及其相关毒性作用第19页Ca2+浓度连续升高1.高血压：Ca2+释放增加使更多钙离子进入平滑肌细胞，同时还促进了细胞内储存Ca2+释放，细胞内储存钙释放再加上细胞外钙离子内流可引发血管平滑肌收缩，且影响细胞生长，造成血管肥大，造成结构性和功效性外周阻力增高，血压增高。2.帕金森病：在正常情况下，神经元中持久钙离子信号转到影响是受到线粒体Ca2+释放和累积调整，定位于线粒体内膜上呼吸链蛋白复合体，从线粒体机制排出质子，产生一个150v-180mv（内侧负）线粒体膜电位，这个电化学梯度驱动了ATP合成而且提供了Ca2+在线粒体内侧转运。在PD病人中，线粒体功效异常使钙离子超载，造成多巴胺神经元愈加兴奋。线粒体功能及其相关毒性作用第20页ATP合酶工作特点：可逆性复合酶ATP耗竭1.主要能量物质，参加生物合成以及磷酸化、肌肉收缩、细胞骨架聚合、细胞运动、细胞分裂、膜泡转运。2.质膜和内质网膜上钙泵、溶酶体膜质子泵等各种离子泵功效失常。3.线粒体功效异常：氧化磷酸化过程受到损害，ADP堆积，ATP耗竭，细胞内酸中毒、离子堆积，细胞容量调整失控，最终造成细胞膜不可逆损伤。线粒体功能及其相关毒性作用第21页自由基产生自由基：自由基是指能够独立存在含有一个或者多个不配对电子任何核素（原子、原子团、分子，species），含有很高化学活性。在生物体中最主要自由基是活性氧（ROS,reactive xoxygen species），尤其是超氧阴离子（O2-）和羟自由基（OH.）以及分子氧，自由基极易给出电子或者俘获电子。分类：能够分为氧自由基和脂自由基。从活性氧角度能够分成氧自由基、过氧化物（过氧化氢、氢过氧化物）、激发态氧。22线粒体功能及其相关毒性作用第22页自由基产生线粒体：是氧自由基生成主要场所之一，作为线粒体正常代谢副产品，自由基在线粒体内会不停积累产生。在氧化磷酸化过程中，有1%-5%氧会逃离正常细胞色素氧化酶催化过程，经过非催化形式，逐步非共价还原形成自由基，主要是超氧阴离子和过氧化氢，在线粒体呼吸链中，还原性CoQ、黄素蛋白、细胞色素C等均可产生超氧阴离子。23线粒体功能及其相关毒性作用第23页自由基正常功效代谢储能：体内约17%自由基是在氧代谢过程中产生。如ATP合成。转化排泄：体内代谢产物、外源性药品及毒物从体内去除是，均需在加单氧酶系作用下经过羟化反应，经尿或者胆汁排出。防御杀菌和抗肿瘤：吞噬细胞在吞噬活动中被激活，耗氧量增加显著，即所谓呼吸暴发。所摄取氧大部分产生过氧化氢、超氧阴离子以杀灭微生物、寄生虫而且能够破坏癌细胞，深入氧化，能够消化被吞噬异物。阿霉素经过转化形成自由基破坏癌细胞DNA（同时损伤正常细胞）。24线粒体功能及其相关毒性作用第24页自由基损害作用对脂类作用：生物膜中不饱和脂肪酸受到自由基作用而转变成过氧化脂质，从而造成膜流动性改变，膜流动性下降造成细胞脆性增加、膜受体、离子通道异常，变形能力下降，出现动脉粥样硬化等，一样线粒体膜和溶酶体膜脂质过氧化反应也会出现相同后果，而且脂质过氧化会诱发新自由基产生。对蛋白质作用：会造成蛋白质交联、聚合和肽链断裂，也能够使蛋白质和脂类结合形成聚合物，是蛋白质丧失功效。25线粒体功能及其相关毒性作用第25页自由基损害作用对核酸作用：自由基作用于DNA，与碱基发生加成反应，造成对碱基修饰，从而引发基因突变；也能够引发DNA链断裂，以及染色体畸变和染色体断裂。对细胞外基质破坏：氧自由基能够使细胞外基质中胶原纤维胶原蛋白发生交联，使透明质酸降解，从而引发基质变得疏松，弹性下降，出现皱纹。心肌缺血再灌注：狗冠状动脉结扎-突然松开恢复灌流-室颤死亡。缺血为自由基形成提供了有利条件，再灌流则像是加入了催化剂使自由基瞬时大量生成。应预先给予自由基去除剂。26线粒体功能及其相关毒性作用第26页三种原发性代谢紊乱相互作用促进产生ROS/RNS线粒体功能及其相关毒性作用第27页 线粒体损伤在医学上，由线粒体功效障碍引发疾病称为线粒体病。线粒体疾病都为母系遗传。外界环境原因对线粒体功效影响：克山病。细胞中线粒体数量随年纪增加而降低，而体积却随年纪增加而增大。人类线粒体疾病其原发机制都是mtDNA异常（突变、缺失、重排）引发遗传性疾病，表现为电子传递酶系和氧化磷酸化酶系异常。诱导原因之一为氧自由基，机体衰老即退行性疾病时，Mn-SOD活性降低，氧自由基就积累在线粒体中，从而造成各种疾病发生。氧自由基造成mtDNA氧化损伤积累量可比核DNA高16倍，同时mtDNA不含有核基因修复装置，所以mtDNA发生突变频率比细胞核高10倍以上。线粒体功能及其相关毒性作用第28页 线粒体损伤检测线粒体膜势能检测1.线粒体在细胞凋亡过程中起着枢纽作用，各种细胞凋亡刺激因子均可诱导不一样细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体瓦解，则细胞凋亡不可逆转。2.线粒体跨膜电位存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光增强或减弱说明线粒体内膜电负性增高或降低。线粒体功能及其相关毒性作用第29页线粒体膜势能检测1.线粒体在细胞凋亡过程中起着枢纽作用，各种细胞凋亡刺激因子均可诱导不一样细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体瓦解，则细胞凋亡不可逆转。2.线粒体跨膜电位存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光增强或减弱说明线粒体内膜电负性增高或降低。3.JC-1是一个广泛用于检测线粒体膜电位理想荧光探。能够检测细胞、组织或纯化线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，能够产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，能够产生绿色荧光。这么就能够非常方便地经过荧光颜色转变来检测线粒体膜电位改变。惯用红绿荧光相对百分比来衡量线粒体去极化比例。线粒体功能及其相关毒性作用第30页线粒体膜势能检测4.JC-1单体最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。实际观察时，使用常规观察红色荧光和绿色荧光设置即可。通常能够CCCP作为诱导线粒体膜电位下降阳性对照。5.线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期一个标志性事件。经过JC-1从红色荧光到绿色荧光转变能够很轻易地检测到细胞膜电位下降，同时也能够用JC-1从红色荧光到绿色荧光转变作为细胞凋亡早期一个检测指标。线粒体功能及其相关毒性作用第31页试验步骤及注意事项1.试验方法将正常培养细胞和诱导凋亡细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM)，37C平衡30min，流式细胞计检测细胞荧光强度。2.注意事项一直保持平衡染液中pH值一致性，因为pH值改变将影响膜电位。与染料到达平衡细胞悬液中假如含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料浓度，引发假去极化。线粒体功能及其相关毒性作用第32页