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生物分离技术 总复习
一、 生物分离工程（Bioseparation)：
对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，又称为下游加工过程（Downstream Processing）。

1. 微生物发酵液的特性
u 发酵产物浓度较低，处理体积量大；
u 各类细胞的颗粒小，相对密度与液相相差不大；
u 细胞含等固型物含水量大，可压缩性大；
u 液相粘度大，大多为非牛顿型流体；
u 产品生物活性不稳定；
u 动植物细胞不耐剪切。
2. 预处理的目的
u 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；
u 去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。
u 尽可能使产物转入便于后处理的一相中。
3. 发酵液预处理的方法
发酵液过滤特性的改变
① 降低液体粘度
② 调节悬浮液的pH值
③ 凝聚和絮凝
凝聚作用：在某些电解质作用下，使扩散双电层的排斥电位降低，使破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。
絮凝作用：在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生桥梁作用而使脚力形成粗大的絮凝团的过程。
④ 使用助滤剂
⑤ 加入反应剂
初步纯化
⑥ 高价无机离子的去除
⑦ 杂蛋白的去除
二、 固液分离工程及设备
1、过滤
2、离心与沉降
3、双水相萃取
4、扩张床吸附
1. 离心分离
v 离心过滤：转鼓周壁开孔，为过滤式转鼓，适合于固相含量较多，颗粒较粗的悬浮液分离
v 离心沉降：转鼓周壁无孔，为沉降式转鼓，适合于固相含量较少，颗粒较细的悬浮液
v 离心分离：转鼓周壁无孔，转数最高，适合于乳浊液的分离。
2. 碟片式离心机

3. 管式离心机

见计算题
三、 细胞破碎
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。（见计算题，渗透压， p39）
细胞破碎方法分类

四、 萃 取
利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。
1. 单级萃取过程的解析计算方法
u 假定传质处于平衡状态
有

y－萃取相中溶质的浓度
x－萃余相中溶质的浓度
由质量守恒定律：

由以上两式可得

其中萃取因子：
若P为萃取回收率
2. 多级萃取
u 是工业生产最常用的萃取流程
– 分离效率高
– 产品回收率高
– 溶剂用量少
见计算，多次萃取
3. 新型萃取技术
u 超临界萃取
利用流体在临界点附近某一区域内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变动这一特性而达到溶质分离的一项技术。密度和萃取能力接近液体，粘度扩散系数接近气体。
u 双水相萃取
当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。
u 反胶团萃取
五、 吸附与离子交换
1. 吸附
是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。
吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程
2. 常见的吸附类型及其主要特点

物理吸附
化学吸附
吸附作用力
分子间引力
化学键合力
选择性
较差
较高
所需活化能
低
高
吸附层
单层或多层
单层
达到平衡所需时间
快
慢
3. 工业用吸附剂

硅胶
活性氧化铝
活性炭
大孔吸附树脂
分子筛
4. 离子交换(ion exchange)
u 概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩和提纯的目的。
5. 离子交换树脂的结构单元
u 具有三维空间立体结构的网络骨架
u 联接在骨架上的活性基团（功能基团）
u 活性基团所带的相反电荷的活性离子 （可交换离子）

6. 主要的多糖基离子交换树脂
u 离子交换纤维素
树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类
特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高
常用的离子交换纤维素有：
甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素、二乙基氨基乙基纤维素
六、 色谱技术
色谱技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
按机理分，有以下几种：
– 吸附色谱——疏水色谱
– 分配色谱——正相（固极流非-极）与反相（固非流极-非）色谱
– 离子交换色谱
– 凝胶排阻色谱
将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经提及的差异，使不同分子量的组分得以分离的色谱方法（大的先流出）
– 亲和层析

七、 膜分离与电泳
u 膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。
膜分离技术的类型和定义 （板式，管式，螺旋卷式，中空纤维式）
u 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类：
微滤（MF）悬浮物固体
超滤（UF）大分子有机物，蛋白
纳滤 (NF) 有机酸，多糖，染料
反渗透（RO）无机盐
电渗析
强制膜分离
八、 电泳
u 电泳（Electrophoresis）是荷电物质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。
u 电泳分离技术是利用荷电物质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。
各类电泳的工作原理
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果.凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。
SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳
可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（1～100μg），但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确.
等电聚焦
是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。
双相电泳
是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图
九、 沉 析
u 沉析是利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程，也称为沉淀。
1. 沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：
（1） 盐析法；
蛋白质（酶）等生物大分子物质在高浓度中性盐存在下，溶解度降低而产生沉淀。
（2） 等电点沉淀法；
两性电解质在溶液PH处于等电点时， 分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水合膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度下降，析出沉淀的操作
（3） 有机溶剂沉淀法；
向水中加入一定亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。
（4）非离子型聚合物沉淀法；
（5）聚电解质沉淀法；
（6）高价金属离子沉淀法等。

2. 盐析过程
u 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：
– 无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
– 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
3. 盐析法
IgS=B-KI
– Ks分级盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度（盐浓度）进行盐析的方法；
– Β分级盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；
其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于进一步的纯化。
十、 结晶
u 结晶是新相生成的过程，是利用溶质之间溶解度的差别进行分离纯化的一种扩散分离操作，与沉淀的生成原理一致。
u 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶型。
1. 结晶的步骤
u 过饱和溶液的形成
u 晶核的形成
u 晶体生长
其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。
2. 饱和曲线和过饱和曲线

十一、 干燥
Ø 干燥(Drying)是利用热能除去浓缩悬浮液或结晶(沉淀)产品中湿分(水分或有机溶剂)的单元操作。
Ø 通常是生物产品分离的最后一步，因此干燥的质量直接影响产品的质量和价值。
1. 物料内水分的种类
物料与水分的结合方式：
u 化学结合水：水分与物料的离子型结合和结晶型分子结合（结晶水），结晶水的脱除必将引起晶体的崩溃；
u 物化结合水：包括吸附、渗透和结构水分，其中吸附水分结合力最强
u 机械结合水：毛细管水、湿润水分、孔隙水份
2. 平衡水分和自由水分
u 平衡水分：当一种物料与一定温度及湿度的空气接触时，物料势必会放出或吸收一定量的水分，物料的含水量会趋于一定值。此时，物料的含水量称为该空气状态下的平衡水分。平衡水分代表物料在一定空气状态下的干燥极限，即用热空气干燥法，平衡水分是不能去除的
u 自由水分：在干燥过程中能够除去的水分，是物料中超出平衡水分的部分
3. 干燥机理
Ø 在干燥过程中，当物料中水分表面汽化的速率小于内部扩散的速率时，称为表面汽化控制；
Ø 强化措施（对对流干燥而言） ：提高空气的温度，降低相对湿度，改善空气与物料的接触和流动情况，均有助于提高干燥速率。
Ø 当物料中水分表面汽化的速率大于内部扩散的速率，称为内部扩散控制。
Ø 强化措施：从改善内部扩散着手，如：减少物料厚度、使物料堆积疏松、搅拌或翻动物料、采用微波干燥等。

4. 恒速干燥阶段
u 湿物料表面为非结合水所湿润，物料表面温度是该空气状态下的湿球温度；
u 传热推动力（温度差）以及传质推动力（饱和蒸汽压差）是一个定值；干燥速率也是一个定值；
u 该阶段的干燥速率决定于物料表面水分汽化的速率、决定于水蒸气通过干燥表面扩散到气相主体的速率。因此，又称为表面汽化控制阶段。
u 此时的干燥速率几乎等于纯水的汽化速度，和物料湿含量、物料类别无关；
u 影响因子主要有：空气流速、空气湿度、空气温度等外部条件。
5. 降速干燥阶段
u 物料湿含量降至临界点以后，便进入降速干燥阶段。
u 在降速干燥阶段，非结合水被蒸发，继续进行干燥，只能蒸发结合水。
u 结合水的蒸气压恒低于同温下纯水的饱和蒸汽压，传质、传热推动力逐渐减小，干燥速率随之降低；
u 干燥空气的剩余能量被用于加热物料表面，物料表面温度逐渐升高，局部干燥。
u 在这一阶段，干燥速率取决于水分和蒸汽在物料内部的扩散速度。因此，亦称为内部扩散控制阶段，与外部条件关系不大。
u 主要影响因素为物料结构、形状和大小