DB6528∕T 191-2023 大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法(巴音郭楞蒙古自治州).pdf

ICS67.080.01CCS B 316528巴 音 郭 楞 蒙 古 自 治 州 地方标准DB 6528/T 1912023大蒜品种纯度 SSR 分子标记鉴定法Purity identification of garlic variety by SSR molecular markers2023-08-01 发布2023-08-15 实施巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局发 布DB 6528/T 1912023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15仪器设备和试剂.15.1仪器设备.25.2试剂.26方法步骤.26.1取样.26.2DNA 提取.26.3分子标记筛选.26.4PCR 扩展反应体系.36.5PCR 扩展反应程序.36.6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.47纯度计算.4附录 A（规范性）溶液配制.5A.1溶液配制.5附录 B（规范性）制胶及电泳过程.6B.1制胶及电泳过程.6参考文献.7DB 6528/T 1912023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。本文件主要起草人：李辉玲、杨晓莉、李守明、张建文、雷芙蓉、李保山、姚青青、王国洪、张国儒、赵靓、程裕伟、杨寒丽。本文件实施中的疑问，请咨询新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。对本文件的修改意见或建议，请反馈至新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局（库尔勒市石化大道64号）、新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院（新疆库尔勒市英下路巴州农科院）、自治区农科院园艺所（新疆乌鲁木齐市沙依巴克区新疆南昌路403号）、新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局（新疆库尔勒市延安路巴州市场监督管理局）。新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局 联系电话:[phone]；邮编：841000新疆巴郭楞蒙古自治州农业科学研究院 联系电话：[phone]；邮编：841000新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局 联系电话:[phone]；邮编：841000DB 6528/T 19120231大蒜品种纯度 SSR 分子标记鉴定法1范围本文件规定了大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定的原理、仪器设备和PCR反应相关试剂、方法步骤和纯度计算的要求。本文件适用于焉耆盆地巴音郭楞蒙古自治州大蒜品种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程 扦样GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.13.2聚合酶链式反应polymerase chain reaction利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。3.33.4SSR 标记simple sequence repeats由几个核苷酸（1个6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100 bp200 bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.53.6分子标记molecular marker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。3.73.8品种纯度variety purity品种在 SSR 分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的送检样品数占总检测样品数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。4原理SSR分布于大蒜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过6.0的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行大蒜品种纯度鉴定。5仪器设备和试剂DB 6528/T 191202325.1仪器设备PCR仪：垂直电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；核酸浓度测定仪；万分之一电子天平；组织研磨仪；微量加样器；台式高速离心机；紫外可见成像系统；医用胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；微波炉；冰箱；数码相机。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；溴酚蓝；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37）；Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（d NTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；DNA提取试剂盒；实验用水为双蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。相关溶液配制方法见附录A。6方法步骤6.1取样检测样品为大蒜鳞茎，应符合GB/T 3543.2的规定，质量应无腐烂、病斑，样品数量应不少于30头、60瓣，样品质量应不少于500 g。6.2DNA 提取在玻璃培养皿底部垫上一层厚度3 mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地摆放检测样品鳞茎，置于光照培养箱中。培养条件为光照强度3000 Lx条件下16 h、35 光照培养；无补光条件下8 h、28 暗培养。相对湿度70。待鳞茎长出鳞叶后备用。称取鳞叶200 mg左右用植物基因组DNA提取试剂盒内步骤提取DNA，所提取DNA浓度和纯度用核酸浓度检测仪测定，DNA完整性用DNA凝胶电泳检测。DNA溶液的OD 260/OD 280值应在1.72.0之间，或质量能符合检测要求。最终于20 冰箱中保存。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。6.3分子标记筛选宜选择编号1号8号引物为对品种纯度测定引物，见表1。进行PCR反应，扩增送检样品10份，筛选带型清晰，不同品种间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。推荐的8对引物仍未达到筛选效果的，可选择表1另外22对扩展辅助引物进行筛选。表 1纯度鉴定引物编号标记名称上游引物下游引物1GB-ASM-040CACAGCAACATGCACCATTGCCGGAACTCGATATT2GB-ASM-053ACAAGGTCGACATCGTTTGGGGCTTCACCTGAACACA3GB-ASM-072CACGCGAATCTTTCTTGGTGCAAAGCAATATGGCAG4GB-ASM-109GGTCTCCTCATCCACCGTGTGTGGGGCATGATTGAC5SSR7ATGCCGCCATTAAGCACTTGGCAAACAGGATTGGCACCAGDB 6528/T 19120233表1纯度鉴定引物（续）编号标记名称上游引物下游引物6SSR8AGGATGGATGGACTTGCAAGGTGTGGTATCTGTGCCTGCTG7SSR11AACCATTTGATGCAGTGCGGCTGGCGGTAGAATGCGTTTG8ACM0318TCCTCCTTCCAAACCACATCGATCAGAAACAGCAGCGTC9AMS25GCAACCTTTCCCCGAGAGGAGGGCAGTGTTAGCATTCC10ACM326AAACCAGCAACAACCAATGAAAATTGGAGAGCAGGCAAA11ACM065GCTCTGATGGAGGATGGTTCCTTGCCATCTTTGTCGGT12ACM046TCCTCGTCACCACCACAGCTGAAAGGGAGTAGCGGAG13AMS26TTGTCCAAGTAGTTGTGAATCTAATCAAAGCATAGTTG14ACM187GTACTCGGGCAGTGGAGGTAGGAGCTGTCCAAATGCTAGG15ASESSR-14CCCCTTCGGTTGTTTTTCTTCTGGGTACGGTCGTTATTGG16ASESSR-30GCAGCAGTAGAAGAACCTGCTAACCTCTTTTGGTGCCTCCT17ASESSR-83CCAAAGCTCCCATCTTCATCCGTCGGCTCTCTTATTTTGC18ASESSR-91GTTCTCCGTTGCGTCAATCGAATTTGCATCTTTCCCCTTC19ACM086GCGGATTGGATCATCAGATTTTCTTGATTCCTCCGTTTGG20Asa06GGGGTGTTACATTCTCCCCTACCGCCTGATTTTGCATTAG21Asa07CTCGGAACCAACCAGCATACCCAAACAAGGTAGGTCAGC22Asa08TGATTGAAACGAATCCCACAGGGGGTTACCTGAACCTGTTA23Asa10TTGTTGTTCTGCCATTTTGATCTAAGCCGAGAGAAA24Asa59CGCTTACTATGGGTGTGTGTCCAAGTGGGAGACTGTTGGAG25SSR18GAGCTGAAGCAAAACCAACTTCGTCAGTGTATGGGAAAAGAGCC26SSR32ATTCCTAAGAGAGGACGAAGGCCTACTTCTGTGTGGATAAACGGC27SSR34AACTCTTTTCAAGCTCTGGACGTCACAGGTAATGTCAAGGATGG28SSR37CTTTAGCTGTTTGGTCGTTGTGACCTCGGCTCTTAAATCATACG29SSR68ATGTTGGATACTTCAGGCAGGTCGTTTTCTGCTCTCCTTCTCTC30SSR86AGAAGAGGCTAAAGGCCAAAGTTTTCCATCATCCCCATCATC6.4PCR 扩展反应体系总体积10 l，包括稀释浓度为30 ng/l的检测样品DNA1 l、纯度测定加入正反引物各0.5 l、2Taq PCR Mix 5 l，其余用3 l dd H2O补充。6.5PCR 扩展反应程序DB 6528/T 1912023494 预变性3 min；94 变性30 s，不同引物最佳退火温度退火45 s，72 延伸90 s；30次循环的最后一个循环延伸设定为10 min，4 保存扩增产物。6.6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录B规定的方法，进行6非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7纯度计算以筛选出来的SSR分子标记为引物，扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的送检样品数占总检测样品数的百分率表示纯度，计算公式如下：C T 100(1)式中：C品种纯度，单位为。T供检样品总数，单位为个。N非本品种供检样品数，单位为个。DB 6528/T 19120235AA附录A附录B（规范性）附录C 溶液配制C.1溶液配制C.1.1引物稀释按照引物合成单说明先配制100 mol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5 mol/L的使用液。C.1.210过硫酸铵加过硫酸铵1 g溶解并定量稀释至10 mL，现配现用。C.1.35TBE缓冲液加Tris108 g，硼酸55 g，EDTA2H2ONa27.44 g溶解并定量稀释至2000 mL。C.1.430%聚丙烯酰胺胶溶液加丙烯酰胺 290 g，甲叉双丙烯酰胺 10 g 溶解并定量稀释至 1000 mL。C.1.56%聚丙烯酰胺胶用 5TBE 缓冲液 10 mL，30%聚丙烯酰胺胶溶液 13.5 mL，超纯水 25.5 mL，TEMED30 L，10%APS 750L 混合溶液。现用现配。C.1.60.5TBE 缓冲液用 5TBE 缓冲液 200 mL 稀释至 2 L。C.1.7固定液用无水乙醇 50 mL，冰乙酸 2.5 mL，稀释至 500 mL。现配现用。C.1.8渗透液加硝酸银 1 g 溶解并定量稀释至 400 mL。现配现用。C.1.9显色液加氢氧化钠 5.5 g 溶解并定量稀释至 400 mL，使用时加入甲醛 1.5 mL。现配现用。DB 6528/T 19120236BB附录D附录E（规范性）附录F 制胶及电泳过程F.1制胶及电泳过程F.1.1凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好。取5TBE缓冲液10mL，30聚丙烯酰胺胶溶液13.5 mL，超纯水25.5 mL，TEMED30 L，10APS 750 L，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1 h以上。F.1.2电泳用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入3 L的检测样品PCR产物。100 W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。F.1.3银染电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动3 min，双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s；渗透液中染色5 min，双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s，显色液中轻轻晃动直至带纹清晰，双蒸水漂洗1 min。DB 6528/T 19120237参考文献1Barboza K，Salinas M C，Acua C V，et alAssessment of genetic diversity and population structure ina garlic(Allium sativum L)germplasm collection varying in bulb content of pyruvate，phenolics，and solidsJScientia Horticulturae，2020，261：1089-1100.2Barboza K，Beretta V，Kozub P C，et alMicrosatellite analysis and marker development in garlic：distribution in EST sequence，genetic diversity analysis，and marker transferability across AlliaceaeJMolecular Genetics and Genomics，2018，293(5)：1091-1106.3Gimenez M D，Garca Lampasona SBefore-after analysis of genetic and epigenetic markers in garlic：a 13-year experimentJ Scientia Horticulturae，2018，240：23-28.