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植物组织培养中污染的分析及防控对策
生物工程系 生物技术及应用 1041班 邓雨琼 学号：200410777
指导老师 赵军
摘要：预防和控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文从通常污染的防控、内源性污染的防控、继代培养中污染防控、改善培养基的成分等方面，分析了怎样减少组织培养中出现的污染问题。从而达到降低生产成本；减少对植株造成伤害；减少接种源及污染的机率等目的。
关键词：植物组织培养；污染；预防控制；对策
The analysis and control of Contaminations in Tissue Culture of Plant
Abstract: The technical to avoid and control contaminations was important in tissue culture of plants. In this article, the factor was analysis to reduce rates and damages of the contaminations in plant tissue culture. Different measures (i.e. pretreatment of plant materials, surface sterilization and change the composition of culture medium) were used to control contaminations of endogenesis and exogenous origination. As a result, the costs and damages to the plants were significantly reduced.
Key words：Contamination; Elimination and Control; Measures; Plant tissue culture
污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象[1]。它是影响植物组织培养的一个重要因素，它通常会导致培养失败造成很大的损失。植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，但在组织培养中通常会出现不同程度的污染，因此在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加引起组培苗成本的提高，造成很大的经济损失，并对植株造成伤害，增加接种源及污染机率。因此,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。
1 污染的类型及原因
1．1通常污染
主要是外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染。
1.1.1症状与来源
在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘所致；有时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的。
1．2 内源性污染
内源菌包括真菌和细菌。在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。许多植物表面或大气中生存的微生物，可经由植物自然的开口或伤口进入植物内部，而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌，可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部，使植物感染病原菌。
1.2.1内源性污染的种类
从已有报道看，被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种，有的还到百种之多，其主要出现在热带植物组织中[2]。
1.2.2内源性污染的症状和危害性
在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2~3d就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。而在外植体
培养后3~5d内并未发现细菌污染，以后则相继出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。
在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，如不仔细观察很容易忽视，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它。
内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率降低，培养物生长减慢，玻璃化苗增多等。在后期导致试管苗移栽困难或死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异[3]。
2 污染所造成对组织培养生产的影响
2．1 生产成本的提高 如造成人力、物力的浪费。
2．2 对植株造成伤害 如降低了植株的生命活力；影响其繁殖系数减少增殖倍数；降低商品苗的品质。
2．3增加接种源及污染的机率 如真菌污染的灭菌不当会造成空气污染，从而增加接种源污染的机率。
3 通常污染的防控对策
3.1 操作污染和环境污染
操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。此类污染可通过如下措施加以克服：
3.1.1 无菌操作室及培养室的灭菌
每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外灯照射20~30min。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高可以用抽湿机除湿。接种结束后，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。
3.1.2 无菌操作和无菌操作技术
3.1.2.1 器皿与金属器械的灭菌
玻璃器皿的灭菌：可采用湿热灭菌法，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌器中进行高温高压灭菌，灭菌时间可长到25~30min。也可采用干热灭菌法，即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌；还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌。
金属器械的灭菌：一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上灼烧灭菌。这一步在无菌操作中有要反复进行。
3.1.2.2 布质制品的灭菌
工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。采用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品放人高压灭菌器中在压力0.11~0.12Mpa，温度121℃下灭菌20~30min。
3.1.2.3 操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行
在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。
3.2 外植体的消毒
3.2.1用茎尖作外植体时，要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样接种。
3.2.2 对污染严重的外植体，可以在培养基中加入杀菌剂。也可在菌类长入组织内部时，除去韧皮组织，只接种内部的分生组织可防止材料带菌。
3.2.3 外植体消毒常用药剂有：70 %～75%的酒精，0.3%~0.6%的次氯酸钠溶液和0.1 %的升汞溶液等。选用何种灭菌剂和灭菌时间根据不同情况及操作者的经验来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。先用75%的酒精棉花擦拭外植体材料再使用消毒药剂常能取得较好的消毒效果[4]。常用消毒剂的消毒效果比较见表1
表1 常用消毒剂的消毒效果比较[5]
消毒剂
使用浓度（%）
去除难易
消毒时间（min）
效果
次氯酸钙
9~10
易
5~30
很好
次氯酸钠
2
易
5~30
很好
漂白粉
饱和溶液
易
5~30
很好
过氧化氢
10~12
最易
5~15
好
升汞
0.1~1
较难
2~10
最好
酒精
70~75
易
几秒至几分钟
好
抗菌素
4~5(mg/L)
中
30~60
较好
3.3　检查培养容器是否存在问题
培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净，灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1~2d内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。
3.4 经常检查高压灭菌锅的灭菌质量
消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题[6]。
4 内源性污染的防控对策
4.1外植体的消毒
4.1.1预栽管理
一般来说，温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，为了能更好的降低污染率，可把室外栽培变为室内盆栽。要求：盆栽用土应使用不含有机质及经消毒的清洁土壤，尤其是要采集地下材料时，须用经过消毒蛭石等作栽培基质；施用无机肥，并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂。不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再采样接种。
4.1.2 外植体预处理
4.1.2.1促发新枝
将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。
4.1.2.2黄化处理
在无菌条件下，对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可减少污染。这方法曾用于成年栗树的枝条和仙客来实生苗[7]，减少了内生细菌的污染。
4.1.2.3热疗法及冷疗法
这种方法对对病毒较有效，但时间花费长。如热疗法处理时需6~12个星期温度在30~40℃。
4.1.2.4用抗生素进行处理
抗生素处理是目前常用的方法，如相思树的茎段灭菌时，用皂液刷洗和75%酒精杀菌后，转入不同的抗生素溶液中，在摇床上振荡过夜，再用75%酒精和0.1%升汞分别杀菌1min和15min，灭菌效果以抑制剂ANB1和ANB2的抑制效果较好，未污染的分别为63.3%和76.7%；成活率分别为60.0%和50.0%。见表2不同抗生素预处理对相思树茎段的影响
表2 不同抗生素预处理对相思树茎段的影响[8]
处理
接种茎段数
茎段数（未污染）
比例（%）
茎段数（成活）
比例（%）
ANB1
30
19
63.3
18
60.0
ANB2
30
23
76.7
15
50.0
头孢拉定
30
0
0.0
0
0.0
林肯霉素
30
7
23.2
5
16.7
庆大霉素
30
15
50.0
8
26.7
对照CK
30
2
6.7
1
3.3
4.1.3改进灭菌方法
4.1.3.1真空减压灭菌
它是利用真空减压抽走植物组织中的空气，使消毒剂容易侵入，从而增强杀菌效果。减压灭菌的效果明显优于常规灭菌，万年青茎段通过此法未污染率从常规的6.7%升到60.0%，成活率从常规的3.3%升到43.3%。见表3常规灭菌与真空减压来灭菌对万年青茎段防止效果比较
表3 常规灭菌与真空减压来灭菌对万年青茎段防止效果比较[9]
处理
接种茎段数
茎段数(未污染)
比例（%）
茎段数（成活）
比例（%）
常规灭菌
30
30
6.7
1
3.3
减压灭菌
30
30
60.0
13
43.3
4.1.3.2磁力搅拌、超声波振动法
为减少在外植体表面形成的气泡，在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振动的方法。如对月季、苹果的枝条，用0.1%升汞磁力搅拌15~20min，再用无菌水磁搅拌清洗，
污染率有所下降。
4.1.3.3灼烧灭菌
利用火烧的方法杀死外植体表面的所有微生物，以不伤害所要使用的组织或细胞为度。如将马蹄莲的根在95%的酒精中浸泡1min钟后，短时间内灼烧2次，比常规消毒的污染率降低60%。这种方法已用在绿色荚果、蒜的小鳞茎和银白杨芽的消毒。
4.1.3.4酸化培养基
除了欧文氏菌属外，大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。在紫苑属、鸢尾属、蔷薇属植物组织中，将培养基的PH5.8降到3.9~4.3，可防止大量的细菌污染。
4.1.3.5其他
多次消毒,如先用皂液对番木瓜侧芽浸泡20~30min，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5min，然后进行消毒处理，然后用4%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用无菌水洗，污染率降低为50%左右；使用混合消毒液是用几种消毒液(如多菌灵、抗坏血酸、柠檬酸、氯霉素等混合)对外植体时行处理，以降低污染率；在培养基中加入其他抑菌剂（如50%多菌灵、70%甲基托布津和25%甲霜灵）抑菌率也非常高[10]。
5 继代培养中污染的防控对策
初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由于操作不慎的原因，另即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。这类污染可从以下两个方面进行防止：
5.1扩大繁殖时应有合理程序
在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。
5.2可通过在培养基中加入抗菌剂来防止
对植物中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展，才在培养基上显现出来。可通过在培养基中添加抗菌素，降低PH值等措施防止和减少细菌等内生菌的污染 。如利用氨苄青霉素对迷你玫瑰的抑菌效果就很好，并且不会对不定芽的分化和植株造成明显的影响。见表4氨苄青霉素的抑菌效应及对不定芽分化的影响
表4氨苄青霉素的抑菌效应及对不定芽分化的影响[11]
抗菌素 抗菌素浓 接种苗 分化 不定芽分 接种苗 当代抑菌 次代抑 试管苗黄
类别 度（mg/L） 总数 苗数 化率（%） 总数 率（%） 菌率（%） 化率（%）
对照 0 40 126 315 — — — —
氨苄青 50 54 169 313 122 100 14.6 0
霉素 100 42 128 305 98 100 82.7 0
150 50 151 302 86 100 86.0 0
植物材料中的内生菌，也可采用反复茎尖培养或分生组织培养的方法来脱除。因致病菌在植物体内的分布不均，且是通过维管束传播的，故茎尖分生组织是不带菌的。因此，通过反复的茎尖培养和分生组织培养，既可脱内生菌又可脱毒[12]。
6 改善培养基
在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物的生长，或有单宁酸的存在也可达到抑制效果。培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因,去除有机物是减少污染的一条途径。据相关资料报导，除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等（保留肌醇）有机成分，经2~3代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少[13]。经试验，在罗汉果生根培养中，除去糖成分，在罗汉果苗生根时，可适当加强光照，同时在接种时，要适当地留一些小叶片，但不能让叶片接触到培养基，生根苗的生长都良好。由日本的古在丰树教授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制量的CO2气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低[14]。
7 对植物组织培养中污染的预防与控制进一步的思考
7.1目前组培苗污染所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。因此，在培养过程中要注意以下方面：
(1)污染表现明显的要将其选出并进行灭菌
(2)丢除病株，要知道病原菌才能从根本上加以消毒灭菌并进行重复分生培养
(3)只有无菌的植株可繁殖
7.2热疗处理时间花费长，需花6~12星期，今后可加强这方面探索。
7.3使用抗生素还存在一些缺点即：
(1)可能对人畜有害
(2)若是使用生长期较长的植物，微生物会产生抗药性
(3)容易出现没有针对微生物而使用不同的抗生素错误
(4)有些药物会对试管苗有不同程度的毒害（如造成叶片、叶柄及茎段的黄化），对不定芽分化和生根也有抑制。
因此，在利用抗生素进行处理时需注意以下几个方面：
(1)要知道抑制的微生物为何，再使用抗生素及对症下药 
(2)要决定最小抑制浓度，以降低成本 
(3)要确定抗生素不会对植物造成并害或突变
(4)确定抗生素在培养基上是否有作用 
(5)使用时，常因需要而多种混合或交替使用
(6)有些抗生素在某些国家是禁止使用，使用前必须做询问此药剂是否合法使用[15]
相信随着技术的日趋完善这些问题也会得到解决，就目前而言在污染的预防和控制上，无论是通常污染还是内源性污染都需要从外植体的选择及消毒灭菌入手，尽可能的使材料不带菌；再在各环节中采取相应的有效措施（如改进消毒方法，改善培养基的成分等）。才能从根本上预防和控制污染，从而达到生产所需的目的。
参考文献
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星期二 17:59 .
致谢
本文是在赵军老师的精心指导下完成的。在此，向她表示忠心的感谢！本文从材料的收集到撰都是在老师和同学们的关心和鼓舞下顺利进行的。在这期间尽管老师很忙但她却仍然加班加点的为我修改论文，并且毫无保留的将自己的知识传授予我使我能够顺利的将本文完成。她无私的默默为我们操劳却无怨无悔的精神使我深受感动并且感染了我使我更加的钦佩她，更加的尊敬她。另外，在本文的修改中还得到了辜义洪老师的指导以及王丽老师在英文翻译方面的指导，在答辩过程中还得到了各位老师的指导，同学们也不亦乐乎的为我提供帮助，他们积极的为我查资料并相互检查错误共同提高。在此我忠心的向所有帮助过我的人表示感谢！
此外，我还要感谢我的父母，他们无论是在我的学习还是生活中都给予我最大的关怀并为我创造了条件，让我充满了动力使我能顺利的完成学业。在这里我借此机会向他们表达我心中真挚的谢意！
致谢人：邓雨琼
2006—11—24