线虫-董润.doc

线虫遗传学实验报告
生75 董润 2007030039
同组实验者：周梦宇
实验时间：2009年10月28日—12月22日
【实验目的】
确定突变的类型（性染色体连锁、常染色体连锁或常染色体不连锁）
对突变基因进行染色体定位
确定突变基因与标记基因的遗传距离

【实验原理】
线虫的形态和生活史
秀丽线虫（C. elegance）长约1mm，直径70μm，通体透明，有雄体和雌雄同体两种性别个体。
表1 线虫的形态和生活史

雌雄同体
雄体
形态特征
成虫肥大，有白斑；L3、L4幼虫腹侧即将发育为阴门的位置有半月形白斑。
瘦小，体长约为雌雄同体的2/3。其尾部的扇形交配囊可区别于雌雄同体。见图1。
染色体
2条X染色体，5对常染色体
1条X染色体，5对常染色体
生殖方式
产生精子和卵子，可以自体受精，也可以与雄性个体交配，后者优先。
只产生精子，与雌雄同体交配
后代
自体受精产生约250个子代，其中只有0.2%是雄性虫；与雄虫交配产生1000个以上的子代，其中雄虫占50%

生活史
在20℃条件下,从受精卵到成虫产卵的整个生活史约需3.5d。生长阶段分为L1-L4和成虫阶段。当条件不利时，L2幼虫可成为dauer幼虫，生存几个月，条件恢复后则蜕皮直接进入L4幼虫，可用于保种。见图2。

图1 秀丽线虫雌雄同体虫和雄虫的形态结构 上为雌雄同体，下为雄体。雄体的尾部扇区是其重要特征（D. Petter Snustad等，2003）。

图2 秀丽线虫的生活史（Lelend H等，2000）
线虫的繁育
线虫以微生物为食，实验中用大肠杆菌（OP50品系）喂养。雄性线虫的繁育是通过在同一平板饲养雄体和雌雄同体的线虫，使得后代中有50%是雄性。雌雄同体线虫的繁育是通过其自交而不断产生后代。实际操作过程中，可用灭菌后的小刀切下一小块琼脂，将其转移到新的平板上。保种的方法是使线虫在无食物，较低温（10℃）的环境下生存。
进行雄性线虫和雌雄同体交配时，一般将4-5条L4或成熟早期的雄虫，与2-3条L4或成熟早期的雌雄同体虫置于同一平板。为区别自交和雌雄交配的子代，可根据子代性状的，或只统计雄体。后者就要求在引入亲代雄虫时不能混有卵或幼虫。而且，统计子代雄体时，需将亲代雄体排除掉，这些亲代雄虫一般有3-4条，是雄虫中最衰老，体型最大的。如果需要用子代雄虫进行下一步交配，要选择L4或成熟早期的雄虫，而不能错取成亲代雄虫。如果需要子代雌雄同体进行下一步交配，要选择L4幼虫，因为成虫可能已与雄虫交配过。

操作方法
无菌操作必须在实验的全过程中进行。不可以用受到污染的培养基，若发现生长线虫的培养基被污染，需将线虫转接到干净的培养基上。
挑线虫的工具是镶在玻璃管一端的铂金丝，铂金丝尖端做成铲子状。条每条线虫之前均需要将铂金丝灼烧。使铂金丝尖端先接触菌毯，这可以沾上一些粘液，有利于挑虫。转移的过程必需快速，以免杀死线虫，同时不能划坏平板。转移线虫时还应注意不要混入其他不需要的幼虫或卵。
由于线虫会在平板上爬动，所以最可靠的计数方法是将数过的线虫移除。线虫个体可以用铂金丝挑出并烧弃。一般来说，计数是在20°C下培养4天之后进行的，因为此时所有F1代均为成虫，而较小的幼虫是再下一代。

实验一：确定突变类型（性染色体连锁、常染色体连锁或常染色体不连锁）
实验中提供了两种unc dpy双突变，可能为unc dpy在常染色体上且不连锁，unc dpy在常染色体上且连锁，或者一个突变位点在X染色体上。实验目的判断这两种双突变的类型。使两种双突变体分别与野生雄体杂交，产生F1代。若有一个突变位点位于X染色体，则F1代的雄虫均为突变个体；若两突变位点均位于常染色体上，则F1代均表现为野生性状。如果判断两突变位点均位于常染色体上，则使F1代雌雄同体自交，产生F2代。
P unc-unc-dpy-dpy- × unc+unc+dpy+dpy+

F1 unc+unc-dpy+dpy-

F2 若连锁，则双突变/突变>1/7
若不连锁，则双突变/突变≈1/7
为操作简便，在F2代中只统计双突变个体在突变个体中的比例，利用χ2检验假设：双突变个体数/突变个体数 = 1/7。

实验二：对突变基因（dpy）进行染色体定位
实验材料是某种dpy突变体，需要对其突变位点进行染色体定位。实验中利用到4种unc突变体，即unc作为标记基因分别位于1、3、4、5号染色体上。所以，我们需要获得基因型为unc+unc-dpy+dpy- 的雌雄同体虫，并使其自交，统计重组型个体数，判断两突变位点是否连锁。因为雄虫只有野生型，并且雌雄同体和雄虫交配才能产生子代雄虫，所以突变基因需要传给F1 代雄虫，并由F1代雄虫传给F2代雌雄同体。
P unc+unc+dpy-dpy- × unc+unc+dpy+dpy+

F1 unc+unc+dpy+dpy- × unc-unc-dpy+dpy+

F2 unc+unc-dpy+dpy- ：unc+unc-dpy+dpy+ = 1：1
获得F2 代后，我们需要unc+unc-dpy+dpy-个体，使其自交，统计双突变个体数。所以，每组取若干F2雌雄同体（理论上其中有一半是unc+unc-dpy+dpy-），分别自交，若F3代出现dpy个体，则该F2雌雄同体为unc+unc-dpy+dpy-个体。我们只统计出现dpy个体的平板：
F2 unc+unc-dpy+dpy-

F3 若在同一染色体上，则双突变/突变 ＜＜ 1/7
若不在同一染色体上，则双突变/突变≈1/7
利用χ2检验假设：双突变个体数/突变个体数 = 1/7。预期结果是3个组的F3代双突变个体数/突变个体数 = 1/7，1个组的F3代双突变个体数/突变个体数 ＜＜ 1/7。则这1个组unc基因标记的染色体即为dpy突变体的突变位点所在的染色体。

实验三：确定突变基因与标记基因的遗传距离
本实验是在确定dpy的染色体位置后进行的。如果利用上个实验中的F2代unc+unc-dpy+dpy-个体（unc和dpy连锁）自交，产生双突变的概率很小。若假设两位点的遗传距离是P=10%，则产生F3代双突变的概率为P2/4 = 2.5‰，这会给计数带来很大困难。
对于上个实验中F2代unc+unc-dpy+dpy-个体（unc和dpy连锁），仍假设两位点的遗传距离是P=10%，则自交产生的F3代中unc-unc-dpy+dpy-个体的概率为P/2 = 0.05。又因为F3代中unc-unc-dpy+dpy+个体约占1/4，所以unc-unc-dpy+dpy-个体约占表型为unc-dpy+个体的1/5（0.05×1/4）。
我们取若干上个实验中的F3代unc-dpy+雌雄同体虫（理论上其中有unc-unc-dpy+dpy-），分别自交，只取子代有双突变的组：
P unc-unc-dpy+dpy- （上一实验中F3代，连锁）

F1 unc-unc-dpy-dpy- × unc+unc+dpy+dpy+

F2 unc+unc-dpy+dpy-

F3 R =单突变个体数/所有个体数
P = 1-
假设两位点的遗传距离是P=10%，则R = P-P2/2 = 9.5%。如果照此假设，R值比较容易统计，只需对一个F2代的子代计数（所有个体数约为250），而且结果较准确。

【实验仪器、试剂和材料】
体视镜，picker，35mm培养皿，20℃恒温培养箱，10℃恒温培养箱，灭菌锅，超净台
胰蛋白胨，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，琼脂，CaCl2•2H2O，MgSO4•7H2O，KH2PO4，K2HPO4，胆固醇，水
OP50大肠杆菌
8种秀丽线虫：
unc突变体，雌雄同体，突变位点在1号染色体上；
unc突变体，雌雄同体，突变位点在3号染色体上；
unc突变体，雌雄同体，突变位点在4号染色体上；
unc突变体，雌雄同体，突变位点在5号染色体上；
dpy突变体，雌雄同体，突变位点未知；
双突1号，雌雄同体，突变类型未知；
双突2号，雌雄同体，突变类型未知；
野生型，雌雄同体虫和雄虫。

【实验步骤】
培养基配制
OP50大肠杆菌培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000ml。调pH至7.0。高压蒸汽灭菌，121℃，30min。
线虫生长培养基：
蛋白胨2.5g，琼脂17g，NaCl 3g，蒸馏水975ml。高压蒸汽灭菌，121℃，30min。冷却至55℃。
无菌条件下，加入1M CaCl2溶液1ml，5mg/ml胆固醇溶液1ml（不需灭菌），1M MgSO4溶液1ml，1M 磷酸钾缓冲液1ml。
无菌条件下，倒平板。室温下倒放1—2天，待水气退尽。铺菌，取100μl菌液于培养基上，用涂布棒推开菌液，菌液不可接触到平板边缘。室温下放置一晚或37℃下放置8h即可。

实验一：确定突变类型
11月6、7日，取1号、2号双突分别与野生型雄虫杂交；
11月10、12日，分别取F1代野生性状雌雄同体自交；
11月15日，20℃恒温培养箱出现故障，温度升至40℃，并维持几小时；
11月17—19日，F2 代仍未长成，或者数量过少。只统计1号双突F2代性状。
实验基本失败，分析见讨论部分。
重做：
11月20日，取1号、2号双突分别与野生型雄虫杂交；
11月23日，分别取F1代野生性状雌雄同体自交；
11月27日，统计F2代双突、unc、dpy个体数。

实验二：对突变基因dpy进行染色体定位
11月12日，取dpy突变体与野生型雄虫杂交；
11月15日，20℃恒温培养箱出现故障，温度升至40℃，并维持几小时；
11月19日，取F1代雄虫分别与1、3、4、5号unc突变体杂交；
11月23日，观察F2代，几乎均为unc突变体。
11月24日，取1、3、4、5号F2代野生性状雌雄同体自交，每板放一条虫，1、3、5号各6板，周颖组已判定dpy突变位点不在4号染色体上，故4号取2板；
11月26日，观察1、3、4号F2代野生性状雌雄同体自交，部分F2代错挑为雄虫，部分F2代雌雄同体死亡，其余F3代均为unc突变体，故重做1、3、4号F2代野生性状雌雄同体自交，各6板；
11月29日，观察1、4、5号F2代野生性状雌雄同体自交，部分F2代雌雄同体死亡，其余F3代均为unc突变体。
11月30日，统计3号F3代双突、unc、dpy个体数，取周颖组的1、5号F2代野生性状雌雄同体自交，已判定dpy突变位点不在4号染色体上，故未做4号F2代野生性状雌雄同体自交；
12月3日，统计1号F3代双突、unc、dpy个体数。5号部分F2代雌雄同体死亡，其余F3代均为unc突变体，未能统计F3代性状。判断dpy突变位点在1号染色体上。

实验三：确定突变基因与标记基因的遗传距离
12月3日，取实验二的1号F3代unc突变体雌雄同体自交，每板放一条虫，共25板；
12月6日，5个板中发现F4双突，取F4双突与野生雄虫杂交，取F4双突自交传代；
12月9日，取F5野生性状雌雄同体自交；
12月13日，统计F6代双突、unc、dpy、野生个体数。
12月13—22日，取F4双突自交后代与野生雄虫杂交，后代自交，统计双突、unc、dpy、野生个体数。

【实验结果与分析】
实验一：确定突变类型
统计F2代双突、unc、dpy个体数，如表2所示。
表2 实验一F2代双突、unc、dpy个体数统计结果
双突材料编号
性状
数量
双突数/突变数
1
双突
38
13.6%
Unc
120
Dpy
121
2
双突
35
76.1%
Unc
8
Dpy
3
F1代均为野生型，故两突变基因不在X染色体上。
预期结果为，若F2代双突个体数/突变个体数≈1/7，则两突变基因不连锁；若F2代双突个体数/突变个体数＞＞1/7，则两突变基因连锁。
根据实验结果判断1号双突的两突变基因不连锁，2号双突的两突变基因连锁。

实验二：对突变基因dpy进行染色体定位
统计F3代双突、unc、dpy个体数，如表3所示。
表3 实验二F3代双突、unc、dpy个体数统计结果
Unc突变位置
性状
数量
双突变/突变
1号染色体
双突
2
1.6%
Unc
63
Dpy
59
3号染色体
双突
12
17.9%
Unc
27
Dpy
28
4号染色体
（数据来自周颖组）
双突
3
9.4%
Unc
16
Dpy
13
5号染色体
（数据来自傅丽兰组）
双突
16
21.3%
Unc
23
Dpy
36
预期结果为，若F3代双突个体数/突变个体数＜＜1/7，则两突变基因在同一染色体上；若F3代双突个体数/突变个体数≈1/7，则两突变不在同一染色体上。
根据实验结果判断，dpy突变基因在1号染色体上，不在3、4、5号染色体上。

实验三：确定突变基因与标记基因的遗传距离
统计F6代双突、unc、dpy、野生个体数，并根据重组率计算unc和dpy基因的遗传距离，结果如表4所示。

表4 实验三F6代双突、unc、dpy、野生个体数统计结果及遗传距离计算
培养皿编号及计数者
性状
数量
重组率
R=单突/总个体数
遗传距离
P= 1-
1
董润
野生
327
7.8%
8.1%
Dpy
17
Unc
20
双突
112
2
董润
野生
333
9.3%
9.8%
Dpy
27
Unc
18
双突
104
3
董润
野生
196
7.5%
7.8%
Dpy
7
Unc
13
双突
50
4
周梦宇
野生
425
8.9%
9.4%
Dpy
24
Unc
28
双突
105
5
周梦宇
（舍）
野生
460
13.1%
13.8%
Dpy
49
Unc
38
双突
116
第5组数据中，由于对性状判断有误，将部分野生错计为unc，部分双突错计为dpy，导致重组率较大，遗传距离较大，故舍弃本组数据。1-4组数据较准确。
根据1—4组数据，计算出重组个体数 = 154，总个体数 = 1806，重组率R = 8.5%，遗传距离P = 8.9%。助教给出的遗传距离为9.0%，实验值与其相对偏差为1.1% 。

【讨论与总结】
准备工作：制备培养基
线虫遗传学实验是我们第一个从设计，准备，到各项操作都独立完成的实验，所以需要思考的问题和遇到的困难格外多。其中，制备培养基就是一大困难，因为从前都是助教配好试剂给我们用，我几乎不会去思考配制过程中的注意事项，所以在实验中吸取了不少教训。
第一次配制培养基时，我们手忙脚乱地配溶液、灭菌、倒板，但是培养基刚刚凝固，我就将其放入了4℃冰箱。正确的做法是将培养基放置在室温下1-2天，待水气褪尽才可放入冰箱。最终，培养基不能完全凝固，不能涂菌，全部培养基均废弃。
我们所配制的培养基中经常出现无色晶体，这些晶体有时数量极多，呈针叶状薄片，长约0.1—0.2mm。判断其为胆固醇晶体，原因可能是：胆固醇溶液放置过久（超过2周），溶剂（乙醇）挥发，胆固醇晶体析出；或者曾将胆固醇溶液放入冰箱，导致胆固醇结晶。实际上，胆固醇结晶对线虫生长影响不大。但最好注意胆固醇溶液应现配现用。
我们尝试过两种涂菌方法：用涂布棒蘸取菌液，再涂到培养基上；或者用移液器取100μl菌液于培养基上，再涂布。第一种方法速度较快，但菌液经过重复蘸取，增加了污染的机会，而且菌落密度较低，有时不能形成菌毯。第二种方法速度较慢，但污染机会较小，而且可以在较短时间内长出较厚的菌毯。
涂菌后的培养基若放置超过2周，则较易被杂菌污染。因为我们无菌操作的技术不熟练，很可能在培养基中引入杂菌，杂菌经过较长时间的培养，可能数量较多。

准备工作：练习挑虫
挑虫技术是贯穿实验始末的，对于实验进程而言尤其重要。实验开始前，我们利用dpy虫练习挑虫，遇到了几个困难：利用体视镜观察时，经常不能把picker准确地伸到视野中心，有时甚至需要到处移动picker，才能在视野中看到它；挑虫时，不能准确地挑起虫子，而且经常挑破培养基；放虫时，虫子经常不从picker上下来，而且常戳破培养基。
实验结束时，视野中找不到picker的问题已解决，挑虫和放虫的速度也可以控制在几秒钟，但划破培养基的事情仍偶尔发生。挑虫技术主要是熟练的问题，但是仍可以总结出一些经验：要想迅速将picker伸到视野中，需要记住握picker的手的位置，这样每次都将手放在同一位置，就比较容易找到picker；挑虫时，用picker在菌毯上蘸取细菌，然后把虫子粘起来的方法是可行的，这种方法不会划破培养基，而且可以快速安全地放虫；培养基被戳破的地方可以用picker将其抹平，减小其对爬虫造成的影响。

无菌操作
由于我们对于无菌操作不够重视，培养基上经常长出各种细菌和真菌，杂菌对线虫的活力影响很大，有时甚至会导致线虫死亡。例如，实验二需在每个平板上放一条F2代雌雄同体，进行自交。但是，提供F2的平板被污染，且挑虫时未注意无菌操作，导致部分放到新平板上的F2雌雄同体周围长出菌落，F2代雌雄同体被埋在菌落下，导致死亡。这是实验二屡次失败的重要原因。再如，需要辨别性状的实验步骤中，如果线虫吃了有毒的杂菌，野生型线虫的活力会受到影响，可能出现类似于unc的特征，影响对性状的判断。
对于picker，实验前后都应仔细烧一烧，挑虫后也应烧可能粘菌的地方（尤其是提供线虫的培养基被污染的时候），而且应注意尽量防止picker沾到培养基以外的地方。对于培养基，即将放虫的培养基应先在体视镜下观察是否染菌，培养基敞盖的时间应尽量短，而且应手和衣袖用尽量避免在敞盖的培养基上放移动（这一点很难做到，而且我认为这是造成培养基污染的重要原因）。在挑虫过程中设置一个“中板”，让线虫在“中板”上爬一爬，再挑到新的培养基上，这种方法可以在一定程度上缓解污染问题。实验后期，我们开始重视以上问题，污染的情况大为好转。

性状辨别
我在整个实验过程中一直补充着自己对四种性状的认识，再通过与同学不断交流，到最后才形成大概的判断标准。
表5 线虫性状判断标准
性状
体形
运动情况
其他
野生
较细长，雌雄同体成虫可能长得很大。
运动快，灵活，协调；如果用picker碰头，倒退自如。
较其他性状的虫子生长快。
Unc
比野生型细，雌雄同体成虫不会长得很大。
运动慢或不动，不灵活，不协调，常卷起；有些运动稍快，但不流畅，且动作大；如果用picker碰头，不能完成完整的倒退动作。
Unc雌雄同体的L4幼虫，腹部半月斑极不明显。
Dpy
短粗，雌雄同体成虫可能长得很大
运动较灵活，协调；身体后半部弯曲能力较差，常随上半身的运动而左右摇摆；如果用picker碰头，倒退自如；较老的成虫也运动自如。

双突
短粗，较dpy虫更短，雌雄同体成虫不会长得很大
运动慢或不动，不灵活，不协调，头尾常弯向同一方向；如果用picker碰头，不能完成完整的倒退动作；较老的成虫基本不能运动。
运动困难，所以雌雄同体产的卵会聚集在其身体周围。

虽然这些标准基本可以满足对性状的判断，但仍不排除有例外发生。区分野生和unc，或者dpy和双突的问题一直难以解决。
实验二需挑取野生性状的F2代雌雄同体，但是F1代unc自交产生了一部分unc后代，导致F2中野生虫与unc虫共存。我们当时分不清unc虫和野生虫，挑出的F2代几乎都是unc虫，加之F2野生虫中只有1/2的可能性是双杂合体，导致F3代基本没有获得预期的后代。实验几乎终止。
unc突变基因在不同染色体上表现出来的性状不尽相同，有的较强，有的较弱。观察1、3、4、5号unc虫可发现，3号unc虫卷曲的现象不明显。
实验三统计F6代性状时发现，一些虫子的体形介于dpy和野生之间。实验中将其记为dpy虫，但由于没有新培养基，不能将其挑出进行自交，所以我不确定这一判断是否正确。
实验三统计F6代性状时还发现，平板上unc虫和dpy虫的数量差距稍大。例如表4第2组数据，unc虫为18个，dpy虫为27个。理论上经过基因连锁交换，子代unc虫和dpy虫的数量相当。分析原因为性状判断有误，即把双突认作dpy，或把unc认作野生；另一原因可能是部分unc幼虫没有成活。

性别辨别
实验中多次出现将雄虫认作雌雄同体的情况。进行下一步杂交或自交时，需要挑取雌雄同体幼虫。但是，雄虫在幼虫阶段尾部扇形区仍不明显，所以经常将其判断为雌雄同体的幼虫。由此总结出，挑取雌雄同体幼虫时尽量找到腹部有明显半月形白斑的虫子，尽量不挑没有明显百斑的虫子。

杂交问题
线虫杂交时经常出现雌雄同体先自交产生部分后代，然后才出现杂交。自交后代有时会影响下一步对后代性状的判断。我们在做杂交时，一般放4-5条雄虫，1-2条雌虫。我认为可以考虑在关键的杂交步骤（比如实验二F1代unc+unc+dpy+dpy- × unc-unc-dpy+dpy+ ）多放一些雄虫，减少自交发生的机会。

高温对线虫的影响
实验一F1代unc+unc-dpy+dpy-自交过程中，20℃培养箱的温度曾升至40℃，并维持几小时。高温后线虫出现了一些变化：F1代自交产生的卵大部分没有孵化出幼虫，造成F2代数量极少；孵化出的幼虫一直没有长大，分析原因是培养基干燥导致大肠杆菌不生长，幼虫缺乏食物。我认为以上原因在一定程度上导致实验一中途失败。
另外，我们还发现高温后虫子的活力受到影响，野生型线虫运动减慢。而且随后发育成熟的野生型线虫中雄虫的比例高于50%，可能因为雌雄同体幼虫耐高温的能力较差，或者高温对配子或受精卵的遗传信息有影响，导致后代性别比例的变化。

【参考资料】
2009年秋季学期遗传学基础实验补充教材（线虫遗传学实验部分）
TCU Genetics Lab Manual, BIOL. 40142, SRING 2003, 1st edition, Page 13-25