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测定细菌生长曲线
生14 孙晓川
2011011983
一、实验目的：
1、了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时
2、学习液体培养基的配制以及接种方法
3、了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同
4、掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法

二、实验原理：
将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线。
单细胞生物发酵具有 4 个阶段，即调整期（迟滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定器）、死亡期（衰亡期）。
1） 调整期：
细菌从原菌落培养基上接入到新的培养基上时，一般并不是立即开始生长和繁殖，而是要经过几小时的适应后，才有新的子细胞产生。特别是从冰箱中取出的菌种，由于细菌体细胞原来一直处于休眠或半休眠状态，细胞中的各种酶系统要经过一段时间的诱导，使它们适应于新的环境后，才能进行正常的工作，也就是环境适应过程。在调整期间细胞并不繁殖，只是细胞的体积增大，原生质变为比较均匀，细胞内各种储藏物渐渐消失，生理活性、代谢机能开始活跃，随着就开始进行繁殖，并逐渐进入对数期。调整期的长短与菌种的遗传性、菌龄、接种时间、培养条件、新培养基的营养成分等有关。
2） 对数期
是细胞生长、繁殖最旺盛的时期。细胞经过前一段的诱导适应后，如果在各种条件均适宜、营养物也足够的情况下，就以最快的速度繁殖，所繁殖的总细胞增加可用 2n 来表示。
对数期的长短，主要取决于菌种的本性，其次是营养物浓度和培养条件。要厚的大量的细胞，在这个时期就要保证有适宜的环境条件和丰富的营养物供给。
3） 平衡期
当细胞的繁殖速度达到最高峰时，其细胞总数就不会再增加，这是由于上两阶段的糖类营养物质的消耗，代谢产物乙醇的积累记忆培养基的 pH 值、氧化还原电势的改变，对细胞产生了较大的抑制作用。这时，细胞总数将处于稳定状态，死亡细胞数和繁殖细胞数接近平衡。细菌处于平衡期的长短，主要取决于培养基中的营养物质浓度和代谢产物的抑制作用程度，但同时也受培养基中 pH、培养条件、菌种性能的影响。
4） 死亡期
进入平衡期后，如果再继续培养，细菌总数不再处于平衡，死亡细胞数逐渐增加，细胞的死亡速度超过繁殖速度。
生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。
测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值与对应的培养时间作图，
即可绘制出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌和死菌，因此所测得生长曲线的衰亡期不明显。
从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以 G 表示。其计算公式为：G=（t1-t2）/ [（lgW1-lgW2）/ lg2]
式中 t1 和 t2 为所取对数期两点的时间；W1 和 W2 分别为相应时间测得的细菌含量（g/L）或 OD。

三、实验仪器、材料和用具
1、实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支)培养箱, 摇床，722s分光光度计
2、实验材料:大肠杆菌，金黄色葡萄球菌液及大肠杆菌平板培养基(100mL/250mL三角瓶X10瓶/大组);牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基, 配方（for 1000mL）;牛肉粉3+蛋白胨10+NaCl 5+葡萄糖10(g/L), pH：7.2-7.62
3、实验用具:无菌1000ul吸头80个无菌5000ul吸头2个
比色皿9个 + 共用参比杯一个

四、实验步骤
1、准备菌种（实验前完成）：
将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37℃振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块；
2、接种：
1) 第一小组：
[1] 取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm；
[2] 取2.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm；
[3] 取4.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm；
2) 第二小组：
[4] 取某一环大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm；
[5] 取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，110rpm；
[6] 取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30℃，200rpm；
3) 第三小组：
[7] 取1.0 ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，37℃，200rpm；
[8] 取1.0 ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，37℃，110rpm；
[9] 取1.0 ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，30℃，200rpm；
3、测量

几点说明：
1. 每培养一小时取样一次（2.5h，3.5h加测一次），对照组测量起始pH，所有瓶子测量发酵7h结束测pH。
2. 取样时间假定为5分钟时间，由于没有在摇床上振荡而生长变慢，测量不计入生长时间。
3. 分光计使用具体步骤：取500ul培养液到2000ul蒸馏水中，以蒸馏水为对照，测OD600/420/620任选一波长；注意固定参比杯，不要调动波长旋钮；固定一台分光光度计；零小时也要测，把结果填入下表。
4. 不使用时，分光计盖子要打开。不要用手触摸塑料杯光面。注意放置的方向。每次测量前，注意完成调零。

五、实验结果
我们组选定的测量波长为600nm，具体测量结果如表1。

0h
1h
2h
2.5h
3h
3.5h
4h
5h
6h
7h
ph
1
-0.036
-0.047
0.028
0.089
0.15
0.216
0.283
0.336
0.353
0.334
4.6
2
-0.004
0.004
0.092
0.14
0.213
0.272
0.338
0.368
0.379
0.375
4.5
3
0.019
0.045
0.17
0.236
0.292
0.344
0.385
0.417
0.431
0.393
4.4
4
-0.036
-0.04
-0.02
0.016
0.056
0.107
0.88
0.3
0.328
0.328
6
5
-0.075
0.007
0.11
0.16
0.217
0.324
0.283

6
-0.117
-0.065
-0.011
0.016
0.065
0.131
0.201
0.323
0.381
0.427
6
7
-0.045
-0.049
0.011
0.075
0.119
0.192
0.244
0.383
0.411
0.442
6.5
8
-0.04
-0.036
0.036
0.09
0.158
0.279
0.357
0.402
0.423
0.431
6.5
9
-0.048
-0.005
-0.03
0.002
0.047
0.084
0.143
0.309
0.394
0.467
6
表1：发酵参数ODt记录
将上面的原始数据进行处理，得到ODt-OD0---t表：

0h
1h
2h
2.5h
3h
3.5h
4h
5h
6h
7h
ph
1
0
-0.011
0.064
0.125
0.186
0.252
0.319
0.372
0.389
0.37
4.6
2
0
0.008
0.096
0.144
0.217
0.276
0.342
0.372
0.383
0.379
4.5
3
0
0.026
0.151
0.217
0.273
0.325
0.366
0.398
0.412
0.374
4.4
4
0
-0.004
0.016
0.052
0.092
0.143
0.916
0.336
0.364
0.364
6
5
0
0.082
0.185
0.235
0.292
0.399
0.358

6
0
0.052
0.106
0.133
0.182
0.248
0.318
0.44
0.498
0.544
6
7
0
-0.004
0.056
0.12
0.164
0.237
0.289
0.428
0.456
0.487
6.5
8
0
0.004
0.076
0.13
0.198
0.319
0.397
0.442
0.463
0.471
6.5
9
0
0.043
0.018
0.05
0.095
0.132
0.191
0.357
0.442
0.515
6
表2：ODt-OD0---t
由表2可以画出每一瓶菌液的生长曲线，下面一一对其进行分析：
（用直线拟合的方法来计算代时）

[1] 1.0 ml大肠杆菌菌液，37℃，200rpm：
调整期：0h---1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
取2h到4h之间的点来计算代时G=53.1min

图1：取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm

[2] 2.0 ml大肠杆菌菌液，37℃，200rpm；

调整期：0h---1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
取1h和4h之间的点来计算代时G=35.1min

图2：取2.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm

[3] 2.0 ml大肠杆菌菌液，37℃，200rpm；

调整期：0h---1h
对数期：
1h---4h
之后为稳定期
取1h和4h之间的点来计算代时G=49.6min

图3：取4.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm

[4] 一环大肠杆菌菌液，37℃，200rpm；
调整期：0h---2h
对数期：2h---5h
之后为平衡期
取2h和5h之间的点来计算代时G=36.9min

图4：取一环大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200rpm
注：4h点数据偏差较大，不作考虑。

[5] 1.0 ml大肠杆菌菌液，37℃，110rpm；
调整期：极短
对数期：0h---4h
平衡期无法从图中估测出来
取1h和4h之间的点来计算代时
G=81.2min

图5：取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37℃，110rpm
注：4小时测量时，培养瓶被打碎，故后面的数据无法得到。另外，3.5h组数据偏差较大，不作考虑。

[6] 1.0 ml大肠杆菌菌液，30℃，110rpm；
调整期：0h---2.5h 对数期：2.5h---5h
之后为平衡期
取3h和5h之间的点来计算代时G=96.1min

图6：取1.0 ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30℃，110rpm

[7] 1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液，37℃，200rpm；
调整期：0h---2h
对数期：2h---5h
之后为稳定期
取2h和5h之间的点来计算代时G=65.0min

图7：取1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液接种到100ml培养基，37℃，200m

[8] 1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液，37℃，110rpm；
调整期：0h—1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
取2h和4h之间的点来计算代时G=49.5min

图8：取1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液接种到100ml培养基，37℃，110m

[9 1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液，30℃，200rpm；
调整期：0h---2h
对数期：2h---7h
预测之后为平衡期
取3h和6h之间的点来计算代时G=78.6min

图9：取1.0 ml金黄色葡萄球菌菌液接种到100ml培养基，30℃，200rpm

表3 不同发酵小组的发酵条件结果总结

No.
菌种
接种形式，
接种量
温 度
(℃）
转 速
(rpm)
生长曲线描述
代时
(min)
结束时
PH 值
1
大肠杆菌
1.0ml 菌液
37
200
调整期：0h---1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
53.1
4.6
2
大肠杆菌
2.0ml 菌液
37
200
调整期：0h---1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
35.1
4.5
3
大肠杆菌
4.0ml 菌液
37
200
调整期：0h---1h
对数期：1h---4h
之后为稳定期
49.6
4.4
4
大肠杆菌
一环
37
200
调整期：0h---2h
对数期：2h---5h
之后为平衡期
36.9
6
5
大肠杆菌
1.0ml 菌液
37
110
调整期：极短
对数期：0h---4h
平衡期无法从图中估测出来
81.2

6
大肠杆菌
1.0ml 菌液
30
200
调整期：0h---2.5h
对数期：2.5h---5h
之后为平衡期
96.1
6
7
金黄色
葡萄球菌
1.0ml 菌液
37
200
调整期：0h---2h
对数期：2h---5h
之后为稳定期
65.0
6.5
8
金黄色
葡萄球菌
1.0ml 菌液
37
110
调整期：0h—1h
对数期：1h---4h
之后为平衡期
49.5
6.5
9
金黄色
葡萄球菌
1.0ml 菌液
30
200
调整期：0h---2h
对数期：2h---7h
预测之后为平衡期
为稳定期
78.6
6

数

六、实验分析：
不同发酵条件对比讨论：
1）不同菌种：
比较1,7；5,8；6,9可知整体上，金黄色葡萄球菌的对数生长期要比大肠杆菌长一些.然而，由于两种细菌的浓度和最适生长环境都有所差异，因此这样的比较意义不大。
2）不同接种量：
可以通过比较1,2,3组（均接种大肠杆菌，分别为1ml，2ml和4ml）的实验结果来初步探究接种量对细菌生长的影响。

图10：不同接种量大肠杆菌（绿色为4ml，红色为2ml，蓝色为1ml）
从图中可以看出，不同接种量（在一定范围内）对细菌的整体生长情况影响较小。最后测出的pH值几乎相同，这再一次说明接种量的变化对细菌的整体生长情况影响较小。
理论上接种量大了之后，会使每个细菌分到的营养变少，同时更多的细菌代谢产物可能会对细菌的繁殖产生抑制作用，因此代时应该变长。然而，本次实验结果却是：2ml代时最短（35.1min），其次是4ml（49.6min），1ml代时最长（53.1min）。我觉得这可能是由1ml细菌组的测量误差较大造成的。

3）温度对细菌生长曲线的影响：
可以通过比较1,6或7,9两组的实验结果，来初步探究温度对细菌生长的影响。

图11：1ml大肠杆菌，200rpm，不同温度（蓝线为组1,37℃；红线为组6,30℃）

图12：1ml金黄色葡萄球菌，200rpm，不同温度（蓝线为组7,37℃；红线为组9,30℃）

从图11和图12可知，30℃时，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，稳定期的时间相对于37℃时，都要稍微长一些，对数期的时间则相对短些。这说明，37℃比30℃更适宜大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。另外，37℃时两种细菌的代时都要比30℃是短，进一步证明了37℃更适宜两种细菌生长。理论上，第7组的pH值应小于第9组（因为细菌生长过程中会产酸），但实验测得结果与理论不符。我觉得这很可能是因为同学在比较pH试纸的颜色时，出现了较大的偏差，造成了pH值测量的不准确。
4）转速对细菌生长曲线的影响：
可以通过比较1,5和7,8两组实验结果，来初步探究转速对细菌生长情况的影响。

图13：1ml大肠杆菌，37℃，不同转速（蓝线为组1,200rpm；红线为组5,110rpm）

由于第五组没有后面的数据，因此还不好比较两组的整体细菌生长情况。从代时上来看，200rpm时，大肠杆菌代时短。这与理论相符。大肠杆菌是兼性厌氧型细菌，更高的转速可以促进培养液溶氧，能提高细菌的繁殖速率。

图14：1ml金黄色葡萄球菌，37℃，不同转速（蓝线为组7,200rpm；红线为组8,110rpm）

由图14可知，转速对金黄色葡萄球菌的影响较小（两条线的许多部分几乎重合）。比较代时，我发现110rpm时，该细菌的繁殖速率较200rpm时要更快。这不符合预期结果。金黄色葡萄球菌需氧或是兼性厌氧，理论上转速加大，会使培养液中溶氧速率加快，进而促进其繁殖。我想这可能是因为我们在培养这两组细菌时，没能将其他变量控制得完全相同。而细菌的生长是受多重因素共同影响的，因此结果可能会出现与理论相违背的情况。
总的来说，本次实验中存在许多不准确的因素。如粗略地认为静置时，细菌并未繁殖；测吸光度时，培养液种细菌分布不均；测pH时，用试纸大致估计；并不能做到完全得灭菌，测量时间间隔不均匀等等。因此，这次实验只是让我们初步学习一下测细菌生长曲线的一种方法-----比浊法，最后测得的结果误差很大，并不能用来得出可信的结论。

七、思考题：
1. 计算出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杆菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基中对数生长期中的代时为什么比理论值长好多？
答：代时已经计算出来，分别取37℃的两种菌的最短代时：大肠杆菌：33.2min，金黄色葡萄球菌：50.3min。代时的理论值：大肠杆菌为18min，金黄色葡萄球菌为27~30min。计算出的代时长于理论值的原因有：
1）计算不准确： OD值测量可能并不准确（培养液并不均匀），而且对于对数期的曲线选择不同点来计算时，结果可能也会有比较大的差异。
2）实验中不能做到理想条件下的发酵。比如：发酵环境如溶氧，调pH就没有能够达到，培养基中的营养会不足。并且我们的无菌操作可能带入杂菌。
3）对于同一种细菌，不同状态的细菌生长代时也可能会不同。

2. 为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况？
答：细菌生长过程中，菌液浓度和整体菌液的混浊度成正比，所以可以根据分光光度计测得菌液的光密度，就可以了解细菌的浓度，并且由此做出曲线就可以表现处生长曲线，不过这个方法没有办法区分活菌和死菌，所以和真正的生长曲线不太吻合，主要体现在看不出衰亡期。

3. 生长曲线中为什么会有稳定期和衰退期？
答：细菌在对数期大幅度生长，引起营养物质消耗，且细菌自身也有代谢产物累积。所以细菌所处的环境对其越来越恶劣，不适于其生长。所以生长速度就会降低，同时死亡率上升，当二者速度达到一致时，就达到了稳定期，此时活菌数目最高，可以持续一定时间。之后菌体的生活环境更差了，菌体死亡的速度超过了产生活菌的速度，生长曲线就进入了衰退期。

4. 什么条件下接种为宜？液体种子比固体种子有什么优越性？答：选择对数期的细菌接种为宜。对数期的细菌的调整期比较短，可以很快地进入对数生长。液体种子分散均匀，可以很快地进行对数生长，比固体种子容易适应新的培养环境。

5. 根据实验结果，谈谈在工业上如何缩短发酵时间？
答：应该选择合适的菌来接种（如对数期的菌），并且接种量应该控制得较为合适，发酵的环境要适宜菌的生长。并且工业生产中还要不断输入新的培养液，或者是调节酸碱度等等，让发酵环境可以持续保持在适宜细菌生长的程度。

八、参考文献：
[1]陈金春，《微生物学实验指导》2007年版，清华大学出版社；