单倍体培养.pptx

1 1单 倍 体 培 养2 2 本章内容1.单倍体的概念及发生2.单倍体培养的应用3.花药培养4.花粉培养5.单倍体育种3 3一、单倍体的概念及发生（一）概念1单倍体（haploid）单倍体指具有配子染色体数目的个体单倍体指具有配子染色体数目的个体，即体细胞染色体数目为n。单倍体包括一倍单倍体一倍单倍体（monohaploid）和多倍单倍体（多倍单倍体（polyhaploid），前者起源于二倍体物种，后者起源于多倍体。2单倍体培养 将单倍体个体接种到人工培养基上培养，并获将单倍体个体接种到人工培养基上培养，并获得再生单倍体植株得再生单倍体植株。包括花药培养花药培养、小孢子培养小孢子培养、未受精子房及卵细胞培养未受精子房及卵细胞培养等方面。4 4（二）单倍体的发生形成1.自发产生 生理不正常，胚胎发生时期死亡2.诱导产生：(1)远缘杂交：远缘花粉诱导卵细胞在未受精情况下受刺激发育成胚(2)物理、化学诱变：花粉失去受精能力，卵细胞在花粉刺激下孤雌生殖(3)多胚种子，例如裸子植物、芒果等(4)花药和花粉培养：产生单倍体胚5 5 二、单倍体培养的应用（一）遗传应用 数量遗传研究，创制非整倍体材料，突变体筛选,遗传转化（二）育种学应用1.缩短育种年限缩短育种年限：单倍体加倍形成纯合二倍体 2.提高选择效率提高选择效率 加倍后纯合二倍体其等位基因相同，没有显隐性基因相互遮盖 3.获得纯雄株等特殊育种材料获得纯雄株等特殊育种材料4.选育自交系选育自交系6 6三、花药培养（一）概述 花药培养属于器官培养范畴花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期的花药在适当条件下可通过两种途径发育成单倍体植株。1.胚发生途径胚发生途径 花粉-原胚-胚状体-单倍体植株 例如：甜椒、茄子、大白菜、油菜2.不定器官发生途径器官发生途径 花粉-单倍体愈伤组织-诱导器官分化-单倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药培养过程中可能受到药壁组织干扰，可能存在二倍体再生植株，需要进壁组织干扰，可能存在二倍体再生植株，需要进行倍性鉴定。行倍性鉴定。7 7a,b：球形胚,胚的表面粘连在花粉粒外壁上；c,d：心形胚；e,f：鱼雷形胚8 8A：从裂开的花药中长出胚状体;B、C：从药室中直接长出的幼苗;D、E：具有根、茎、叶的小苗;F：小苗发达的根系9 9（二）花药培养基本程序1.取材 供体植株最好栽种在温光可控条件下，以保证花的发育条件稳定，试验具有可重复性。花药应取自幼年植株，多数植物以单核中央期单核中央期或单核靠边期单核靠边期为宜。以花的外观形状来确定采花标准，用醋酸洋红压片法或者碘-碘化钾压片法四分体时期单核靠边期花药切片显微观察10102.灭菌及预处理 未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在45条件下冷处理24d，易产生胚状体。3.接种 尽量不使花药损伤并去除花丝，排除二倍体组织对单倍体植株再生的影响。4.培养 常用培养基有MS、B5、Nitsch、White等，38周后花粉中形成了胚状体或愈伤组织。先暗培养诱导愈伤组织，再转至25，光照2000lx/14h条件下促进分化。1111四、花粉培养（小孢子培养）（一）概念 花粉培养及游离小孢子培养（isolated microspore culture）属于细胞培养细胞培养的范畴，它是通过人工培养游离花粉或小孢子，改变其形成花粉管和精细胞的发育途径，诱导其形成单倍体植株。1212优点：（1）可以消除花丝、花药壁等二倍体组织的干扰，得到的愈伤组织、胚状体或再生植株纯粹是配子体起源的，可以省却对其来源进行鉴定的步骤。（2）不存在花药壁等相关组织的影响，可以更好的调节支配核发育的各种因素，实验的可控性加强。（3）可以观察到单个花粉或小孢子雄核发育的过程，因而是研究雄核发育过程及其影响因子的理想实验系统。1313（二）花粉与小孢子的分离1.自然释放法（散落花粉法）：Sunderland（1977）2.机械分离法：Nitsch（1974），烟草 花蕾消毒-取出花药-液体培养基-挤压、研磨花药-尼龙筛网过滤-收集滤液-500 800 rpm离心35min-弃上清液-沉淀的花粉用液体培养基悬浮-离心-清洗23次-花粉密度103104/ml液体培养1414（三）花粉培养方法1.液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。2.固体培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保温在40条件下使其保持液体状态，将含有花粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合，使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。15153.夹层培养 固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液4.看护培养 Sharp（1972），将番茄完整的花药置于固体培养基上，在花药上覆盖一张滤纸圆片，用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴在滤纸上进行培养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育诱导率。1616（四）影响单倍体培养的因素1.供体植株基因型与生理状态 基因型以十字花科为例，胚状体形成的容易顺序：油菜类白菜类甘蓝类 生理状态：生长旺盛效果好，开花早期的花蕾容易2.花粉发育时期 单核中期至单核晚期的花粉已形成花粉胚或花粉愈伤组织，甜椒单核中期花粉的胚状体诱导率为10.87%29.11%，而二核期花粉的胚状体诱导率则仅有4.03%17173.预处理 低温处理可以促进花粉形成胚状体低温处理可以促进花粉形成胚状体，对于不同作物，所需处理温度与处理时间有所不同。高温预处理可以促进雄核发育高温预处理可以促进雄核发育，油菜花药在培养前置于35条件下处理24h，再放回25条件下培养，花粉胚的形成频率可由0.5%提高到1%18184.培养条件（1）培养基：MS、B5、White、N6、C17、W14等（2）蔗糖：提供碳源，调节渗透压。一般认为较一般认为较高浓度的蔗糖可以抑制花药中体细胞愈伤组织的增高浓度的蔗糖可以抑制花药中体细胞愈伤组织的增殖，促进花粉愈伤组织和胚状体形成殖，促进花粉愈伤组织和胚状体形成。例如十字花科作物的蔗糖用量一般为1013%，其中诱导孢子体分裂阶段浓度为20%，诱导花粉胚生长浓度为10%，再生浓度为3%。（3）激素：2，4-D对启动分裂和愈伤组织增殖往对启动分裂和愈伤组织增殖往往有刺激作用，对分化有抑制作用往有刺激作用，对分化有抑制作用。IAA+BA有利于花粉直接形成胚状体。1919五、单倍体育种 花药及花粉培养的再生植株并非全是单倍体，通常由胚状体途径得到的再生植株多是单倍体，而由愈伤组织分化而来的再生植株有单倍体、二倍体、三倍体、四倍体甚至非整倍体，需要对再生植株进行根尖或茎尖染色体数目检查。单倍体植株无法正常繁殖，必须进行染色体加倍后，形成二倍体方可开花结实。20201.自发加倍：随机性强，烟草12%，不会出现畸形。2.人工药剂加倍：秋水仙碱，使细胞核分裂中期延长或停止，阻碍或破坏纺锤丝形成和发展，使分裂的染色体停留在赤道板上无法形成新的核膜，染色体分裂而细胞未进行分裂。（1）培养细胞处理：培养基中添加一定浓度的秋水仙素。（2）试管苗处理：培养基中的单倍体幼苗取出，浸泡在0.20.4%灭菌秋水仙素溶液中2448h，再转接到新鲜培养基上。2121（3）成株处理：0.20.4%秋水仙素调和在羊毛脂中，涂抹在植株侧芽或顶芽上，处理2448h后用清水冲掉。3.离体培养加倍：将单倍体植株进行离体培养