免疫组织化学概述与制片.pptx

免疫组织化学免疫组织化学ImmunohistochemistryImmunohistochemistry参考教材参考教材 免疫组织化学实验技术及应用免疫组织化学实验技术及应用主编：倪灿荣等主编：倪灿荣等第一章第一章 绪绪 论论 目目 录录一、一、定义定义和意义和意义二、发展简史二、发展简史三、三、免疫学免疫学概念概念四、基本四、基本类型与原理类型与原理五、五、种类种类六、基本过程六、基本过程 一、免疫组织化学的定义及意义一、免疫组织化学的定义及意义 1、定义、定义 免疫组织化学免疫组织化学(Immunohistochemistry)，又称，又称免疫细胞化学免疫细胞化学(Immunocytochemistry)。已知的标记抗体（或抗原）已知的标记抗体（或抗原）原位显示原位显示细胞细胞或组织或组织内的相应抗原（或抗体）的方法内的相应抗原（或抗体）的方法,进行定性、定量、进行定性、定量、定位定位检测。检测。原理：抗原、抗体特异性结合原理：抗原、抗体特异性结合 标记化学反应标记化学反应 酶或其他物质标记抗体酶或其他物质标记抗体 抗原抗原-抗体反应抗体反应 抗原抗原-抗体复合物抗体复合物 呈色化学反应呈色化学反应 底物在酶作用下产生有色物质底物在酶作用下产生有色物质2 2、基本理论、基本理论组织化学呈色反应组织化学呈色反应颜色（原位）颜色（原位）3、优点、优点高特异性高特异性高敏感性高敏感性方法步骤统一方法步骤统一形态、机能与代谢相结合形态、机能与代谢相结合,可定性、定位与定量可定性、定位与定量4、免疫组织化学的意义、免疫组织化学的意义（1）肿瘤诊疗）肿瘤诊疗 肿瘤组织起源诊断肿瘤组织起源诊断 肿瘤分型诊断肿瘤分型诊断 确定肿瘤的良恶性确定肿瘤的良恶性 确定转移性恶性肿瘤的原发部位确定转移性恶性肿瘤的原发部位 指导肿瘤的治疗、判断预后指导肿瘤的治疗、判断预后 （2）病原微生物（肿瘤病因）的检查）病原微生物（肿瘤病因）的检查（3）免疫性疾病的诊断）免疫性疾病的诊断（4）科学研究）科学研究 3、抗原决定族（抗原表位）：、抗原决定族（抗原表位）：特殊的化学活性基团区域特殊的化学活性基团区域 （二）抗体（二）抗体:1、定义、定义:机体受抗原刺激后，浆细胞产生的，机体受抗原刺激后，浆细胞产生的，与相应抗原特异性反应的球蛋白（免疫球蛋白：与相应抗原特异性反应的球蛋白（免疫球蛋白：Ig）。）。2、基本结构、基本结构:一一“Y”Y”字型的四肽链字型的四肽链 重链重链(heavy chain,H)(heavy chain,H)：两条、完全相同：两条、完全相同 轻链轻链(light chain,L)(light chain,L)：两条、完全相同：两条、完全相同 二硫键：连接四肽链。二硫键：连接四肽链。二端二端:氨基端（可变区，氨基端（可变区，V V区）区）羧基端（恒定区，羧基端（恒定区，C C区）区）（1 1）可变区）可变区（variable region,V）：）：IgIg分子氨基端，分子氨基端，AaAa的组成和排列顺序有变异，决的组成和排列顺序有变异，决定了抗体结合的特异性。定了抗体结合的特异性。（2 2）恒定区（）恒定区（constant region,C constant region,C）：）：IgIg分子的羧基端，分子的羧基端，AaAa组成和排列在同一动物种属中组成和排列在同一动物种属中同类抗体比较恒定。具有免疫原性同类抗体比较恒定。具有免疫原性同一种属动物对不同抗原产生的同类抗体同一种属动物对不同抗原产生的同类抗体:V区区:不同，不同，C区区:相同，免疫原性相同，免疫原性:相同。相同。抗体抗体 抗抗体（二抗：种属特异性抗体）抗抗体（二抗：种属特异性抗体）免疫免疫 四、基本类型与原理四、基本类型与原理（一）直接法（一步法）（一）直接法（一步法）原理：原理：（二）间接法（二）间接法 原理：原理：（三）非标记抗体酶法（三）非标记抗体酶法 1 1、酶桥法、酶桥法 ：以第二抗体作桥，任何抗体都未标记：以第二抗体作桥，任何抗体都未标记原理：原理：一抗和三抗来源于同一种属动物的同类抗体一抗和三抗来源于同一种属动物的同类抗体2 2、PAPPAP法（法（peroxidase Antiperoxidase,peroxidase Antiperoxidase,过氧化过氧化物酶抗过氧化物酶法）物酶抗过氧化物酶法）原理：预先制备原理：预先制备PAPPAP复合物复合物一抗和一抗和PAP复合物中的抗体来源于同一种属动物的同复合物中的抗体来源于同一种属动物的同类抗体类抗体（四）亲和素（四）亲和素-生物素法生物素法亲和素亲和素-生物素过氧化物酶法（生物素过氧化物酶法（Avidin Biotin Avidin Biotin ComplexComplex：ABCABC法）法）原理：预先制备原理：预先制备ABCABC复合物复合物五、分类五、分类:按标记物的不同按标记物的不同免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学免疫酶免疫酶组织组织化学化学亲和免疫亲和免疫组织组织化学化学免疫金免疫金-银银标记技术标记技术免疫双重和多重免疫双重和多重组织组织化学化学杂交免疫杂交免疫组织组织化学化学六六.基本过程基本过程(1)(1)抗原的提取和纯化抗原的提取和纯化(2)(2)免疫动物或细胞融合免疫动物或细胞融合(3)(3)抗体提取与效价检测抗体提取与效价检测(4)(4)标记抗体标记抗体(5)(5)细胞与组织切片标本的制备细胞与组织切片标本的制备(6)(6)免疫细胞化学反应和细胞化学显色免疫细胞化学反应和细胞化学显色(7)(7)观察和记录结果观察和记录结果第二章第二章 组织学制片技术组织学制片技术一、定义和意义一、定义和意义二、方法二、方法三、基本程序三、基本程序四、免疫组织化学石蜡切片制作四、免疫组织化学石蜡切片制作一、定义和意义一、定义和意义 （一）概念（一）概念 将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的标本的技术标本的技术（二）（二）意义意义 1、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研究组织细胞的正常与病理究组织细胞的正常与病理形态形态结构的主要方法。结构的主要方法。2、是显示组织、细胞中某些、是显示组织、细胞中某些化学成分、基因化学成分、基因的的定位定位分布和含量变化的不可缺少的手段。分布和含量变化的不可缺少的手段。二、制片方法二、制片方法（一）非切片法：（一）非切片法：1、定义：不经切片机切片手续制成标本的方法。、定义：不经切片机切片手续制成标本的方法。2、类型：、类型：整装片（胚胎）：鸡胚整装片（胚胎）：鸡胚铺片（柔软组织）铺片（柔软组织）涂片（液体）涂片（液体）磨片（骨、牙）磨片（骨、牙）印片（淋巴结）印片（淋巴结）类型：非切片法、切片类型：非切片法、切片2、类型：根据所用支持剂（包埋剂）的不同，分为：、类型：根据所用支持剂（包埋剂）的不同，分为：石蜡切片石蜡切片冰冻切片冰冻切片火棉胶切片法火棉胶切片法（二）切片法（二）切片法:1、定义：用切片机、定义：用切片机(microtome)切成微米厚的薄片，切成微米厚的薄片，制出标本切片的方法制出标本切片的方法 三、基本程序三、基本程序切片法切片法2、冰冻切片、冰冻切片取材取材 冷冻冷冻 切片切片 染色染色 封片封片1、石蜡切片、石蜡切片 取材取材 固定固定 脱水脱水 透明透明 浸蜡浸蜡 包埋包埋 切片切片 染色染色 封片封片 （一）取材：从人或动物体内取下所需组织材料的过程（一）取材：从人或动物体内取下所需组织材料的过程 1、材料来源、材料来源（1）人体材料：手术、活检、尸检）人体材料：手术、活检、尸检（2）动物材料）动物材料来源广泛来源广泛大多数动物组织结构与人体相似大多数动物组织结构与人体相似有的结构比人类更典型有的结构比人类更典型四、免疫组织化学石蜡切片制作四、免疫组织化学石蜡切片制作（1）麻醉：）麻醉：吸入麻醉：将浸有吸入麻醉：将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入密闭容器内麻醉。起放入密闭容器内麻醉。适用对象：小动物适用对象：小动物 缺点：乙醚麻醉：缺点：乙醚麻醉：肺部充血肺部充血、呼吸道分泌物增多、呼吸道分泌物增多 注射麻醉：静脉、肌肉或腹腔内注射注射麻醉：静脉、肌肉或腹腔内注射 麻醉剂：麻醉剂：3%戊巴比妥等戊巴比妥等 适用对象：较大动物适用对象：较大动物 缺点：内脏淤血缺点：内脏淤血2、动物的致死方法、动物的致死方法（2）空气栓塞：向动物静脉内注入一定的空气）空气栓塞：向动物静脉内注入一定的空气 适用对象：较大动物，如兔、犬适用对象：较大动物，如兔、犬 缺点：血管、内脏淤血缺点：血管、内脏淤血（3）断头：用剪刀剪去动物头部）断头：用剪刀剪去动物头部 适用对象：小动物，如青蛙、小鼠适用对象：小动物，如青蛙、小鼠（4）其他方法：击头法、断髓法、股动脉放血法等）其他方法：击头法、断髓法、股动脉放血法等3、致死原则：致死原则：（1）选择合适的致死方法：利于取材和观察）选择合适的致死方法：利于取材和观察（2）快速致死，避免挣扎）快速致死，避免挣扎4、取材注意事项、取材注意事项（1 1）根据实验目的选择动物的种类：）根据实验目的选择动物的种类：肝脏肝脏猪肝、胃猪肝、胃狗、卵巢狗、卵巢猫猫（2 2）组织材料要新鲜：在心跳未停时即取材固定。）组织材料要新鲜：在心跳未停时即取材固定。神经系统：神经系统：1010秒钟变性秒钟变性 消化系统上皮：消化系统上皮：1515分钟自溶分钟自溶 亚细胞：变性更快。亚细胞：变性更快。（5）组织块大小适宜：）组织块大小适宜：结构完整结构完整，组织块：小、薄：，组织块：小、薄：1cm 1cm 0.2cm,最厚不能超过最厚不能超过0.5厘米厘米（6）修剪附带的其他组织）修剪附带的其他组织（3）选好部位和切面：）选好部位和切面：胃：胃底；胰腺：胰尾部；胃：胃底；胰腺：胰尾部；肺：肺门肺：肺门 管性器官管性器官:横切，小肠环行皱襞横切，小肠环行皱襞:纵切纵切 头皮头皮:顺毛根纵切，肾脏顺毛根纵切，肾脏:纵切（包括皮质和髓质）纵切（包括皮质和髓质）（4 4）避免损伤组织：）避免损伤组织：避免手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利避免手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利（8）保持清洁：尤其是消化管）保持清洁：尤其是消化管 用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣（7）防止收缩变形）防止收缩变形骨骼肌、神经在离体后：用木刺扎于木板上或将其两骨骼肌、神经在离体后：用木刺扎于木板上或将其两端用线捆于小棒上端用线捆于小棒上（二）固定（二）固定 1 1、概念：用化学试剂使蛋白质凝固或沉淀，保持其生、概念：用化学试剂使蛋白质凝固或沉淀，保持其生活状态时的形态结构的过程。活状态时的形态结构的过程。固定剂（液）：用来固定的化学试剂。固定剂（液）：用来固定的化学试剂。2、目的、目的（1）防止自溶与腐败）防止自溶与腐败（2）维持形态：使细胞内物质凝固或沉淀下来，保存各）维持形态：使细胞内物质凝固或沉淀下来，保存各种抗原成份原有的结构种抗原成份原有的结构（3）利于切片：增加硬度）利于切片：增加硬度（4）利于鉴别和观察：使细胞内成分产生不同）利于鉴别和观察：使细胞内成分产生不同 的折光率的折光率（5）利于染色：媒介作用，使细胞各部易于受色）利于染色：媒介作用，使细胞各部易于受色3、固定剂、固定剂（1）固定剂的必备特性）固定剂的必备特性 渗透力强渗透力强 迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀不致使组织过度收缩与膨胀不致使组织过度收缩与膨胀能使组织获得较佳的折光率能使组织获得较佳的折光率（2）固定剂的种类）固定剂的种类 按作用原理分：按作用原理分：凝固性：甲醛，重铬酸钾凝固性：甲醛，重铬酸钾 沉淀性：酒精、升汞等沉淀性：酒精、升汞等按化学性质分按化学性质分还原剂：醛类、醇类还原剂：醛类、醇类氧化剂：锇酸、重铬酸钾氧化剂：锇酸、重铬酸钾酸类：苦味酸、醋酸酸类：苦味酸、醋酸单一固定剂：一种试剂组成单一固定剂：一种试剂组成只对细胞的某种成分固定得较好，不能将所有的成分只对细胞的某种成分固定得较好，不能将所有的成分都保存下来都保存下来混合固定剂：两种以上的混合固定剂：两种以上的试试剂组成剂组成 按组成成分按组成成分（3）常用单一固定剂的性质及用法）常用单一固定剂的性质及用法名称名称福福尔尔马马林林（甲甲醛醛）性质概要性质概要1、无色、刺激味的无色、刺激味的液体。液体。还原剂，还原剂，凝固凝固蛋白质。蛋白质。2、保存保存脂类、脂类、糖糖，线粒体及高尔基体的线粒体及高尔基体的固定剂。固定剂。3、硬化剂，冰冻切、硬化剂，冰冻切片的优良固定剂。片的优良固定剂。对染对染色的色的影响影响固定固定后的后的处理处理硬硬化化程程度度其他其他常用的单纯固定常用的单纯固定剂，对细胞的保剂，对细胞的保存好。甲醛存好。甲醛能与能与任何比例的水、任何比例的水、醇及乙醚混合。醇及乙醚混合。渗透速度渗透速度及小块组及小块组织（织（2mm3）固定时）固定时间间较快较快412小小时时适适度度可可入入70%酒酒精精或或水水冲冲洗洗对苏对苏木素木素着色着色好，好，对伊对伊红着红着色困色困难。难。收缩收缩与膨与膨胀情胀情况况收收缩缩较较小，小，脱脱水水会会使使收收缩缩变变大大。名称名称性质概要性质概要对染对染色的色的影响影响固定固定后的后的处理处理硬硬化化程程度度其他其他渗透速度渗透速度及小块组及小块组织（织（2mm3）固定时）固定时间间重重铬铬酸酸钾钾1、橙红色结晶体，、橙红色结晶体，有毒、氧化力极强，有毒、氧化力极强，能溶于水，不溶于能溶于水，不溶于醇，凝固蛋白质醇，凝固蛋白质2、保存类脂体，、保存类脂体，线粒体的固定剂，线粒体的固定剂，溶解染色质。溶解染色质。较快，较快，24小小时时在切在切片技片技术中术中是良是良好的好的药品药品收缩收缩与膨与膨胀情胀情况况起初起初收缩收缩不显不显著，著，组织组织经酒经酒精脱精脱水会水会继续继续收缩收缩中中等等用用水水冲冲洗洗对对酸酸性性染染料料着着色色很很好好（4）混合固定剂的优点及配制原则）混合固定剂的优点及配制原则优点：取长补短优点：取长补短原则：相互弥补原则：相互弥补 快快+慢慢 胀胀+缩缩(5)常用混合固定剂常用混合固定剂A、F液（酒精液（酒精+甲醛）甲醛）组成：无水酒精组成：无水酒精90毫升，毫升，40%甲醛甲醛10毫升毫升特点：简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好、对弹特点：简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好、对弹性纤维、胶原纤维染色好性纤维、胶原纤维染色好Carnoy液液组成：冰醋酸组成：冰醋酸1份，氯仿份，氯仿3份，无水酒精份，无水酒精6份份特点：快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内特点：快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内DNA、RNA固定。固定。Bouin液液 组成：饱和苦味酸水溶液，组成：饱和苦味酸水溶液，40%甲醛，冰醋酸。甲醛，冰醋酸。（15：5：1）特点：常用，固定时间特点：常用，固定时间1224小时，适用于大多数小时，适用于大多数组织，以细胞核、细胞分裂为好，对肾脏固定不好。组织，以细胞核、细胞分裂为好，对肾脏固定不好。现配现用现配现用Zenker S液液组成：重铬酸钾组成：重铬酸钾2.5克，升汞克，升汞5克，蒸馏水克，蒸馏水100毫升毫升贮备液：棕色瓶保存，临用前加冰醋酸贮备液：棕色瓶保存，临用前加冰醋酸5毫升。毫升。特点：常用，固定时间特点：常用，固定时间1224小时，水冲洗，加碘小时，水冲洗，加碘去汞，细胞核、细胞质染色好。去汞，细胞核、细胞质染色好。（5）固定的方法）固定的方法 灌注法：经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器灌注法：经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器官（超微结构）官（超微结构）类型：心插管固定；股动脉插管灌注类型：心插管固定；股动脉插管灌注 浸泡法：组织直接浸泡在固定液中。浸泡法：组织直接浸泡在固定液中。固定液的量：足够、组织块大小的固定液的量：足够、组织块大小的1530倍，瓶底垫倍，瓶底垫纱布纱布 微波固定：固定的组织收缩小微波固定：固定的组织收缩小 蒸汽固定：避免可溶性成分在固定液中丢失，对人危蒸汽固定：避免可溶性成分在固定液中丢失，对人危害大害大（6）组织固定后的变化）组织固定后的变化体积改变：胀或缩体积改变：胀或缩酒精、升汞、苦味酸酒精、升汞、苦味酸 缩小缩小重铬酸钾、醋酸重铬酸钾、醋酸膨胀膨胀硬度增加：硬度增加：酒精、甲醛酒精、甲醛增加多增加多锇酸、苦味酸锇酸、苦味酸增加较少增加较少抗张力增加抗张力增加折光率增加折光率增加着色性增加着色性增加（7）固定注意事项）固定注意事项标本大小适宜：组织块体积：标本大小适宜：组织块体积：1cm 1cm 0.2cm标本固定要及时标本固定要及时最好在低温下固定最好在低温下固定固定液的选择要合理固定液的选择要合理固定液配制要新鲜固定液配制要新鲜(除贮存液外，要现配现用）除贮存液外，要现配现用）固定液的量要足够：组织块大小的固定液的量要足够：组织块大小的1530倍，瓶倍，瓶底垫纱布。底垫纱布。固定时间适当：避免太长、太短。固定时间适当：避免太长、太短。固定后要彻底冲洗固定后要彻底冲洗（三）洗涤和脱水（三）洗涤和脱水1、洗涤、洗涤 （1）目的）目的 去除固定液，终止固定作用，去除固定液，终止固定作用，去除固定剂的重金属离子或颗粒去除固定剂的重金属离子或颗粒（2）原则）原则什么配的固定剂就用什么洗什么配的固定剂就用什么洗（苦味酸固定的，苦味酸固定的，用低浓度乙醇洗），固定剂为酒精或酒精混合液用低浓度乙醇洗），固定剂为酒精或酒精混合液可不洗可不洗洗涤时洗涤时固定时固定时特殊成分加特殊洗涤剂：脱黄（特殊成分加特殊洗涤剂：脱黄（70%乙醇），乙醇），碘酊脱贡（固定液含升汞的），硫代硫酸钠脱碘碘酊脱贡（固定液含升汞的），硫代硫酸钠脱碘 2、脱水、脱水 （1）概念：用化学试剂将标本中的水置换出来的过程）概念：用化学试剂将标本中的水置换出来的过程 （2）目的：）目的：利于浸蜡（水不能与石蜡等包埋剂混合）利于浸蜡（水不能与石蜡等包埋剂混合）利于组织的永久保存（水使组织分解）利于组织的永久保存（水使组织分解）（3）脱水剂）脱水剂脱水剂的特性脱水剂的特性与与水水任意混合，也能与任意混合，也能与透明剂透明剂混合的液体混合的液体脱水剂的类型脱水剂的类型单纯脱水剂单纯脱水剂如：酒精、丙酮等如：酒精、丙酮等脱水兼透明的脱水剂脱水兼透明的脱水剂如：正丁醇等如：正丁醇等最常用：酒精，缺点：组织硬化和变脆最常用：酒精，缺点：组织硬化和变脆（尤其是高浓度酒精）。（尤其是高浓度酒精）。（4）酒精脱水）酒精脱水原则：原则：循序渐进，酒精浓度逐步增大循序渐进，酒精浓度逐步增大一般为一般为70%80%90%95%100%柔软组织、胚胎组织柔软组织、胚胎组织:30%开始开始暂不包埋的组织暂不包埋的组织:70%80%的酒精保存的酒精保存更换乙醇更换乙醇:吸水纸吸去组织块表面的水吸水纸吸去组织块表面的水脱水时间：组织种类、体积大小而定脱水时间：组织种类、体积大小而定(一般一般624小时）小时）（四）（四）透明透明2、目的：便于浸蜡包埋、目的：便于浸蜡包埋 1、定义：用一种既可与、定义：用一种既可与脱水剂脱水剂相容又能和相容又能和 石蜡石蜡相容的物质置换脱水剂，组织块呈现透明状态。相容的物质置换脱水剂，组织块呈现透明状态。3、透明剂：透明所用的药剂、透明剂：透明所用的药剂透明剂：透明剂：苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等常用：二甲苯、香柏油常用：二甲苯、香柏油（1）二甲苯）二甲苯优点：透明力强，作用快。优点：透明力强，作用快。缺点：容易使组织收缩、变硬、变脆。缺点：容易使组织收缩、变硬、变脆。注意：先经注意：先经1/2纯酒精纯酒精+1/2二甲苯混合液过度，二甲苯混合液过度，再进二甲苯再进二甲苯，二甲苯，二甲苯（可通过肉眼观察来决定（可通过肉眼观察来决定时间）。时间）。透明过度透明过度,组织变脆组织变脆,切片时易破碎切片时易破碎（2）香柏油）香柏油优点：组织收缩及硬化小优点：组织收缩及硬化小缺点：慢，缺点：慢，12小时以上；香柏油透明后需浸二甲苯小时以上；香柏油透明后需浸二甲苯（因不易被石蜡取代）（因不易被石蜡取代）问题：如果组织块在透明时，呈白色浑浊不问题：如果组织块在透明时，呈白色浑浊不透明状态，是何原因？透明状态，是何原因？答：脱水不彻底所致。答：脱水不彻底所致。（五）浸蜡与包埋（五）浸蜡与包埋 浸蜡：支持剂石蜡透入组织内部，置换透明剂的过程。浸蜡：支持剂石蜡透入组织内部，置换透明剂的过程。1、浸蜡目的、浸蜡目的 置换透明剂，将软组织变为蜡块，以便切片。置换透明剂，将软组织变为蜡块，以便切片。软蜡软蜡软蜡软蜡硬蜡硬蜡硬蜡硬蜡30 40分钟分钟30 40分钟分钟20 30分钟分钟20 30分钟分钟 2、浸蜡过程、浸蜡过程软软蜡蜡硬硬蜡蜡 3、浸蜡注意点、浸蜡注意点选用适当熔点的蜡：南方硬蜡，北方软蜡选用适当熔点的蜡：南方硬蜡，北方软蜡 冬软，夏硬冬软，夏硬充分透入充分透入要使石蜡完全渗入细胞的每个部分要使石蜡完全渗入细胞的每个部分浸蜡时间不能太长，烤箱温度不可太高，否则组浸蜡时间不能太长，烤箱温度不可太高，否则组织收缩变脆。织收缩变脆。4、包埋：浸透石蜡的组织块入新的石蜡中冷却凝固。、包埋：浸透石蜡的组织块入新的石蜡中冷却凝固。包埋：硬蜡包埋：硬蜡（1）包埋剂）包埋剂石蜡：最常用，类型（熔点不同）：软蜡和硬蜡。石蜡：最常用，类型（熔点不同）：软蜡和硬蜡。软蜡：熔点软蜡：熔点50，硬蜡：熔点，硬蜡：熔点50 （2）材料：）材料：L形金属包埋框，玻璃底版、酒精灯、小镊子形金属包埋框，玻璃底版、酒精灯、小镊子（3）包埋中注意要点）包埋中注意要点小尖镊不时烤热小尖镊不时烤热标本切面方向朝下，标本间要有一定的距离标本切面方向朝下，标本间要有一定的距离动作快动作快快速冷却：石蜡表面凝固，立即放入冷水中快速冷却：石蜡表面凝固，立即放入冷水中（4）包埋后可能出现的问题）包埋后可能出现的问题 组织内空泡：脱水或透明或浸蜡不够。组织内空泡：脱水或透明或浸蜡不够。组织外空泡：包埋动作太慢。组织外空泡：包埋动作太慢。有空泡有空泡（5）标本分块）标本分块修切蜡块：修切蜡块：正面：正方形或长方形，两边两两平行。正面：正方形或长方形，两边两两平行。标本四周标本四周:1-2mm宽的石蜡宽的石蜡侧面：梯形侧面：梯形1、切片前玻片的处理、切片前玻片的处理清洁液泡清洁液泡1224h自来水冲洗自来水冲洗蒸馏水洗蒸馏水洗95酒精浸泡酒精浸泡2h烤干烤干防脱片处理防脱片处理（多聚赖氨酸（多聚赖氨酸)（六）切片（六）切片2、切片机、切片机分类分类轮转切片机（本室常用）轮转切片机（本室常用）刀固定，材料前进，主要用于石蜡切片刀固定，材料前进，主要用于石蜡切片主要构造主要构造载物台载物台持刀架持刀架 切片厚度调整器切片厚度调整器推拉式切片机推拉式切片机材料固定，刀移动材料固定，刀移动 主要用于火棉胶切片主要用于火棉胶切片（2 2）切片注意事项：）切片注意事项：刀片刀片:锋利，切片机的螺丝锋利，切片机的螺丝:旋紧。旋紧。组织块的切面和切片刀间的夹角组织块的切面和切片刀间的夹角:5:5。切片速度切片速度:均匀均匀 石蜡切片正面朝上放（与刀片接触的面为反面）石蜡切片正面朝上放（与刀片接触的面为反面）（3）石蜡切片中常遇的）石蜡切片中常遇的问题及解决办法问题及解决办法蜡带变弯蜡带变弯刀锋锐不一致，蜡块四方刀锋锐不一致，蜡块四方不对称，蜡块与刀口不平不对称，蜡块与刀口不平行。行。移动刀口位置，修整蜡移动刀口位置，修整蜡块，调整刀或蜡块块，调整刀或蜡块。蜡带上卷蜡带上卷刀不利，斜度大，蜡片太厚，刀不利，斜度大，蜡片太厚，蜡边留太少，硬度过大，室蜡边留太少，硬度过大，室温过低。温过低。磨刀，调刀角度，调片磨刀，调刀角度，调片厚度，重包，加温。厚度，重包，加温。蜡片起皱蜡片起皱刀不利，斜度过小，刀口不刀不利，斜度过小，刀口不洁洁，蜡太软，室温过高。蜡太软，室温过高。磨刀，调刀角度，二甲磨刀，调刀角度，二甲苯擦，冰冻，降温。苯擦，冰冻，降温。蜡片有裂蜡片有裂痕或划破痕或划破刀有缺口，蜡中有气泡或刀有缺口，蜡中有气泡或沙粒。沙粒。移动刀口位置，包埋移动刀口位置，包埋前去气，滤蜡前去气，滤蜡问问 题题原原 因因解解 决决组织与蜡分离组织与蜡分离脱水、透明、浸蜡不够。脱水、透明、浸蜡不够。退回，选择适当时间。退回，选择适当时间。蜡片厚薄蜡片厚薄不一不一推进装置失灵，夹具松动，推进装置失灵，夹具松动，蜡块过大。蜡块过大。修理切片机，上紧夹具，修理切片机，上紧夹具，取材宜小。取材宜小。问问 题题原原 因因解解 决决切片脆烂切片脆烂高浓度酒精，透明高浓度酒精，透明,浸蜡浸蜡太久，蜡温过高。太久，蜡温过高。无法弥补，控制蜡无法弥补，控制蜡温和浸蜡时间温和浸蜡时间。（4）石蜡切片的详细过程）石蜡切片的详细过程详细过程详细过程 步骤步骤 本室本室 参考参考 时间时间 取材取材 固定固定 24小时左右小时左右洗涤洗涤 等于固定时等于固定时脱水：脱水：70%酒精酒精 612小时小时 80%酒精酒精 48小时小时 95%酒精酒精 24小时小时 95%酒精酒精 24小时小时 100%酒精酒精 12小时小时 100%酒精酒精 12小时小时 1/2 纯酒精纯酒精+1/2二甲苯二甲苯 2030分钟分钟 透明：透明：二甲苯二甲苯 1530分钟分钟 二甲苯二甲苯 1530分钟分钟浸蜡：浸蜡：软蜡软蜡 3045分钟分钟硬蜡硬蜡 3045分钟分钟包埋包埋 切片切片 贴片（温水捞片）贴片（温水捞片）烤片（烤片（370C过夜）过夜）（七）脱蜡和水合（七）脱蜡和水合:脱蜡脱蜡:二甲苯脱去石蜡切片的蜡，两次二甲苯脱去石蜡切片的蜡，两次水合（水化、下行入水）：水合（水化、下行入水）：酒精浓度：逐步降底酒精浓度：逐步降底100%酒精酒精95%酒精酒精80%酒精酒精蒸馏水蒸馏水（八）抗原修复（八）抗原修复1、原因：甲醛使蛋白质发生凝固，分子间会发生、原因：甲醛使蛋白质发生凝固，分子间会发生交联交联2、目的：抗原再现、目的：抗原再现 3 3、方法：酶消化、热诱导的抗原修复、方法：酶消化、热诱导的抗原修复 （1 1）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：定义：高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。定义：高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。修复方式：修复方式：a a微波微波 b b煮沸煮沸 c c高压锅。高压锅。（2 2）酶消化：）酶消化：去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 断交联断交联蛋白酶的种类蛋白酶的种类0.05%0.05%0.10.1胰蛋白酶：细胞内抗原胰蛋白酶：细胞内抗原0.4%0.4%胃蛋白酶：细胞外基质内抗原胃蛋白酶：细胞外基质内抗原 （九）封闭（九）封闭原因原因:蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上解决办法解决办法:滴加第二抗体来源动物之非免疫血清滴加第二抗体来源动物之非免疫血清 抗体稀释液中加入牛血清白蛋白抗体稀释液中加入牛血清白蛋白 1、滴加抗体：抗体浓度要合适的、滴加抗体：抗体浓度要合适的 2、温育时间、温育时间:370C,3060分钟分钟,湿盒中湿盒中；40C,过夜过夜，呈色呈色（十）免疫染色（十）免疫染色 （十一）复染（十一）复染（1 1）目的：将机体组织细胞染上颜色，衬托出）目的：将机体组织细胞染上颜色，衬托出组织形态结构。组织形态结构。（2 2）部位：染细胞核）部位：染细胞核（3 3）复染剂：苏木素、甲基绿、核固红）复染剂：苏木素、甲基绿、核固红（4）染料（复染剂）的特性）染料（复染剂）的特性有颜色有颜色与被染组织有亲和力与被染组织有亲和力发色团：产生颜色的原子团发色团：产生颜色的原子团助色团：使染料对组织有亲和力的原子团。助色团：使染料对组织有亲和力的原子团。发色团：发色团：硝基硝基、亚硝基、偶氮基亚硝基、偶氮基、羰基、烯基、醌型苯环、羰基、烯基、醌型苯环发色团多的染料，颜色深发色团多的染料，颜色深助色团：助色团：OH、COOH、NH2、NCH3CH3有色物：只有颜色，无亲和力有色物：只有颜色，无亲和力染料的分类染料的分类 根据来源分类根据来源分类天然：苏木素（植物），胭脂红（动物胭脂虫）天然：苏木素（植物），胭脂红（动物胭脂虫）人工合成：苦味酸，偶氮染料人工合成：苦味酸，偶氮染料 根据化学反应分根据化学反应分酸性染料酸性染料碱性染料碱性染料酸性染料：酸性助色团（酸性染料：酸性助色团（COOH，SO3H等），等），带负电荷。伊红带负电荷。伊红碱性染料：碱性助色团（碱性染料：碱性助色团（NH2、NCH3等），等），带正电荷。美兰、苏木素带正电荷。美兰、苏木素中性染料：酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨中性染料：酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨 根据染色对象分根据染色对象分胞核染料：苏木素，胭脂红胞核染料：苏木素，胭脂红胞浆染料：伊红、苦味酸胞浆染料：伊红、苦味酸脂肪染料：苏丹脂肪染料：苏丹、，油红，油红O（5）染色原理）染色原理物理和化学综合作用物理和化学综合作用 物理作用：物理作用：渗透作用：不牢固渗透作用：不牢固吸附作用：吸附作用：分子引力作用，色素粒子被吸附分子引力作用，色素粒子被吸附吸收作用：牢固吸收作用：牢固 化学作用化学作用细胞主要成分：蛋白质细胞主要成分：蛋白质含含NH2 与酸性染料（带负电荷）与酸性染料（带负电荷）COOH 与碱性染料（带正电荷）与碱性染料（带正电荷）（碱性）（碱性）（酸性）（酸性）细胞核（酸性物质多）：与碱性染料亲和力强细胞核（酸性物质多）：与碱性染料亲和力强细胞质（碱性物质多）：与酸性染料亲和力强细胞质（碱性物质多）：与酸性染料亲和力强（十二）分化与封藏（十二）分化与封藏 1、分化（分色）、分化（分色）概念：把过染的部分褪至适当的程度，去掉不应着色概念：把过染的部分褪至适当的程度，去掉不应着色的颜色。的颜色。对苏木素染色的组织分色对苏木素染色的组织分色:用用0.51%的盐酸酒精。的盐酸酒精。分化剂（脱色剂）分化剂（脱色剂）:脱去切片上过染的颜色的试剂脱去切片上过染的颜色的试剂以酸褪碱性染料，以碱褪酸性染料（含碱的自来水）以酸褪碱性染料，以碱褪酸性染料（含碱的自来水）2、封藏（固）、封藏（固）（1）目的）目的 防止退色、受潮、干裂及磨损等，使切片永久保存防止退色、受潮、干裂及磨损等，使切片永久保存（2）常用封藏（固）剂）常用封藏（固）剂干性（常用）：保存时间长，干性（常用）：保存时间长，封固前：封固前：须脱水、透明须脱水、透明中性树胶（液态或固态）中性树胶（液态或固态）便宜便宜加拿大树胶（固态）加拿大树胶（固态）较贵较贵香柏油香柏油 凝固太慢凝固太慢水性：水性：甘油：液态，图象清晰度不佳甘油：液态，图象清晰度不佳甘油明胶：固态，凝固性甘油明胶：固态，凝固性不需脱水、透明，保存时间短不需脱水、透明，保存时间短（3）封固注意事项：）封固注意事项：树胶不能搅拌树胶不能搅拌 树胶量要合适树胶量要合适 标本表面二甲苯不能挥发干标本表面二甲苯不能挥发干 盖玻片大小适宜：标本周围留盖玻片大小适宜：标本周围留2mm空白空白 封片时都避免产生气泡封片时都避免产生气泡（十三）免疫组化结果的观察和记录（十三）免疫组化结果的观察和记录 1、结果判断、结果判断:阳性细胞的染色特征阳性细胞的染色特征(1)阳性细胞染色部位阳性细胞染色部位:胞浆胞浆;胞核胞核;胞膜。胞浆：多胞膜。胞浆：多(3)阳性细胞分布：局灶性和弥漫性阳性细胞分布：局灶性和弥漫性(2)不同阳性细胞染色强度：不一。非特异染色：不同阳性细胞染色强度：不一。非特异染色：所有的细胞染色强度相同所有的细胞染色强度相同(4)阳性染色细胞与阴性细胞：相互夹杂分布阳性染色细胞与阴性细胞：相互夹杂分布;非非特异染色：累及一片细胞特异染色：累及一片细胞(5)切片边缘、刀痕或皱褶区域、挤压的细胞以切片边缘、刀痕或皱褶区域、挤压的细胞以及结缔组织：假阳性及结缔组织：假阳性2、对照、对照(1)阳性对照阳性对照:用已知抗原阳性的切片与待检标本用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫染色同时进行免疫染色,对照切片：阳性对照切片：阳性(2)阴性对照阴性对照:用已知抗原阴性的切片与待检标本同时用已知抗原阴性的切片与待检标本同时染色染色,对照切片：阴性对照切片：阴性.(3)空白对照空白对照(替代对照替代对照):用抗体稀释液替代第一抗体用抗体稀释液替代第一抗体,结果：阴性结果：阴性.(4)(4)(4)(4)自自自自身身身身对对对对照照照照：同同同同一一一一标标标标记记记记切切切切片片片片上上上上的的的的自自自自身身身身组组组组织织织织成成成成分分分分的的的的阴阴阴阴性性性性背景对照。背景对照。背景对照。背景对照。结果：阴性或着色较浅结果：阴性或着色较浅结果：阴性或着色较浅结果：阴性或着色较浅目目目目的的的的：排排排排除除除除内内内内源源源源性性性性干干干干扰扰扰扰产产产产生生生生的的的的假假假假阳阳阳阳性性性性和和和和因因因因抗抗抗抗原原原原弥弥弥弥散散散散移移移移位位位位造成的错误结果。造成的错误结果。造成的错误结果。造成的错误结果。3、染色失败的原因、染色失败的原因（1）全部切片都为阴性：）全部切片都为阴性：漏加一种抗体或抗体失效；漏加一种抗体或抗体失效；底物中过氧化氢量少或失效；底物中过氧化氢量少或失效；缓冲液中加叠氮钠，抑制酶活性；缓冲液中加叠氮钠，抑制酶活性；复染使用不当复染使用不当（2）所有切片均为弱阳性）所有切片均为弱阳性 抗体过浓或干燥；抗体过浓或干燥；抗体温育时间过长；抗体温育时间过长；呈色底物液变色或反应时间过长；呈色底物液变色或反应时间过长；过氧化氢浓度过高，成色速度过快；过氧化氢浓度过高，成色速度过快；洗涤不彻底；黏附剂太厚洗涤不彻底；黏附剂太厚 (3)所有切片背景过深所有切片背景过深切片或涂片过厚切片或涂片过厚蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血使用全血清抗体稀释不够使用全血清抗体稀释不够底物成色反应过久底物成色反应过久漂洗不够漂洗不够（4）阳性对照染色良好）阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性：固定处检测的阳性标本呈阴性：固定处理不当理不当4、结果分析：、结果分析：表中15结果无效，6、7结果可靠（）（）（）（）（）（）（）检测标本含抗体，结果可靠（）（）（）7检测标本不含抗体,结果可靠（）（）（）6非特异染色（）（）（）5阳性对照不含定位抗原（）（）（）4阴性对照内含定位抗原()()（）（）3非特异性染色（）（）（）2抗体失活，操作有误（）（）（）1结果判断检测结果替代对照阴性对照阳性对照免疫组织化学石蜡切片制作程序小结免疫组织化学石蜡切片制作程序小结 取材取材 固定固定 洗涤洗涤 脱水脱水 透明透明 浸蜡浸蜡 包埋包埋 切片切片 贴片贴片 脱蜡脱蜡 下行入水下行入水 染色染色 复染复染 脱水脱水 透明透明 封片封片 观察记录观察记录（免疫）（免疫）解答问题：来自丁香园论坛中解答问题：来自丁香园论坛中1.我研究的因子是核蛋白，但是免疫组织化学做出来却我研究的因子是核蛋白，但是免疫组织化学做出来却是在胞浆表达，这是什么原因啊。求高手指教！是在胞浆表达，这是什么原因啊。求高手指教！3.各位见帖好各位见帖好:兄弟在做大鼠脑缺血兄弟在做大鼠脑缺血5天后，天后，bFGF表达的免疫组化，表达的免疫组化，但，无奈，背景非常深，几乎看不出阳性细胞的颜色但，无奈，背景非常深，几乎看不出阳性细胞的颜色 请高手们指点，谢谢请高手们指点，谢谢 2.大家好，我做了免疫组织化学的实验，但就是不显色，大家好，我做了免疫组织化学的实验，但就是不显色，刚开始以为是一抗的原因，但是后来又换了一坑，但刚开始以为是一抗的原因，但是后来又换了一坑，但还是不显色，这最可能是什么原因呢？先谢谢啦还是不显色，这最可能是什么原因呢？先谢谢啦