淫羊藿通过ICA-miR-...的生物信息学分析及实验研究_金垚.pdf

2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2实验淫羊藿通过ICA-miR-335-5p轴缓解骨质疏松症的生物信息学分析及实验研究*金垚1，徐鹏辉1，卞泗善2，滕加文2（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南250014；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南250014）摘要目的：通过生物信息学结合动物实验探讨淫羊藿苷（ICA）上调miR-335-5p促进大鼠成骨分化缓解OP的分子机制。方法：利用TCMSP数据库筛选淫羊藿的主要活性成分及靶点，通过GEO数据库进行miR-335-5p的差异性分析，采用相应数据库预测miR-335-5p和OP的基因靶点，对淫羊藿、miR-335-5p和OP靶点求交集，筛选出淫羊藿干预miR-335-5p治疗OP的基因；利用Metascape数据库进行富集分析，并用String数据库构建PPI网络筛选出Hub基因后，在AutoDock Tools 1.5.6软件中进行分子对接，模拟药效结合过程；采用RT-qPCR测定miR-335-5p在OP患者骨组织、骨质疏松症大鼠骨组织的表达，并测定成骨诱导OP患者BMSCs分化14 d后的miR-335-5p表达，口服ICA和/或过表达miR-335-5p治疗骨质疏松症大鼠10周后，检测成骨基因的表达，HE染色观察大鼠股骨干骺端骨组织微观结构。结果：淫羊藿主要活性成分有23个、作用靶点有221个，淫羊藿调控miR-335-5p治疗OP的作用靶点有40个，富集分析涉及多条通路，分子对接结果显示淫羊藿苷与Hub蛋白均可形成稳定化合物发挥作用。实验研究发现，miR-335-5p在OP患者和OP大鼠的骨组织中低表达，ICA处理和/或过表达miR-335-5p可促进大鼠BMSCs成骨分化；HE染色显示造模大鼠经ICA处理和/或过表达miR-335-5p后骨小梁增多、排列紧密，部分新生骨组织形成，有效缓解了大鼠骨质疏松症。结论：淫羊藿苷可通过ICA-miR-335-5p轴促进大鼠成骨分化来缓解OP，为中药单体治疗OP提供了新的研究思路。关键词骨质疏松症；淫羊藿；淫羊藿苷；生物信息学；BMSCs；成骨分化；大鼠中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0001-07DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.001Bioinformatics Analysis and Experimental Study of Yinyanghuo(Epimedium)inAlleviating Osteoporosis Through ICA-miR-335-5p AxisJINYao1,XU Penghui1,BIAN Sishan2,TENG Jiawen2(1.The First Clinical Medical College of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan Shandong 250014,China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan Shandong 250014,China)AbstractObjective:To explore the molecular mechanism of icariin(ICA)up-regulating miR-335-5p topromote osteogenic differentiation in rats and alleviate OP by bioinformatics combined with animal experiments.Methods:The TCMSP database was used to screen the main active components and targets of Yinyanghuo(Epimedium),the GEO database was used to analyze the differences of miR-335-5p,and the correspondingdatabase was used to predict the gene targets of miR-335-5p and OP,and the intersection of Yinyanghuo(Epimedium),miR-335-5p and OP targets was used to screen the genes of Yinyanghuo(Epimedium)interferingwith miR-335-5p to treat OP.The Metascape database was used for enrichment analysis and the Stringdatabase was used to construct a PPI network to screen out the Hub genes,then carry out molecular docking inAutoDock Tools 1.5.6 software to simulate the process of drug combination.RT-qPCR was used to determinethe expression of miR-335-5p in the bone tissue of OP patients and osteoporotic rats bone tissue,and theexpression of miR-335-5p after 14 days of differentiation of BMSCs induced by osteogenesis in OP patients.After 10 weeks of treatment with oral ICA and/or overexpression of miR-335-5p in osteoporotic rats,the引用：金垚，徐鹏辉，卞泗善，滕加文.淫羊藿通过ICA-miR-335-5p轴缓解骨质疏松症的生物信息学分析及实验研究J.中医药导报,2023,29(2):1-7,13.*基金项目：山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MH359）通信作者：滕加文，E-mail：12023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨密度降低、微观结构退化导致骨脆性增加的一种全身性骨代谢疾病1。人体骨骼发育成熟后，仍会不断进行骨骼重塑，即成骨与破骨活动形成动态平衡，完成骨骼的吸收与重建。正常生理情况下，骨吸收与骨形成是耦联的、平衡的，以保持正常的骨量。当骨吸收强于骨重建，造成骨丢失，则会发生骨质疏松症。由于骨质疏松症发病过程缓慢，无特殊临床表现，故骨折是该病的主要发现途径2。OP的治疗方法很多，主要包括生活方式调整、药物干预和康复治疗3，而药物干预仍是主要的治疗方法。但由于OP发病机制复杂，目前OP的诊治状况并不理想4。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓腔内的一种纤维细胞干细胞，具有良好的自我复制能力及多分化潜能。研究5表明骨髓间充质干细胞的成骨分化受损是OP发生、发展的重要原因，在骨质疏松症的发生发展中起到重要作用。近年来，中医药在治疗OP方面疗效确切且副作用小，越来越受到人们的关注6。淫羊藿为临床治疗OP常用中药。其主要活性成分淫羊藿苷（icariin，ICA）是一种黄酮苷类物质7，具有免疫调节、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等活性8。研究9表明，淫羊藿苷联合干细胞可增加绝经后骨质疏松症大鼠骨量并改善其骨组织的微观结构。研究10显示，淫羊藿苷具有促进骨代谢和改善血液循环的功效，可调控Wnt、PI3K/AKT、mTOR及雌激素受体等相关信号通路，干预激素性股骨头缺血性坏死。多项研究均表明，ICA可以有效增强BMSCs的增殖和成骨分化，然而ICA影响BMSCs成骨分化和调节OP的具体机制仍不清楚。MicroRNA（miRNA）是一类存在于生物体内长度为2024个核苷酸的小RNA11。其在细胞内具有多向调节作用，包括细胞增殖、成骨分化和细胞凋亡等12。近年来，大量研究发现miRNA参与了OP的调控，有研究表明miR-335-5p可促进小鼠骨形成和再生。ICA可上调miR-335-5p的表达，保护大鼠骨微血管内皮细胞功能，从而减轻股骨头坏死13，但ICA能否在OP中调控miR-335-5p的表达还不清楚。生物信息学是结合系统生物学与多向药理学为研究基础，利用生物分子网络分析方法，选取特定节点进行新药设计和靶点分析的药理学分支14。其“多基因、多靶点”的研究特点与复杂疾病的治疗理念相吻合。阐述药物-靶点-基因-疾病之间的复杂网络关系，有利于进行新药研发和药物作用机制的研究15。本研究利用生物信息学分析淫羊藿、ICA、miR-335-5p与OP的作用关系，再结合实验研究探讨ICA调节miR-335-5p促进成骨分化缓解OP的分子机制。1材料与方法1.1分子网络学分析1.1.1数据来源及差异性分析在GEO数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）16中检索数据集GSE93883进行规范化处理，运用GEO2R工具分析miR-335-5p表达的差异性，以P2为筛选标准。1.1.2miR-335-5p与OP的靶基因预测通过TargetScan（http:/www.Targetscan.org）、MiRTarBase（https:/ GeneCards（https:/www.genecards.org/）数据库进行检索，选取可信度1的数据作为疾病OP的靶基因。1.1.3淫羊藿活性成分与作用靶点筛选以淫羊藿作为中药名称在TCMSP数据库（http:/ Tools 1.5.6软件对其进行删除水分子、添加氢原子、计算Gasteiger电荷等操作，输出保存为pdbqt格式。从Pubchem数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载活性成分的3D结构文件并转换为pdb格式。采用Python软件包的PyMOL对蛋白质进行去除水分子及磷酸根等expression of osteogenic genes was detected,and HE staining was used to observe the microstructure of bonetissue in the epiphysis of rat femoral shaft.Results:Yinyanghuo(Epimedium)had 23 main active componentsand 221 targets.Yinyanghuo(Epimedium)regulated 40 targets of miR-335-5p in the treatment of OP.Theenrichment analysis involved multiple pathways.The molecular docking results showed that icariin and Hubprotein can form stable compounds to play a role.The experimental study found that miR-335-5p was lowexpressed in the bone tissue of OP patients and OP rats,and ICA treatment and/or overexpression of miR-335-5p could promote the osteogenic differentiation of rat BMSCs.HE staining showed that after ICA treatment and/or overexpression of miR-335-5p,the bone trabeculae of the model rats increased and arranged tightly,andsome new bone tissue formed,which effectively alleviated osteoporosis in rats.Conclusion:Icariin can alleviateOP by promoting osteogenic differentiation of rats through ICA-miR-335-5p axis,which provides a new researchidea for the treatment of OP with traditional Chinese medicine monomer.Keywordsosteoporosis;Yinyanghuo(Epimedium);icariin;bioinformatics;BMSC;osteogenic differentiation;rat22023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2操作后，导入AutoDock Tools 1.5.6软件修改保存为pdbqt格式18。最后查阅相关文献，获取相应配体活性口袋，设置Gridbox坐标及大小，运行Autodock Vina脚本进行分子对接，以此来评估化合物与配体的结合情况。1.2临床研究1.2.1临床组织采集收集20212022年在山东中医药大学附属医院接受手术治疗的15例骨质疏松症患者和15例骨质正常患者的骨组织样本。根据入院后的骨密度检测结果分组：T-2.5为OP组、T-1.0为正常对照组。所有研究对象均无其他疾病史，并签署知情同意书。本研究已通过山东中医药大学附属医院伦理委员会批准审批号：（2021）伦审第（057）号-KY。1.2.2人BMSCs成骨诱导培养术中抽出志愿者骨髓8 mL，PBS稀释2次，加入等体积的1.077ficoll分离液，400g离心30min。收集BMSCs并用PBS洗涤2次后，将细胞重悬于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，加入1%青霉素/链霉素，在37 5%CO2的环境下培养。BMSCs细胞传代4代后，按5104个/mL的密度接种于6孔板中，每孔1.5 mL，当细胞融合达到80%以上，弃掉原培养基，加入成骨诱导培养基（DMEM中加入10%FBS、5g/mL胰岛素、0.1mol/L地塞米松、0.2mmol/L维生素C和10 mmol/L-甘油磷酸酯）。每3 d换液1次，诱导培养15 d。1.3动物实验研究1.3.1实验动物SPF级7周龄SD雌性大鼠，体质量为（25010）g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2021-0006，适应性饲养7 d，饲养温度2426，相对湿度55%65%，照明条件为12 h光暗循环。实验过程完全遵守 关于善待实验动物的指导性意见，经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（审批号：2021-68）。1.3.2药物与试剂淫羊藿苷（批号：HY-N0014）、胰岛素（批号：HY-P0035）、地塞米松（批号：HY-14648）均购自MCE公司；1.077ficoll分离液（批号：P4350）、维生素C（批号：50-81-7）均购自北京索莱宝科技有限公司；10%胎牛血清（批号：10100147）、青霉素/链霉素（批号：15140148）均购自赛默飞世尔科技有限公司；-甘油磷酸酯（批号：Y67246-25g）购自上海源叶生物科技有限公司；细胞/组织miRNA提取试剂盒（批号：19331ES08）、高效cDNA一链合成试剂盒（批号：19331ES08）、实时定量PCR扩增预混液（批号：11198ES03）均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号：C0105S）购自上海碧云天生物技术有限公司；实验所用引物均购自上海生工生物工程有限公司。1.3.3主要仪器TD5B型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；A37835型7500定量PCR仪、NicoletTMiNTM5 FTIR型电子光学显微镜均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；XRAY-DXA小动物双能X射线骨密度仪（KUBTEC公司）。1.3.4造模与分组采用经典的雌性大鼠卵巢切除法复制绝经后骨质疏松症大鼠模型19-20，造模前大鼠禁食12 h，称取大鼠体质量，使用3%戊巴比妥钠按50 mg/kg剂量腹腔注射进行麻醉，麻醉后腹部脱毛备皮，在髂脊直上2 cm两侧乳头连线分别纵行开一长约1 cm切口，暴露卵巢，结扎卵巢下端输卵管，然后完整摘除双侧卵巢，逐层缝合伤口，伤口滴加青霉素注射液以防感染。术后3 d肌内注射青霉素预防感染。将大鼠随机分为假手术组、模型组、淫羊藿苷组、miRNA模拟物组、miR-335-5p促进剂组、淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组，每组8只。假手术组大鼠切除卵巢附近等量脂肪，其余5组建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。手术12周后，采用小动物双能X射线骨密度仪测定大鼠4、5腰椎及左、右股骨骨密度（bone mineral density，BMD）。模型组大鼠BMD值低于假手术组，差异有统计学意义（P0.05），即为骨质疏松症模型建立成功21。实验过程中意外死亡或造模失败的大鼠及时予以补充。1.3.5实验给药确定造模成功后，在相同饲养条件下进行给药干预，尾静脉注射给药与灌胃给药同时开始。淫羊藿苷组大鼠灌胃给予ICA溶液，250 mg/kg，1次/d，连续10周；miRNA模拟物组大鼠连续3 d尾部注射miRNA模拟物，2 mg/kg，1次/d；miR-335-5p促进剂组大鼠连续3 d尾部注射miR-335-5p促进剂，2 mg/kg，1次/d；淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组大鼠连续3 d尾部注射miR-335-5p促进剂，连续10周灌胃给予ICA溶液，250 mg/kg，1次/d；模型组和假手术组大鼠分别灌胃给予双蒸水，5mL/kg，1次/d，连续10周。1.4观察指标1.4.1RT-qPCR法检测miR-335-5p mRNA、RUNX2 mRNA、OPN mRNA的表达采用细胞/组织miRNA提取试剂盒从总样本中提取miRNA，用TRIzol试剂提取样品中的总RNA，取1 g RNA用高效cDNA一链合成试剂盒逆转录合成cDNA；根据说明书，在ABI 7500系统上使用实时定量PCR扩增预混液（qPCR SYBR Green Master Mix）进行RT-qPCR检测基因表达，-肌动蛋白和U6用作对照，结果通过2-ct方法计算。引物序列如下。miR-335-5p：上游引物5-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC-3，下游引物5-CUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3；RUNX2：上游引物5-CACTGGCGGTGCAACAAGA-3，下游引物5-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3；OPN：上游引物5-ATGCGGTGTAAGCGGCAACAA-3，下游引物5-ATGCGGTGTAAGCGGCAACAA-3；-actin：上游引物5-CACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3，下游引物5-ACCCATGCCCACCATCACG-3；U6：上游引物5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。1.4.2HE染色观察骨组织形态学改变采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，取大鼠双侧股骨干骺端骨组织脱钙后用石蜡包埋，然后切成4 m的切片，加入无水乙醇进行脱水、二甲苯透明，加入苏木精染色6 min，流水洗涤后加入2%伊红2 min，依次加入无水乙醇和二甲苯脱水透明，然后中性封胶，在电子光学显微镜下观察收集图像。1.5统计学方法使用SPSS 23.0对实验数据进行统计分析，计量资料以“均数标准差”（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism 8.0进行数据可视化呈现。2结果2.1miR-335-5p在OP骨组织中低表达为探究OP患者的miR-335-5p表达是否存在差异性，通过对GSE93883表达谱芯片进行挖掘，包含6例骨密度正常样本，6例骨质疏松性椎体32023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2骨折患者样本，6例骨质疏松症非骨折患者样本。结果显示，与正常骨组织比较，miR-335-5p在OP样本中显著下调（P0.05）。（见图1）为进一步验证miR-335-5p与OP之间可能存在的关系，首先通过RT-qPCR检测患者骨组织样本中miR-335-5p的表达，发现与正常患者比较，OP患者骨组织中miR-335-5p低表达。（见图2）构建大鼠骨质疏松症模型，发现与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中miR-335-5p同样低表达。（见图3）收集OP患者BMSCs诱导成骨分化14 d后，发现miR-335-5p的表达随时间延长（第1天、第7天、第14天）逐渐上调。（见图4）上述结果表明，miR-335-5p与OP密切相关，并且在OP中低表达。注：与正常患者比较，aP0.001图 2RT-qPCR 检测人体骨组织中 miR-335-5p 的表达（xs，n=15）注：与假手术组比较，aP0.001图 3RT-qPCR 检测大鼠骨组织中 miR-335-5p 的表达（xs，n=8）注：与第1天比较，aP0.01；与第7天比较，bP0.001图 4诱导 BMSCs 成骨分化第 1、7、14 天 miR-335-5p 的表达（xs，n=3）2.2淫羊藿上调miR-335-5p治疗OP的基因及代谢通路通过数据库预测miR-335-5p的靶基因3 414个，OP相关作用靶点2 993个；并通过TCMSP数据库得到淫羊藿的作用靶点221个，三者交集基因40个，占淫羊藿总靶点数的18.1%（40/221）。（见图5）由此可见，淫羊藿在OP治疗中与miR-335-5p密切相关。利用交集基因进行富集分析，发现它们主要富集在PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路中发挥治疗作用。（见图6）IL6、FOS、VEGFA、MYC、ESR1、PTEN、PTGS2、CXCL8、MMP2等基因的连接度较高，并同时富集在多条信号通路中，其可能为药物活性成分主要结合靶点。（见图7）图 5淫羊藿、miR-335-5p 与 OP 的作用靶点韦恩图注：A.与骨密度正常骨组织比较，骨质疏松症非骨折患者骨组织中miR-335-5p低表达，aP0.05；B.与骨密度正常骨组织比较，骨质疏松性椎体骨折患者骨组织中miR-335-5p低表达，bP0.05图 1人体内 miR-335-5p 差异性表达火山图42023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2图 6蛋白互作网络图图 7KEGG 富集分析气泡图2.3ICA结合靶基因形成稳定化合物发挥治疗作用通过TCMSP数据库得到淫羊藿的主要活性成分23个。（见表1）淫羊藿主要活性成分为黄酮类物质，其中ICA最具代表性且含量较高，并作为质控成分被载入2020年版 中华人民共和国药典22-23。为进一步探究淫羊藿治疗OP的分子机制，本研究利用ICA与Hub蛋白进行分子对接（以结合能-5.0 kcal/mol作为筛选标准）。结果显示，ICA与蛋白小分子均可形成稳定的氢键。（见图8、表2）一般结合时产生的能量越低化合物越稳定，发生相互作用的概率越高，当结合能绝对值4.25kcal/mol时，提示活性程度一般；结合能绝对值5.0 kcal/mol时，提示结合活性较好；结合能绝对值7.0 kcal/mol时，则提示有强烈结合活性24。通过分子对接发现，ICA与多数Hub蛋白具有强烈结合作用，形成稳定化合物发挥治疗作用。表 1淫羊藿部分活性成分表分子ID成分名称OB（%）DLMOL000006木犀草素（luteolin）36.160.25MOL000098槲皮素（quercetin）46.430.28MOL000359谷甾醇（sitosterol）36.910.75MOL000422山奈酚（kaempferol）41.880.24MOL000622木兰素内酯（magnograndiolide）63.710.19MOL00151024-表氨基甾（24-epicampesterol）37.580.71MOL001645乙酸亚油酯（linoleyl acetate）42.100.20MOL001792DFV32.760.18MOL004373脱水淫羊藿苷（anhydroicaritin）45.410.44MOL004382淫羊藿A（yinyanghuo A）56.960.77续表1：分子ID成分名称OB（%）DLMOL004384淫羊藿C（yinyanghuo C）45.670.50MOL004386淫羊藿E（yinyanghuo E）51.630.55MOL004425淫羊藿苷（icariin）41.580.61MOL004427淫羊藿苷A7（icariside A7）31.910.86MOL003044金丝桃醇（chryseriol）35.850.27MOL004367橄榄树脂素（olivil）62.230.41图 8ICA 与靶点蛋白对接结果可视化呈现表 2ICA 与核心蛋白分子对接结果靶点分子对接结合能（kcal/mol）IL6-7.19FOS-8.24VEGFA-8.12MYC-7.20ESR1-6.68PTEN-6.72PTGS2-9.80CXCL8-8.22MMP2-8.27注：表格中数据为10次分子对接的均值2.4各组大鼠骨组织miR-335-5p的表达比较与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中miR-335-5p的表达明显下调（P0.01）；与模型组比较，淫羊藿苷组、miR-335-5p促进剂组和淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组大鼠骨组织中miR-335-5p的表达明显上调（P0.05）。（见图9）注：与假手术组比较，aP0.01；与模型组比较，bP0.001图9各组大鼠骨组织中miR-335-5p的表达比较（xs，n=8）52023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.22.5各组大鼠骨组织成骨标志基因相对表达量比较与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中的成骨标志基因（RUNX2mRNA、OPN mRNA）的表达被显著抑制，然而这种抑制作用经ICA和/或过表达miR-335-5p治疗后得到缓解；与模型组比较，淫羊藿苷组、miR-335-5p促进剂组和淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组大鼠骨组织中的RUNX2 mRNA、OPN mRNA表达明显上调（P0.05）。（见图10）注：与假手术组比较，aP0.05；与模型组比较，bP0.01图 10各组大鼠骨组织中成骨标志基因（RUNX2 mRNA、OPN mRNA）的表达比较（xs，n=3）2.6各组大鼠骨组织病理改变情况假手术组大鼠股骨骨小梁排列紧密规则；模型组和miRNA模拟物组大鼠股骨可见骨小梁稀疏且排列不规则，骨小梁数量明显低于假手术组，部分骨小梁变细出现断裂及较多空洞形成等骨质疏松症特征性表现；与模型组比较，淫羊藿苷组、miR-335-5p促进剂组和淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组大鼠骨质疏松症状得到缓解，骨小梁数量明显增多，骨小梁间无明显断裂，成骨细胞排列整齐，形态结构规整，成网状相连续，并可见少量新生骨组织形成。（见图11）3讨论骨质疏松症病因病机复杂，表现为足痛不能触地、腰背痛、脊柱弯曲、关节屈伸不利等，与中医的“骨痹”“骨痿”“骨枯”相似25。大多数医家认为其与肾精亏虚有关26。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨的功效。既往研究27发现，淫羊藿及其活性成分可促进成骨细胞的分化及增殖，提高ALP的表达，同时可抑制破骨细胞的分化，抑制骨吸收，减少骨量的丢失。另有研究28-29发现，一定浓度的ICA可促进BMSCs的增殖和成骨基因的表达。研究30表明，在糖尿病性骨质疏松症中，miR-335-5p的过表达可抑制高糖诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡。这表明miR-335-5p可能与OP有直接的调节关系。本研究发现，miR-335-5p在OP患者和OP大鼠的骨组织中低表达，成骨诱导培养BMSCs 14 d后促进了miR-335-5p的表达。HUANG M等31研究发现，ICA可增加骨量，从而改善OP。HU J H等32研究表明，ICA可能是通过促进负调控因子G13的表达，从而抑制其下游Akt-GSK3-NFATc1信号通路来抑制破骨细胞形成，而且ICA还可以通过增加DEC1的表达来预防糖皮质激素诱导的OP，但具体的调节机制尚不清楚。本研究证实了ICA能通过上调miR-335-5p促进BMSCs成骨分化缓解大鼠绝经后骨质疏松症。本研究发现，淫羊藿治疗OP具有多靶点、多通路的特点，主要参与PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路，发挥治疗作用。淫羊藿可通过ICA-miR-335-5p轴促进BMSCs成骨分化缓解大鼠绝经后骨质疏松症，为中药单体治疗OP提供了新思路，对中医药运用于OP的预防与治疗具有重要意义。但中药单体可以通过多种miRNA发挥调控作用33-34，它们的表达之间是否存在相互影响尚不清楚。未来的研究可尝试研究miR-335-5p与这些miRNA之间的潜在相互作用及作用途径。成骨基因相对表达量miRNA模拟物组miR-335-5p促进剂组淫羊藿苷+miR-335-5p促进剂组假手术组模型组淫羊藿苷组图 11 各组大鼠股骨近端干骺端骨组织病理切片图（HE，100）62023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2（下转第13页）参考文献1 乙胜，付琳，李占明，等.益精调血法对绝经后骨质疏松症患者骨转换标志物的影响J.系统医学，2019，4(24)：4-7.2 刘晨，李兴勇，姚兴璋，等.绝经后骨质疏松症的流行病学概况及发病机制研究进展J.中医正骨，2018，30(3)：52-55，58.3 史晓林，吴连国，刘康.绝经后骨质疏松症(骨痿)中医药诊疗指南(2019年版)J.中医正骨，2020，32(2)：1-13.4 王可可，李思淼，罗婕，等.骨质疏松症临床实践指南评价及药物综合价值研究J.中国医院药学杂志，2020，40(1)：91-98.5 冯皓，张斌，王建平.骨髓间充质干细胞移植可提高骨质疏松大鼠骨代谢水平J.中国组织工程研究，2023，27(1)：72-75.6 杜丽坤，李佳睿.骨质疏松症的中医认识及防治J.中国骨质疏松杂志，2022，28(2)：296-299.7 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