BJS201705食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定.doc

附件1

食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定
BJS 201705
1 范围
本方法规定了食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱-串联质谱的测定方法。
本方法适用于液体乳、稀奶油、婴幼儿配方乳粉（不包括特殊医学用途的婴幼儿配方乳粉）、婴幼儿谷类辅助食品、谷物碾磨加工品、植物油脂等食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定。
2 原理
样品经乙腈提取后，再以正己烷除脂净化，高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，外标法定量。
3 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇（CH4O）：色谱纯。
3.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。
3.1.3 甲酸（CH2O2）：色谱纯。
3.1.4 正己烷（C6H14）：色谱纯。
3.1.5 氯化钠（NaCl）：在550℃灼烧4h后备用。
3.1.6 0.1%甲酸水溶液：量取10mL甲酸并加入水定容至1000mL。
3.2 标准品
香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素标准品纯度≥98.0%，中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量和结构式等信息详见附录A表A.1。
3.3 标准溶液配制
3.3.1 标准储备液（1.00mg/mL）：分别称取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素0.1g
（精确至0.0001g）标准物质于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。避光于-18℃下保存，保存期为6个月。
3.3.2 混合标准储备溶液：分别吸取上述三种标准储备液1.00mL于同一100mL容量瓶中，用乙腈
稀释到刻度配制成浓度为10μg/mL的混合标准储备溶液，避光于-18℃保存，保存期为1个月。
3.3.3 空白基质溶液：按照6.1规定的前处理方法操作制备空白基质溶液。
3.3.4 基质混合标准系列工作液：分别准确吸取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素混合标准储备
液适量(3.3.2)，用空白基质提取液（3.3.3）将其稀释为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL标准系列工作溶液，临用时配制。
4 仪器和设备
4.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。
4.2 涡旋混合器。
4.3 超声波清洗器。
4.4 离心机：转速≥5000r/min。
4.5 分析天平：感量0.1mg和0.01g。
5 试样制备
婴幼儿谷类辅助食品、谷物碾磨加工品需粉碎混匀，使其全部可以通过425μm的标准网筛；其它样品无需特殊制备。
6 分析步骤
6.1 样品的制备与提取
6.1.1 婴幼儿配方乳粉、婴幼儿谷类辅助食品：称取1g样品（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入3mL水，涡旋振荡30s，加入7mL乙腈（3.1.2），涡旋振荡30s，超声处理25min，10000r/min离心5min后，取上层清液2mL于10mL玻璃离心管中，加入1mL正己烷（3.1.4），涡旋混合30s，5000r/min离心3min后，取下层清液，过滤膜（0.22μm，有机相），待分析。
6.1.2 液体乳（巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳等）、稀奶油：称取2g样品（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL乙腈（3.1.2），涡旋振荡30s，超声处理25min，加入1g氯化钠（3.1.5），10000r/min离心5min后，取上层清液2mL于10mL玻璃离心管中，加入1mL正己烷（3.1.4），涡旋混合30s，5000r/min离心3min后，取下层清液，过滤膜（0.22μm，有机相），待分析。
6.1.3 谷物碾磨加工品（大米等）：称取1g样品（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入3mL水，涡旋振荡30s，加入7mL乙腈（3.1.2），涡旋振荡30s，超声处理25min，10000r/min离心5min后，取上层清液过0.22μm滤膜（4.6），待分析。
6.1.4 植物油脂：称取1g样品（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加入1mL水和10mL乙腈（3.1.2），涡旋振荡30s，超声处理25min，加入1g氯化钠（3.1.5），10000r/min离心5min后，取上层清液2mL于10mL玻璃离心管中，加入1mL正己烷（3.1.4），涡旋混合30s，5000r/min离心3min后，取下层清液，过滤膜（0.22μm，有机相），待分析。
6.2 仪器参考条件
6.2.1 色谱条件
a) 色谱柱：XDBC18柱，4.6mm×50mm，1.8mm，或性能相当者。
b) 流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脱条件见表1。
c) 流速：0.3mL/min。
d) 柱温：30ºC。
e) 进样量：2µL。
表1梯度洗脱条件
时间（min）
A相（%）
B相（%）
0
75
25
0.5
75
25
2
50
50
6
50
50
7
10
90
9
10
90
12
75
25

6.2.2 质谱条件
f) 离子源：电喷雾离子源。
g) 扫描方式：正离子扫描(ESI+)。
h) 检测方式：多反应监测(MRM)。
i) 离子化电压、雾化气、辅助气、气帘气压力、雾化温度应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对及其他质谱参数见附录B中表B.1。
6.3 测定
6.3.1 标准曲线的制作
用混合标准系列工作溶液(3.3.4)分别按仪器参考条件（6.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
6.3.2 定性测定
在相同试验条件下测定样品和基质混合标准工作溶液，记录样品和标准工作溶液中目标物的保留时间。若样品中检出与基质混合标准溶液（3.3.4）中待测物保留时间一致的色谱峰，且其定性离子与浓度相当的标准溶液中相应的定性离子的相对丰度相比偏差不超过表2规定的范围，则可以确定样品中检出相应的待测物。
表2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/%
＞50
20～50
10～20
≤10
允许的相对偏差/%
±20
±25
±30
±50

6.3.3 定量测定
将样品溶液（6.1）按仪器参考条件（6.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积，根据标准曲线查得待测液中各组分的浓度。样品中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出线性范围，则重新取样分析，用乙腈稀释到适当浓度后测定。混合标准工作溶液的高效液相色谱-串联质谱MRM色谱图参见图C.1。
7 结果计算
按下式（1）计算样品中单种目标化合物的含量：

……………………………………(1)
式中：
X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每升（μg/L）；
m——样品称取的质量，单位为克（g）；
V——样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后一位。
8 检测方法的灵敏度、准确度、精密度
8.1 灵敏度
当液体乳称样量为2g，植物油脂、稀奶油、谷物碾磨加工品、婴幼儿配方乳粉、婴幼儿谷类辅助食品称样量1g时，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检出限为30.0μg/kg，定量限为100.0μg/kg。
8.2 准确度
本方法婴幼儿配方乳粉、液体乳、植物油脂、稀奶油、谷物碾磨加工品、婴幼儿谷类辅助食品在100.0~1000.0μg/kg添加浓度范围内回收率为78.6%~118.4%。
8.3 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差不得超过算数平均值的10%。

附录A
香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素三种化合物相关信息

表A.1 中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量和结构式
名称
英文名
CAS
分子式
相对分子质量
结构式
香兰素
Vanillin
121-33-5
C8H8O3
152.14

甲基香兰素
Methylvanillin
120-14-9
C9H10O3
166.17

乙基香兰素
Ethylvanillin
121-32-4
C9H10O3
166.17

附录B
参考质谱条件

质谱参数：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描(ESI+)；
c)检测方式：多反应监测(MRM)；
d)离子化电压(IS)：5500V；
e)雾化气(Gas1):50psi
f)辅助气(Gas2):50psi
g)气帘气压力(CUR)：35psi；
h)雾化温度(TEM)：500℃；
i)定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表B.1。
表B.1 三种化合物的定性离子对、定量离子对和质谱分析参数
序号
分析物
离子对
m/z
去簇电压
V
碰撞能量
eV
入口电压
V
出口电压
V
1
香兰素
153.1/93.1*
90
19
10
13
153.1/125.0
90
14
10
13
2
甲基香兰素
167.2/139.0*
100
17
10
13
167.2/124.0
100
25
10
13
3
乙基香兰素
167.2/111.0*
90
17
10
13
167.2/93.0
90
23
10
13
*：定量离子
注：附录B所列参考质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。附录C
香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的标准色谱图

图C.1 香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素标准物质的MRM色谱图

本方法负责起草单位：大连市食品检验所。
本方法的参与验证单位：中国食品药品检定研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、上海食品药品检验所、深圳出入境检验检疫局检验检疫技术中心、辽宁出入境检验检疫局技术中心。
主要起草人：曲宝成、张敬波、宁霄、王浩、迟秋池、张毅