反相离子对高效液相色谱法测定铁强化酱油中的乙二胺四乙酸铁钠.pdf

!#年$月!#$%&!#色谱!#$%&%()*$+,(-!*(.+/(0*+12()*!%+(*$&(#$收稿日期：!&,$,$第一作者：魏)峰，男，硕士，-.)：（$）*$*!*，/,01)：2.#1+3(4$*5(0*通讯联系人：霍军生，男，研究员，-.)：（$）*$*!&$*反相离子对高效液相色谱法测定铁强化酱油中的乙二胺四乙酸铁钠魏)峰，)李文仙，)黄)建，)霍军生，)孙)静（中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京$&）摘要：建立了用 反 相 离 子 对 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 和 测 定 铁 强 化 酱 油 中 的 铁 营 养 强 化 剂 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 钠（+6./7-8）的方法。样品经甲醇沉淀后，以 9(%:;甲 醇、-$*四丁 基氢氧化铵（-?8A）和-&!甲 酸 的 水 溶 液（BA*-&）作 为 流 动 相，流 速 为$-0CD 01#，检测波长为!&%#0，整个分离过程在*01#内完成。考察了+6./7-8 在不同品牌酱油中的回收率，其中+6./7-8 的添加量为-&(%-ED C 时，其回收率为.%-$&($-&。对+6./7-8 添加量为!-ED C的铁强化酱油样品重复测定#次，其峰面积的相对标准偏差为-.。+6./7-8 标准溶液的最低检测限为-*0ED C。本方法简单、快速、重现性好，可用于铁强化酱油中+6./7-8 含量的检测。关键词：反相离子对高效液相色谱法；乙二胺四乙酸铁钠；铁强化酱油中图分类号：#&)文献标识码：8)文章编号：$,/$*（!#）$,&,%)栏目类别：研究论文!#$%&(#&)*+),&-%.$)（!）/#012,&(%&#$(3#(#&.$)45)$#&*&,+)1+(-3 61 78$9,4:0(9.)4:(&$;&-&,?0$)%(#)$(01F/G 6.#E，CG F.#;1#，AH8+I!1#，AH!$#34.#E，JH+!1#E（!#$%$&$()*&$+%$%(,-.(-/,)$0，12%#1$+)(+3%#,#1($+(4,-5+6$%(，7%8%9!#，12%,）A69#$(3#：8#(K.)%.K.%3.=,B43.1(#,B1%41E4 B.%L(%0#5.)1M$1=54%(0N(E%B415 0.N4(=O3=.K.)(B.=L(%3.B%N1(#=.N.%01#N1(#(L 3(=1$0 1%(#（）.N4&).#.=101#.N.N%,5.NN.（+6./7-8）1#1%(#,L(%N1L1.=3(&3$5.*J0B).N%.N0.#N#=54%(0N(E%B415 5(#=1,N1(#3 O.%.1#K.3N1EN.=*8LN.%B%.51B1NN1(#:&0.N4#()，N4.30B).O3 3.B%N.=(#9(%:;（KD K）0.N4#()3()$N1(#5(#N1#1#E-$*（KD K）N.N%:$N&)00(#1$0 4&=%(;1=.#=-&!（KD K）L(%015 51=（BA*-&）*+6./7-8 O3=.N.5N.=N!&%#0*-4.3.B%N1(#O3 541.K.=O1N41#*01#O1N4 L)(O%N.(L$-0CD 01#*8#1%(#,L(%N1L1.=3(&3$5.30B).5(#N1#1#E!*ED C+6./7-8 O3#)&P.=L(%#N10.3，#=N4.%.)N1K.3N#=%=.K1N1(#（QJ7）(L B.2%.3(L+6./7-8 O3-.*-4.%.5(K.%1.3(L+6./7-8%#E.=L%(0.%-$&N($-&O1N4N4.3B12.=0($#N3(L-&0%-ED C*-4.=.N.5N1(#)101N(L+6./7-8 3N#=%=3()$N1(#O3*0ED C*-413 310B).#=%B1=0.N4(=O1N4 E(=%.B%(=$51:1)1N&5#:.$3.=L(%N4.=.N.%,01#N1(#(L+6./7-8 1#1%(#,L(%N1L1.=3(&3$5.*B1 C)$,9：%.K.%3.=,B43.1(#,B1%41E4 B.%L(%0#5.)1M$1=54%(0N(E%B4&（QGARC）；3(=1,$0 1%(#（）.N4&).#.=101#.N.N%5.NN.（+6./7-8）；1%(#,L(%N1L1.=3(&3$5.)铁营养的缺乏是目前全球最严重的营养问题之一，食用铁强化酱油是改善铁营养状况的有效途径$。用于 铁 强 化 酱 油 的 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 钠（+6./7-8）是一种性质稳定的络合型铁强化剂，其生物利用率高，不易受食物中铁吸收抑制因子的影响，对食物载体的色泽、口感等感官指标的影响较小，被 认 为 是 目 前 最 具 发 展 前 景 的 铁 营 养 补 充剂!。目前还没有一种直接测定酱油中+6./7,-8 含量的方法，因此建立一种准确的直接测定酱油中+6./7-8 含量的方法对铁强化酱油的质量控!第 期魏!峰，等：反相离子对高效液相色谱法测定铁强化酱油中的乙二胺四乙酸铁钠制和市场监测具有非常重要的意义。!离子对高效液相色谱法主要用于酸、碱、离子型化合物及带有多个可电离基团化合物的分析，近年来得到了广泛的应用#。!#$%&(为#$#$与乙二胺四乙酸（%&(）所形成的螯合物的钠盐，在溶液中通常以!$和#$%&(%形式存在&，因此可以应用离子对色谱法对#$%&(%进行分离和检测。目前已有采用反相离子对高效液相色谱法对#$%&(%进行分析的报道()，但在)*+$,等*的方法中#$%&(%的出峰时间短，且与其他待测物有重叠的现象，分离效果比较差；!-.+/等，)的方法所分析的样品主要为河水或自来水，组成相对简单，样品中几乎没有其他杂质的干扰。而铁强化酱油成分十分复杂，其中氨基酸、多肽、有机酸、蛋白质等可能影响检测的干扰物也较多。因此并不能直接应用上述方法对酱油中的!#$%&(进行检测。本文考察了样品的前处理方法和色谱条件对!#$%&(测定的影响，以期建立一种分离和测定!#$%&(的有效方法。!实验部分!仪器与试剂!01$23*+型高效液相色谱分析 仪、01$23,&-)可变波长紫外检测器及%45-.$2 色谱工作站；678875-2$公司超纯水仪；上海飞鸽牌离心机；9:;$23+,+型酸度计；01$23 公司#4)9-固相萃取柱及装置。!#$%&(标准物（三水物）和&+?）水溶液购自美国 7A4 公司。甲醇为色谱纯；盐酸、!?等试剂为优级纯；甲酸及其他试剂均为分析纯。各种品牌酱油及铁强化酱油购自当地市场。实验用水均为经 67887BC 超纯水装置过滤的超纯水（-.,6!+4）。实验用的所有溶液在进样分析前均用+.&4 微孔滤膜过滤。本实验所有操作均在避光条件下进行。!#实验方法!#!#$%&(标准溶液的制备!准确称取!#$%&(标准物,+.+4A，用水溶解、转移至+4)容量瓶中定容，制成质量浓度为,.+AD)的!#$%&(标准储备溶液，备用。吸取!#$%&(标准储备溶液,.+4)置于+4)容量瓶中，用)（体积分数）的甲醇溶液定容，摇匀；再分别吸取上述溶液+.，+.，.+，,.+，&.+，*.+，-.+，+.+4)分别置于+4)容量瓶中，用水定容，摇匀，便得到!#$%&(质量浓度为+.,(,+4AD)的标准工作溶液。!#!#铁强化酱油样品的处理!甲醇沉淀法-：吸取铁强化酱油,.4)置于+4)容量瓶中，用)（体积分数）的甲醇溶液定容，摇匀。于避光处静置+47,后过滤，吸取滤液.+4)置于+4)的容量瓶中，用水定容，摇匀。!固相萃取法：吸取铁强化酱油,.4)置于+4)容量瓶中，用 5?#.的+.*（体积分数）的甲酸缓冲溶液定容、摇匀。以+2D 47,离心+47,，取上清液.+4)，用+.&4 微孔滤膜过滤后，进固相萃取柱（事先用#4)甲醇进行活化，再以 4)水冲洗）。然后用&(4)水对萃取柱进行洗涤，将滤液与清洗液合并，移至+4)容量瓶中定容，摇匀。!#!$色谱条件!色谱柱：E-2;F 9-（+44/&.*44 7.GH，4），柱前装有 9-保护柱（+44/&.*44 7.G.，4）；流动相：含,.（体积分数）甲醇、+.#?）和+.+,（体积分数）甲酸的水溶液（5?值为#.）；流速：.+4)D 47,；柱温：,I；紫外检测波长：,&,4；进样量：,+)；分离时间：#+47,。#结果与讨论#!样品前处理条件的选择!本实验对甲醇沉淀法和固相萃取法对酱油样品图!#$%&()标准溶液和陶大纯鲜未强化酱油的色谱图$*+!,-./0#1/+.#02/3#$%&()21#45#.5 2/671*/4#45(#/5#743/.1*3*%5 2/8 2#79%E-2;F 9-+-8*4,；4-;78$5J3$，+（KD K）4$1J,-8 3-B8*17-,+-,17,7,A+.,?）,G+.+-（KD K）L-247+7G 3-8*17-,（5?#.）；+-8*4,1$45$21*2$，,I；7,M$+17-,，,+)；G$1$+17-,.K$B8$,A1J，,&,4H!H 3-:3*+$3458$52$+75711$G;:4$1J,-8；;H 3-:3*+$3458$L781$2$G;:3-87G 5J3$F12+17-,+-8*4,H+H+4AD)!#$%&(31,G2G 3-8*17-,H的净化效果进行了比较，结果见图。甲醇沉淀法利用)的甲醇使酱油样品中的蛋白质等大分子变性沉淀，而!#$%&(则溶解在甲醇溶液中，样0色谱第!卷品经过滤后可以得到净化。在固相萃取法中，样品需先用酸性缓冲溶液稀释，然后经离心去除杂质，这样可以减少样品中的杂质含量，避免固相萃取柱因吸附样品杂质过多而过载。样品经离心后取上清液#!进萃取柱，样品中的一些大分子和非极性物质均可被固相萃取柱吸附，而#$%&($则不被保留直接流出，再用%&!水对萃取柱进行冲洗将#$%&($完全冲出。实验结果表明采用两种方法处理的空白样品在#$%&($的出峰时间处均没有明显干扰物。经过固相萃取的样品色谱图中的杂质峰少于用甲醇沉淀法净化的样品，但二者在组分出峰时间处的基线没有显著差异。从成本因素考虑，选用甲醇沉淀法作为样品的前处理方法。!色谱条件的优化在反相离子对色谱中，流动相的)*值、离子强度、有机溶剂的种类、比例及离子对试剂的种类和浓度都将影响分离的选择性(。本实验对流动相的组分进行了优化。!#流动相)*值的选择实验发现)*值对+,#$%&(的峰面积影响较小，但在)*)*&以上时#$%&($的色谱峰拖尾严重。这可能是因为在中性条件下，有部分#$%&-($在 流 动 相 中 发 生 水 解 反 应 以 阴 离 子#$%&-(.*$!的形式存在，引起组分的保留性质发生变化。铁强化酱油样品经过处理后仍含有大量杂质，其中一些氨基酸和多肽等都在!&/!处有吸收，可能会对+,#$%&(的测定产生干扰。而在流动相小于其等电点的酸性条件下，氨基酸和多肽以阳离子形式存在，其保留值降低，保留时间甚至接近于死时间。而#$%&($因为离子对试剂的存在，保留时间延长。酱油样品随着流动相)*值的降低，#$%&($的出峰时间（#+*,!0/）附近的干扰峰越来越少。从八味庄酱油的色谱图（见图!）可以看出，在流动相)*,*+时-%#!0/处的杂峰要比)*+时少。但珍极、海天等酱油在)*,*+时在#$%&($的出峰时间处恰好有一小干扰峰，而在)*,*&时此干扰峰后移。因此本实验最终确定流动相的)*值为,*&，此时不同品牌的未经强化的酱油样品的色谱图基线较稳定。!流动相组分的选择本 实 验 用 水-甲 醇 混 合 体 系 作 为 流 动 相，在1(.*的体积分数为+*!2，)*,*&的条件下，考察了甲醇含量（体积分数）对组分保留因子（!）的影响。如图,所示，当甲醇含量增加时流动相的洗脱强度增加，组分的!值降低，保留时间减少。这样不图!未强化八味庄酱油在不同#值时的色谱图$%&!()*+,-*&),+.*/0,12%3(4,5&45/*)-%/%26.*7.,482%5 6%/2)25-#,3!4506$)7,8$)*,3+；53!4506$)7,8$)*+；497$:;4/0904/8,:$97$8,!$,8 0/#0=3#3图$流动相中甲醇含量对!值的影响$%&!$95/:42582*/+2-(,5*:8*5-25-*5-(2)2-25-%*5/,8-*)*/;,$2?仅可以缩短分析时间，还可以改善组分的峰形；但如果流动相中甲醇含量过大，会因被测组分与前面的杂质峰的分离度减小，引起组分出峰时间处的基线噪声波动增大，而影响实验的准确性。图%流动相中 0?#含量对保留因子的影响$%&!%95/:42582*/0?#8*5-25-*5-(2)2-25-%*5/,8-*)*/;,$2?应用离子对色谱法分析阴离子时，常将季铵盐类化合物作为离子对试剂加入到流动相中，使其与待测离子结合，生成不带电荷的离子对配合物吸附于固定相中。在实验中以 1(.*作为离子对试剂，结果发现流动相中离子对试剂的含量对组分的!值 有 显 著 影 响。如 图 所 示，在)*,*&、含#!*&2 甲醇、用甲酸溶液调节)*值的流动相中，组+)!第 期魏!峰，等：反相离子对高效液相色谱法测定铁强化酱油中的乙二胺四乙酸铁钠分的!值随着离子对试剂含量的增加而降低，这与!#$%&等#的报道基本一致。!值的变化与流动相的离子强度的变化有关。当离子对试剂的含量增大时，溶液离子强度也相应增大，流动相中的阴离子对样品阴离子与离子对试剂结合的竞争作用增强，因此组分的!值降低。!综合考虑以上两种因素，本实验选择流动相中()*+的体积分数为$%&,，甲醇为%(,，此时在海天铁强化酱油的色谱图中-$./)与前后两个杂质峰的分离度分别为&%*和&%+（见图(）。图!（!）海天草菇老抽铁强化酱油与（）空白酱油的色谱图#$%&!()*+!,*%)!+-*.（!）/!$,$!0!*%12!*3(*1$)*04.*),$.$56!06（）10.*),$.$56-*7-!135-01234$56&7$：%(,8$96&%14，$%&,()*+，$%$(,:1;83#&#3 714931%，196$;#1%?&-$./)#1%#$%9;&931%3%3;1%:1;93:3$C&854$7 D$;$5;$#3539&9$#&$样品测定的回收率、重现性及最低检测浓度#&$&%标准曲线的绘制!在所选实验条件下对不同浓度的?&-$./)标准溶液进行测定。结果表明，?&-$./)标准溶液的质量浓度为$%,$8=B!时，峰面积 （$-8E7）与质量浓度#（8=B!）的线性关系良好，回归方程为 .%-*/$-#（$.$%000 0）。根据 F(+#$00#（食品添加剂使用卫生标准），?&-$./)在铁强化酱油中的添加量为%+(,%$=B!，经处理后对应的?&-$./)溶液的质量浓度为*%+(,$%(8=B!，处于本方法的线性范围以内，因此该法适用于铁强化酱油中?&-$./)含量的检测。#&$&#不同品牌铁强化酱油样品的回收率!由于不同酱油间成分可能存在较大差异，因此本文考察了?&-$./)在不同品牌酱油中的回收率，其中?&-$./)的添加量为$%($,-%$=B!，测定结果见表。?&-$./)在不同品牌酱油中的回收率为 0-%(,$%(,，平均回收率为 0+%+,，相对标准偏差为%$-,。#&$&$样品测定的重现性及最低检测浓度!在实验条件下，对?&-$./)添 加 量 为%$表%8!#59:;5)$5-*.8!#59:;$0 6$.5)50,-*7-!135-C&854$2;&%)$B（=B!）-1%$*0#0-*$!3J3%J3$0+#0*$F1%=J3$0&0#(K$36&18$3$0+00*0(L6$%J3$*$-!&1#&34&1#61$*&0-(CA3M3&%$&$(L638$3I6&3$0$0($(+$93&%N&%$0&*0#0$0$3J3&$(0$3D$3M3&%-$&00+*&1$O3%763$($-+-0-*$=B!的铁强化酱油样品重复测定#次，其峰面积的相对标准偏差为$%*0,。?&-$./)标准溶液的最低检测限为$%$&8=B!（%&.&）。#&不同品牌铁强化酱油中 8!#59:;(+，-(&，*-，-0-，$，+#*，$(，$和$=B!。参考文献：!P6$%O%763，L6&1 Q3&%:$%=，L6&%=Q3%，R3%C63&%，S3&1O3&%6&，+1 O%76$%=，R(1，T?3%=，!T343&%=，K&%=C376%O1;%&4 1:+A=3$%$G$7$&;#6（陈君石，赵显峰，张馨，荫士安，朴建华，霍军生，于波，曲宁，卢启良，汪思顺 卫生研究），$&，&（C554）：0!+1 O%76$%=，R(1，03&1+1%=，!P6$%=U3&%-1;$3=%0$国外医学卫生学分册），000，#（(）：#0&!C%RU3%=01$;%P6;18&91=;&563#0$961&%V97)5543#&931%3%0$($3J3%=：S$154$7 0$现代色谱法及其在医药中的应用 北京：人民卫生出版社），00*-*-!W&;3-F，+34=$;C X，P&%1%3#&C.%H3;1%C#3$#6%14，00(，0（-）：$*(!?1D&#N(，W&;3-F，+34=$;C X，C3=!)%&4 P6$8，00#，#*（&）：(#!#$%&O O，(&;&N S，+$;%&%O P6;18&91=;)，00#，+（）：(&+!?3;$4 S 0，S&;1 S.，!&%K&9$;G$7，00*，&（）：&#(*!+&%=O3&%，+1 O%76$%=O1;%&4 1:+A=3$%$G$7$&;#6（黄建，霍军生 卫生研究），$&，&（C554）：#$0!R C6343%+3=6 S$;:1;8&%#$!3U3 P6;18&91=;&563#8$961&%($3J3%=：P6$83#&4 V%高效液相色谱方法及应用 北京：化学工业出版社），$0(#