微生物的大小测定与显微计数实验报告.docx

微生物的大小测定与显微计数实验报告
生14 孙晓川 2011011983
一、实验目的：
1、了解血球计数板的构造和使用方法，并掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。
2、学习用显微测微尺测量酵母细胞的大小，对微生物大小形成一种直观的认识。
3、学习灭菌技术及注意事项。

二、实验原理：
⑴ 显微镜直接计数法：
计数室
血球计数板是一块比普通载玻片厚得多的玻璃片，其上由四条平行槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室。
计数室的长宽各为1 mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。计数室有两种规格。一种是16X25型，共有16个大格，每个大格又分为25个小格。另一种是25X16型，共有25个大格，每个大格又分成16个小格。应用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。再换算成每ml菌液中微生物细胞数量。

⑵ 测微尺测酵母菌大小：
目镜测微尺（如下图）是一块放入目镜中的圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等份，或把10mm刻成100等份，用于测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不同，目镜测微计每格实际表示的长度也不一样，因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度。然后根据微生物相对于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格为0.01mm。

三、实验器材、用具及材料：
实验用具：载玻片、盖片、200µ l移液器及tip、擦镜纸、 装有蒸馏水的洗瓶
实验仪器：普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器
菌种：酿酒酵母

四、实验步骤：

①微生物数量的测定：（稀释10倍）
1、用酒精棉球将计数板擦净。
2、加样品：
在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片，再把吸有稀释并振荡均匀的酵母菌液的细口滴管对准盖玻片边缘，轻挤滴头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。注意不可有气泡 。
3、将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(X40)观察。若酵母细胞只往某一方向流去，表明载物台没有水平，需调水平直到菌液不往某一方向流动为止，注意在显微镜下是“水往高处流”。（由于实验台面水平，因此这种情况几乎不会出现。）静置1分钟后进行计数。计数前注意要调节聚光器位置，以使酵母细胞和计数室能被同时看清。
4、重复上述步骤，测量10组数据，取平均值。
5、使用完毕后，马上将血球计数板用酒精棉球擦净，之后斜置晾干。

②酵母菌大小测定：
1、目镜测微尺的校正：
将镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，逐步转换目镜，直至最后在油镜中看清镜台测微尺的刻度。看清刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行。利用镜台移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，记录两重合刻度之间之间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。
2、细胞大小的测定：
将稀释到适宜浓度的少量酵母菌培养液涂在载玻片上（不是镜台测微尺上）。盖上盖玻片，最后用油镜观察。转动目镜，使目镜测微尺位于酵母细胞的长轴或短轴上，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格（估计到小数点后一位）。取10~20个菌体，算出平均值。
注意要按随机的顺序选取各种大小菌体进行测量，不能只挑大的细胞测量。

五、实验结果：

用血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果（稀释25倍）
试验次数
各中格中菌数
总菌数
平均值
菌数个/ml
左上
左下
右上
右下
中
1
17
10
17
17
20
81
94
1.175×108
2
27
25
10
10
14
86
3
21
25
34
10
20
110
4
16
21
16
17
24
94
5
14
7
36
24
22
103
6
16
21
22
31
20
110
7
6
14
38
19
19
96
8
15
16
13
21
14
79
9
7
20
16
16
14
73
10
20
35
12
14
28
107

酵母菌细胞数/ml＝80小格内细菌细胞数/80×400×104×稀释倍数（25）

目镜测微尺标定结果
物镜倍数
目镜（10×）
目镜测微尺格数（小格）
镜台测微尺格数（小格）
目镜测微尺每格长度（μm）
100×
38
4
1.05

酵母菌大小测定结果
菌号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
目镜测微尺格数（长轴）
7.5
8.0
7.2
10.1
5.0
7.1
9.4
6.4
9.3
7.2
目镜测微尺格数（短轴）
5.1
5.0
6.2
7.5
4.9
5.1
7.0
5.3
6.5
5.2
菌号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
目镜测微尺格数（长轴）
9.1
8.1
9.2
5.1
4.1
5.9
5.2
4.8
8.1
7.9
目镜测微尺格数（短轴）
6.9
6.1
7.4
4.8
3.8
4.2
5.2
3.4
9.4
5.5

酵母菌长轴平均值（μm）=7.235×1.05＝7.60
酵母菌短轴平均值（μm）=5.725×1.05＝6.01
酵母菌平均大小：（6.81±0.80）μm

六、实验讨论：
1、注意事项：
⑴ 在测量酵母菌大小的时候，光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜或油镜校正时，务必小心，以防物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。
⑵若换了不同的目镜或物镜，要重新标定目镜测微尺和物镜测微尺。
⑶酵母菌培养液要涂在载玻片而不是镜台测微尺上。
⑷做细胞计数试验时，在取样之前要先震荡摇匀。加样时，要避免气泡夹在盖玻片与计数板间。
⑸制作简单装片时，盖上盖玻片后，不要用吸水纸去擦拭，否则会在上面留有大量纸屑，影响观察。
2、目镜测微尺上的小格过密，很难分辨清楚，因此所得的数据与实际情况相比可能会有比较大的偏差。
3、血球计数板的误差主要来自哪些方面？如何减少误差力求准确？
答：我觉得造成误差的主要原因有：a）取样前未充分摇匀，致使所取样品的细胞浓度与原样品中的细胞浓度有差异。b）所加液体并未完全覆盖计数室，或是其中含有气泡。
C）计数时的标准不统一（哪两条边计数时算在内，多大的酵母菌才被记作一个细胞）
d) 计数时有漏数，或重复数的情况出现。
如果能避免以上错误，误差应该能大大减小。
4、显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗?
答：我觉得理论上是不会的。因为在放大倍数一定的情况下，显微测微尺上刻线间的距离由镜台测微尺测出的，所以只要镜台测微尺刻度准确，测量值就应该是准确的。但实际上，显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到我们的估读，使读数误差发生改变，并最终影响到实验结果的精确程度。
5、假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量 。V酵母=4πabc/3(a=b为半短轴，c为半长轴）。
答：V酵母=4×π×7.60×6.01×6.01＝3.45×103μm3
6、如何区分镜台测微尺的正反面？
答：其上有“重庆”两个字。从正面看字是正的，从反面看字是反的，可依此来进行判断。
7、能用显微测微尺粗测出酵母细胞壁厚度吗?
答：我觉得不可以。测量细胞大小时，我观察到酵母菌的荚膜十分薄，小于了测微尺的分度值，很难测出可信的值。