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血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙...测在肝细胞肝癌中的临床价值_赖蜜.pdf

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资源描述

1、第 42 卷 第 12 期2022 年 12 月Vol.42 NO.12DEC.2022赣南医学院学报JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY投稿网址:http:/血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值赖蜜,胡蝶,王晓玲,钟田雨(赣南医学院第一附属医院检验科,江西 赣州 341000)摘 要:目的:探讨血清甘胆酸、甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP)和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的关系及对肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)诊断的意义。方法:收集2020年12月2022年

2、2月在我院诊疗的HCC患者200例,分为乙肝肝癌组(100例)和非乙肝肝癌组(100例)。采用免疫比浊法检测血清甘胆酸、双抗体夹心法检测血清AFP、PCR-反向点杂交法检测HBV前C区/BCP区突变,通过SPSS 22.0软件进行联合分析。结果:乙肝肝癌组的血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组的血清AFP(P0.05);在乙肝肝癌组中,HBV基因突变组血清AFP高于HBV基因未突变组(P0.05),其中BCP区突变组AFP水平高于BCP区未突变组(P0.05)。结论:血清AFP水平与HCC类型和HBV突变类型有潜在相关性,对HCC的发病机制了解和诊断有重大参考价值。关键词:肝细胞肝癌;甘胆酸;甲

3、胎蛋白;乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变中图分类号:R735.7,R446.62 文献标志码:A 文章编号:1001-5779(2022)12-1227-05 DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2022.12.001开放科学(资源服务)标识码(OSID):Clinical value of serum cholyglycine,AFP combined with mutation detection of hepatitis B virus pre-C region/BCP region in HCCLAI Mi,HU Die,WANG Xiao-ling,ZHONG

4、Tian-yu(Laboratory Department,The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou,Jiangxi 341000)Abstract :Objective :To explore the relationship between cholyglycine,AFP and mutations in the pre-C region/BCP region of hepatitis B virus,and its significance in the diagnosis of hepatoc

5、ellular carcinoma(HCC).Methods :From December 2020 to February 2022,a total of 200 cases with HCC in our hospital were divided into hepatitis B group(100 cases)and non-hepatitis B group(100 cases).Immunoturbidimetric method was used to detect cholyglycine,double anti-body sandwich method to detect A

6、FP,PCR-reverse dot blot to detect the mutation of HBV pre-C region/BCP region,and SPSS 22.0 software was used for conjoint analysis.Results :The AFP level in the hepatitis B group was significantly higher than that in the non-hepatitis B group(P0.05).Among the hepatitis B group,the AFP of the HBV mu

7、tation group was higher than that of the non-mutated group(P0.05),and the level of AFP in the mutant group was higher than that in the non-mutated group in the former C region(P0.05).Conclusion :AFP has potential correlations with HCC types and HBV mutation types,and has great reference value for un

8、derstanding and diagnosing the disease.Key words :Hepatocellular carcinoma;Cholyglycine;-fetoprotein;HBV C region/BCP region mutation肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见恶性肿瘤之一,也是第三大癌症死亡原因1。HCC的高致死率与 HCC的高恶性程度和发病隐匿有关,大部分患者确诊时已为晚期,错过了基金项目:国家自然科学基金项目(82260422);江西省卫生健康委员会科技计划项目(202130700);赣州市指导性科技计划

9、项目(GZ2019ZSF036);赣南医学院第一附属医院院级科技计划项目(YJYB202075)作者简介:赖蜜,女,本科,讲师,主管技师,研究方向:生物化学。E-mail:通信作者:钟田雨,男,博士,教授,主任医师,硕士生导师,研究方向:疾病诊断和预后的分子标志物。E-mail: 12272022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址:http:/最佳治疗时机。目前,HCC的诊断依赖于血清学检查、影像学检查和病理学检查,但都无法对早期HCC进行诊断。甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP)是一种针对肝癌的肿瘤标记物,临床上被广泛用于肝癌的辅助诊断和术后复发的监测2。但是AFP的检测也被证明

10、缺乏灵敏性和特异性,多达40%的HCC患者血清AFP处于正常水平,尤其多见于早期HCC患者3。然而在一些慢性乙型肝炎和肝硬化患者上又见显著升高4-5。肝脏作为人体重要的代谢器官,组织代谢组学方法是研究肝癌代谢异常的重要手段。甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合形成的一种结合型胆酸,甘胆酸作为肝脏代谢产物,其水平可以动态反映肝脏损伤过程。相比较谷丙转氨酶、谷草转氨酶等常规肝功能检测指标,甘胆酸更敏感且能对早期肝炎、肝硬化进行疗效评估和早期诊断6。一项百人的队列研究表明,HCC患者血清甘胆酸水平显著高于健康人群7。因此,甘胆酸在监测和诊断HCC方面具有潜在价值。据估计,全球约有47%肝细胞癌病例发生在中国,其

11、中70%的HCC患者为乙肝相关性HCC8-9。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)DNA的变异被认为是HCC的危险因素。由于HBV逆转录酶缺乏校对功能,HBV DNA容易出现突变,且突变率是其他 DNA 病毒的 10 倍10-11。其中与 HCC 相关的BCP 区(Basal core promoter,BCP)和前 C 区(Pre-core,C)的突变最为常见。HBV BCP区主要突变包括A1762T/G1764A。研究表明,这种双突变可提高HBV的复制率12。多项队列研究表明,BCP双突变与HCC进展具有紧密相关性13-14。伴随BCP区双突变的乙肝携带者在术后也更容

12、易发生转移15。HBV前C区常见G1896A突变,其突变也与HBV的复制程度相关16。前 C区突变多见于慢性乙肝患者,其突变造成终止密码子形成,影响HBeAg的表达并引起HBV免疫逃逸17。这对疾病判断和疾病干预带来严峻挑战。因此,准确判断HBV是否突变及突变类型对肝癌诊断、治疗和预后具有重要意义。目前,已有大量关于单独甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC诊断中的意义的研究。但很少有关于三者潜在联系在HCC诊断的报道。本研究收集了200例肝癌患者,包括100例乙肝肝癌患者和100例非乙肝肝癌患者。通过对血清甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的联合检测,探讨甘胆

13、酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC之间的关联,以及三者联合检测在HCC临床诊断中的价值。1 材料和方法 1.1研究对象 选取2020年12月2022年2月在本院就诊的HCC患者血清200例,其中100例肝细胞癌患者经化学发光法检测HBV病毒表面抗原阳性(HBsAg0.05 IU mL-1),100 例 肝 细 胞 癌 患 者HBV 病毒表面抗原阴性(HBsAg0.05 IU mL-1)。将200例患者分为乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组。1.2纳入和排除标准 纳入标准:HCC患者均经影像学和病理学诊断明确,符合 原发性肝癌的临床诊断与分期标准18。患者及其家属对此次研究内容知情并签署

14、知情同意书。排除标准:(1)患者合并其他恶性肿瘤;(2)患者有严重凝血功能障碍。1.3仪器与试剂 1.3.1仪器迈瑞 BS-820M 生化仪、罗氏 Elecsys e602全自动电化学发光仪,ABI2720PCR扩增仪。1.3.2试剂甘胆酸试剂盒购于美康生物科技有限公司,AFP试剂盒购于罗氏制药有限公司,乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测试剂购于达安基因有限公司。1.4检测方法 1.4.1血清甘胆酸的检测取入组患者外周血35 mL,收集于含分离胶的真空采血管中。接收样本后,放入离心机1 600 g离心10 min及时分离血清用于后续项目检测或70 保存待检。使用迈瑞BS-820M生化仪,在质

15、控标准下按照说明书进行操作。检测方法为胶乳增强免疫比浊法,检测线性范围为0.580 mg L-1。1.4.2血清AFP的检测收集入组患者血清,使用罗氏Elecsys e602全自动电化学发光仪,在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为电化学发光法,检测范围0.51 000 ng mL-1。1.4.3乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测按照 说 明 书 操 作 取 入 组 患 者 血 浆,加 入 引 物 在ABI2720 中进行 PCR 扩增,按比例(HBV preC/BCP突变PCR反应液42 L/人份+HBV preC/BCP突变酶系3 L/人份)取相应量的PCR反应液及酶系,充分混匀后按

16、45 L/管分装至0.2 mL离心管中,然后分别取处理后样品、阳阴性质控品5 L,加入到0.2 mL 122812 期赖蜜,等 血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值投稿网址:http:/离心管中,6 000 rpm 瞬时(3 s)离心,将各反应管放入PCR仪。50 3 min;93 5 min;(93 30 s54 45 s72 30 s)45 个循环,最后 72 保温7 min后再进行杂交显色。杂交显色具体步骤如下:杂交液与杂交液预热至42,备用;杂交液(完全浸没膜条),备用;将PCR产物加入对应的杂交显色液离心管中,使得膜条在杂交过程中低速转

17、动(100150 转 min-1),杂交45 min;放入水浴水槽(42),100 转 min-1,水浴 5 min,弃杂交液。加入20 mL结合液,放置于2030 脱色摇床上摇摆(3050 转 min-1),避光反应10 min。弃结合液,弃杂交液。再将50 mL离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体。加入相应量的显色液,避光反应510 min;当显色弱时,可适当延长显色时间。显色反应结束后,立即弃显色液,加入20 mL溶液,脱色摇床上摇摆 2 min。弃溶液,加入 20 mL 去离子水,轻摇23 min取出。用吸水纸吸去膜条表面水分,尽快在扫描仪上扫描膜条 若不能立即进行扫描,请冻存于(-20

18、5)。参照达安膜条斑点识别分析系统操作说明书的要求,使用扫描仪扫描膜条,设定相应的参数并输出扫描结果,然后进行数据分析 HBV 前 C 区 ntA1896(nt1896G-A)、ntA1899(nt1899G-A)突变,BCP 区 nt1762/A1764(nt1762A-T、nt1764G-A)联合突变情况。1.5统计学方法 数据采用 SPSS 22.0统计软件进行处理。计数资料以n(%)表示,计量资料以-xs表示,组间比较采用独立样本t检验;P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1一般资料 乙肝肝癌组共100例患者,化学发光法检测血清HBsAg均为阳性(HBsAg0.05 IU mL

19、-1),其 中 男 性 90 例,女 性 10 例,平 均 年 龄(55.0010.72)岁。非乙肝肝癌组100例患者,化学发光法检测血清HBsAg均为阴性(HBsAg0.05 IU mL-1),其 中 男 性 69 例,女 性 31 例,平 均 年 龄(61.9411.76)岁。2.2乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组血清甘胆酸、AFP及HBV突变类型比较 非乙肝肝癌组与乙肝肝癌组的血清甘胆酸水平差异无统计学意义,乙肝肝癌组血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组(表1)。乙肝肝癌组BCP区突变率为14%,前C区突变率为23%,其中部分病例存在BCP区和前C区的混合突变,突变率为10%。非乙肝肝癌组也可见1

20、例前C区突变(见表1)和1例HBV DNA突变野生型,这是由于检测方法的局限性造成乙肝突变患者的漏检。2.3HCC患者HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系 为了探究HCC患者HBV前C区/BCP区基因突变与血清甘胆酸、AFP之间的潜在关系,我们对100例HBV阳性的HCC患者血清甘胆酸、AFP进行了分类比较。结果表明,HCC患者基因突变组血清AFP显著高于无基因突变组,差异有统计学意义(P=0.003 5),而血清甘胆酸在 HCC患者基因突变组与无基因突变组的差异无统计学意义(P=0.528 5)(表2)。为了探究是哪一种突变造成血清AFP水平的改变,分别对BCP区突变和前C区突变分类统计

21、,结果表明,AFP 的差异仅在 BCP 区 1762/1764 位点有统计学意义(P=0.031 5),在前C区1896/1899位点差异无统计学意义(P=0.092 2)(表2)。表2HBV突变类型与血清甘胆酸、AFP的关系突变类型HBV有突变型HBV无突变型BCP区有突变型BCP区无突变型前C区有突变型前C区无突变型甘胆酸/mgL-16.4866.0897.7079.4648.7607.3207.1188.8437.7206.8717.4148.864AFP/ngL-1711.51193*190.3549.8767.6893.1*266.0781.8579.81207259.3632.3注

22、:*表示P0.05,*表示P0.01。表1两组患者血清甘胆酸、AFP比较组别非乙肝肝癌组乙肝肝癌组P血清标志物HBV甘胆酸/mgL-16.4314.9227.3668.6400.348 7AFP/ngmL-1133.9559.2336.1812.40.041 6HBV突变类型/n(%)BCP区0(0)14(14)/前C区1(1)23(23)/混合0(0)10(10)/12292022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址:http:/3 讨论 慢性乙肝病毒感染是个全球卫生问题,如果治疗不及时,将从肝炎进展到肝硬化甚至肝癌。研究发现,HBsAg阳性者的肝癌发生风险是HBsAg阴性者的12倍19。

23、对HCC患者做到准确判断、及时治疗和有效监测是HCC治疗的一大难点和重点。甘胆酸被广泛用于肝性疾病的诊断,血清甘胆酸水平的变化反映出肝损伤的动态过程,因此,甘胆酸在HCC诊断中具有潜在价值。遗憾的是,在本研究中,尚未发现甘胆酸在诊断HCC类型和HBV突变之间的相关性。AFP是一种对肝癌敏感的肿瘤标志物,在临床上被广泛用于肝癌的诊断及术后的检测,但AFP的升高不只见于肝癌患者。我们的结果表明,AFP与HCC类型具有潜在相关性,乙肝HCC患者AFP水平显著高于非乙肝HCC患者。在对乙肝HCC患者突变类型进行深入研究,我们发现,前C区突变比例明显高于BCP区突变比例。2012年一项关于西南地区HBV

24、 DNA突变的研究表示,在500多份HBV血清标志物阳性的血清中,BCP区突变率和前C区突变率分别为34.1%和39.7%,同期,河北正定县前C区突变为18.1%20。本研究样本的BCP区突变和前C区突变比例均低于西南地区水平,这不仅可能与地域、突变检测试剂盒的敏感性相关,还可能与HBV基因型有关,不同突变类型的比例在不同HBV类型中也有不同。其次,本研究发现HBV突变的 HCC 患者血清 AFP 水平更高,这种差异在BCP区突变组中有统计学意义。BCP区在结构上与HBVx基因有部分重叠,其A/T的突变使得HBVx基因结构更为稳定,这也是突变携带者更易恶化和HCC患者转移的重要因素。值得注意的

25、是,BCP区突变可以增强HBV复制,高水平的血清AFP也反映出肿瘤细胞处于活跃期,两种检测手段是否可以联合应用于HCC的早期诊断还需要后续实验。其次,HBsAg是目前临床上被用来判断HBV感染的重要标志物,也是 WHO公认的关键指标21。免疫学方法是目前临床常用HBsAg筛查的检测方法,具有高灵敏和高特异性。然而 HBV 基因的突变会影响HBsAg的表达或改变其抗原性,造成一定的漏检风险。一项研究发现,中国隐匿性乙肝患者HBsAg的亲水区突变率高达 55.7%22。本研究数据表明,HBsAg阴性的乙肝携带者比例有2%之高。其次,HBV BCP 区/前 C区作为 HBV 的高突变区,对 HCC进

26、展具有密切关系,因此,临床上是否有必要加强对HBV突变类型的检测值得深入探究。参考文献:1 SIEGEL R L,MILLER K D,FUCHS H E,et al.Cancer Statistics,2021J.CA Cancer J Clin,2021,71(1):7-33.2 RICH N,SINGAL A G.Hepatocellular carcinoma tumour markers:current role and expectationsJ.Best Pract Res Clin Gastroenterol,2014,28(5):843-853.3 BARLETTA E,TI

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32、ol,2009,50(1):80-88.(下转第1242页)12302022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址:http:/ma presenting with diffusely-scattered nodules in the right lung J.Cancer Biol Ther,2018,19(1):13-19.17 于洋涛,胡伟.硬化性肺细胞瘤临床诊疗研究进展J.河南医学研究,2019,28(5):958-960.18 KOCAMAN G,YENIGUN M B,ERSOZ C C,et al.Pulmonary sclerosing pneumocytoma with me

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