血清外泌体miR-20b-...腺癌诊断及预后评估中的应用_李纪远.pdf

血清外泌体 mi 20b 5p mi 107 水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用李纪远马新张灿斌王献郑帅玉尚自强基金项目:河南省医学科技攻关计划联合共建项目(编号:2018020274)作者单位:471000河南洛阳河南科技大学第一附属医院胸外科通信作者:尚自强，lijiyuan1006126 com 摘要 目的探究血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用价值。方法选取 2015 年 12 月至 2018 年 12 月河南科技大学第一附属医院胸外科收治的 124 例非小细胞肺腺癌患者为观察组，另选取 120例同期于本院接受体检的健康体检者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链法(qT PC)检测血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 表达水平，受试者工作特征曲线(OC)评估 mi 20b 5p、mi 107 水平检测对非小细胞肺腺癌的早期诊断价值，Kap-lan Meier 生存分析研究 mi 20b 5p、mi 107 水平与患者预后的关系。结果观察组的血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107水平高于对照组(P 0 05)。OC 曲线分析结果显示，血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 检测诊断非小细胞肺腺癌的 AUC 值分别为0 766、0 821，最佳截断值分别为181、127。观察组患者中，117 例完成随访，7 例失访。随访 3 年后，64 例患者死亡，53 例患者存活。根据患者的生存状态绘制 OC 曲线，确定 mi 20b 5p、mi 107 预测患者预后的最佳截断值分别为195、160;mi 20b 5p 高表达与低表达、mi 107 高表达与低表达患者的 TNM 分期和淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P 0 05)。mi 20b 5p、mi 107 高表达患者的中位生存时间均低于低表达患者(P 0 05)。结论外泌体 mi 20b 5p、mi 107 在非小细胞肺腺癌患者血清中呈高表达状态，其表达水平与患者的预后相关，在疾病诊断与预测患者累计生存率方面具有一定的参考意义。关键词 非小细胞肺腺癌;血清外泌体;mi 20b 5p;mi 107;诊断;预后doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.01.008Application of serum exosomal mi 20b 5p and mi 107 in diagnosis and prognosis evaluation of non small cell lung ad-enocarcinomaLI Jiyuan，MA Xin，ZHANG Canbin，WANG Xian，ZHENG Shuaiyu，SHANG ZiqiangDepartment of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，ChinaFund project:Joint construction project of Henan Medical Science and Technology esearch Program(No 2018020274)Corresponding author:SHANG Ziqiang，lijiyuan1006126 com Abstract ObjectiveTo investigate the application value of serum exosomal mi 20b 5p and mi 107 in the diagnosis andprognosis evaluation of non small cell lung adenocarcinoma MethodsA total of 124 patients with non small cell lung adenocarcinomawho were admitted to the Department of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology fromDecember 2015 to December 2018 were selected as the observation group，and 120 healthy individuals who received physical examination inthe hospital during the same period were selected as the control group Quantitative real time polymerase chain reaction(qT PC)wasemployed to detect serum exosomal mi 20b 5p and mi 107 expression levels The receiver operating characteristic(OC)curve wasused to evaluate the value of mi 20b 5p and mi 107 in early diagnosis of non small cell lung adenocarcinoma，and Kaplan Meiersurvival analysis was performed to study the relationship between mi 20b 5p，mi 107 and the prognosis esultsSerum exosomalmi 20b 5p and mi 107 levels in the observation group were higher than those in the control group(P 0 05)OC curve analysisfound that the AUC values of serum exosomal mi 20b 5p and mi 107 to diagnose non small cell lung adenocarcinoma were 0 766and 0 821 The optimal cut off values were 1 81 and 1 27(P 0 05)In the observation group，117 patients completed follow up and7 patients were lost to follow up During the three years of follow up，64 patients died and 53 patients survived OC curve analysis foundthat the optimal cut off values of mi 20b 5p and mi 107 in the prognosis were 1 95 and 1 60 There were statistically significantdifferences in TNM stage and lymph node metastasis between patients with high and low expression of mi 20b 5p，and between patientswith high and low expression of mi 107(P 0 05)The median survival time of patients with high expression of mi 20b 5p andmi 107 was shorter than that of patients with low expression(P 0 05)ConclusionsSerum exosomal mi 20b 5p and mi 10783安徽医学第 44 卷第 1 期Anhui Medical Journal2023 年 1 月are highly expressed in patients with non small cell lung adenocarcinoma，and the expression levels are related to the prognosis of the pa-tients，which provides reference for the diagnosis and prognosis evaluation of non small cell lung adenocarcinoma Key words Non small cell lung adenocarcinoma;Serum exosome;mi 20b 5p;mi 107;Diagnosis;Prognosis非小细胞肺癌是临床常见的呼吸道恶性肿瘤，以肺腺癌为主要表现形式，占肺癌的85%以上 1。由于缺少典型临床表现，多数患者就诊时已处于晚期，丧失了手术切除治疗的机会，5 年生存率仅有 15%左右 2 3。尽早诊断非小细胞肺腺癌并积极采取合适的治疗方案，是改善患者预后的关键。既往研究 4 5 认为，非小细胞肺腺癌发病机制复杂，其发展过程与癌基因的表达、肿瘤细胞增殖和迁移关系密切，而微小 NA(microNAs，miNAs)作为一种基因调控分子，可调控原癌基因或抑癌基因的表达，在肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等过程中发挥重要的调控作用。Mi 20b 5p 与胃癌、肝癌、宫颈癌等肿瘤疾病的发生发展关系密切，可在患者血液外泌体中异常增高6 7。Mi 107 可通过调节多种信号途径，诱导肿瘤细胞的增殖和凋亡，参与非小细胞肺癌、结直肠癌等的进展8 9。当前有关 mi 20b 5p、mi 107 在非小细胞肺腺癌血清外泌体中的表达及作用尚未完全明确。本研究分析非小细胞肺腺癌患者血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 表达水平及其在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用价值，旨在为临床非小细胞肺腺癌的诊疗提供参考。1资料与方法1 1一般资料选取 2015 年 12 月至 2018 年 12 月河南科技大学第一附属医院胸外科收治的 124 例非小细胞肺腺癌患者为观察组，其中男性 84 例，女性 40例，年龄38 75 岁，平均(59 25 9 74)岁;肿瘤部位:左肺86 例，右肺38 例;肿瘤直径:5 cm 76 例，5 cm48 例;TNM 分期:期 20 例，期 45 例，A 期 59例;淋巴结转移 79 例，无转移 45 例。另选取 120 例同期于本院接受体检的健康体检者为对照组。本研究经医院伦理委员会批准(伦理审批号:2018XW108)。两组对象一般临床资料比较，差异无统计学意义(P 0 05)。见表 1。表 1观察组与对照组一般临床资料比较指标观察组(n=124)对照组(n=120)t/2值P 值性别(男/女，例)84/4076/4405250469年龄(岁)59 25 9 745846 87306660506BMI(kg/m2)23 48 1 542375 12714910137吸烟史例(%)69(55 65)53(4417)3 2140073注:BMI 为身体质量指数。1 2纳入与排除标准纳入标准:临床检查符合非小细胞肺腺癌的诊断标准10，且均经手术组织病理学检查确诊;TNM 分期为 A 期;患者年龄18岁;初诊，入组前均未接受放化疗、手术等治疗;临床资料完整;患者及其家属知情同意，均签署知情同意书。排除标准:病理类型不明确患者;合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病或血液疾病患者;合并严重感染患者;存在严重肝肾功能障碍患者;随访信息缺失或部分缺失患者。1 3研究方法13 1血清外泌体外泌体表达水平检测采用实时荧光定量聚合酶链(quantitative real time polymerasechain reaction，qT PC)法检测血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 的表达水平。血清外泌体提取与鉴定:取研究对象清晨肘静脉血 5 mL，2 500 r/min离心 5 min，分离血清后，20下保藏待测;取血清样本，离心去除沉淀和脂质层，取 250 L 血清标本至 EP管中，加入 SBI 沉淀剂 EX OQ5A 1 后离心留取沉淀;加入 50 L PBS 缓冲液，振荡吹打混匀将外泌体悬浮。采用透射电子显微镜(HT7800 型，日本日立公司)鉴定血清外泌体，纳米颗粒跟踪分析法测定外泌体的绝对大小分布和浓度，以外泌体颗粒直径分布于30 200 nm 范围占 90%以上，呈单峰正态分布曲线为提取物合格。外泌体总 NA 提取:取外泌体悬浮液，加入 700 L QIAzol 裂解试剂，混匀后于室温下(15 25)孵育5 min;加入140 L 三氯甲烷，混匀后孵育 2 3 min，4 下离心 15 min;吸取上层水相350 L于 EP 管中，加入675 L 无水乙醇，充分混匀后取混合物样品加入 NeasyMini Spin Column，离心后倒掉流出液;加入 500 L Buffer WT，离心 1 min，加入500 L Buffer PE，离心 30 s，倒掉流出液后干燥滤膜;将离心柱插入 EP 管中，加入 14 L Neasy freewater，离心 1 min，洗脱得到 NA 溶液;采用超微量分光光度计(Nano Drop 2000 型，美国赛默飞世尔科技公司)测定 NA 浓度。cDNA 反转录:总 NA 经凝胶电泳分离、纯化，采用反转录试剂盒将总 NA 反转录为 cDNA，20保存备用。qT PC 法:以 cD-NA 为模板，应用 micute miNA 荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)检测血清外泌体 mi 20b 93第 44 卷第 1 期安徽医学2023 年 1 月Anhui Medical Journal5p、mi 107 水平，引物序列 mi 20b 5p，正向5 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGAA 3、反向3 CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAGA 5，mi 107:正向 5 GGAGCAGCATTGTACAGG 3、反向3 CAGTGCGTGTCGTGGA 5。反应体系(20 L)包括:2 micute miNA Premix 10 L、1 L 正向引物(10 mol/L)、1 L 反向引物(10 mol/L)、2 L mi-NA 第一链 cDNA、1 6 L OX 参比染料(50 )、其余为 ddH2O;循环参数:95 预变性 10 min、95 变性15 s、60复性 60 s，共计 45 个循环。miNA 表达结果采用 2 Ct计算11，每个样本检测 3 次，取平均值。13 2随访采用电话或门诊复查的方式对患者进行随访，每 3 个月 1 次，随访截止时间为 2021 年 12 月31 日。生存时间定义为随访期内患者存活时间，因肿瘤以外原因死亡或末次随访时仍然存活的为截尾数据。1 4统计学方法采用 SPSS 20 0 统计软件对数据进行分析。正态分布计量资料以 x s 表示，两组间比较采用 t 检验;计数资料以百分比表示，组间比较采用2检验;采用 MedCalc 15 1 软件绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，OC)，计算曲线下面积(area under curve，AUC)以评估血清外泌体mi 20b 5p、mi 107 水平对非小细胞肺腺癌的诊断价值，确定预测非小细胞肺癌预后的最佳截断值;累计总生存率采用 Kaplan Meier 进行分析，Log rank检验比较组间中位生存时间。以 P 0 05 为差异有统计学意义。2结果21两组研究对象血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 水平比较观察组的血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 水平均高于对照组，差异有统计学意义(P 0 05)。见表 2。表 2两组研究对象血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107水平比较(x s)组别例数mi 20b 5pmi 107观察组1242 39 0 761 54 0 46对照组1201 31 0 340 83 0 21t 值14 24715 423P 值0 0010 001注:mi 20b 5p 为微小 NA 20b 5p;mi 107 为微小 NA 107。2 2血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 检测对非小细胞肺腺癌的诊断价值分析血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 检测诊断非小细胞肺腺癌的 AUC值分别为 0 766、0 821，灵敏度分别为 81 45%、84 68%，特异度分别为 75 83%、82 50%，Youden s指数分别为 0 573、0 672。mi 20b 5p、mi 107诊断非小细胞肺腺癌的截断值分别为 1 81、1 27。见表 3、图 1。表 3血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 检测对非小细胞肺腺癌的诊断价值分析指标截断值AUC 值标准误P 值95%CImi 20b 5p1 810 7660 0320 0010 708 0 808mi 1071 270 8210 0290 0010 767 0 867注:mi 20b 5p 为微小 NA 20b 5p;mi 107 为微小 NA 107。图 1血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 检测诊断非小细胞肺腺癌的 OC 曲线23OC 曲线确定 mi 20b 5p、mi 107 预测患者生存状态的截断值观察组患者中，117 例患者完成随访，7 例失访。随访 3 年后，64 例患者死亡，53 例患者存活。根据患者的生存状态绘制 OC 曲线，以Youden s 指数(灵敏度+特异度 1)确定 mi 20b 5p、mi 107 的最佳截断值分别为 1 95、1 60。见图 2。图 2血清外泌体 mi 20b 5p、mi 107 预测非小细胞肺腺癌患者生存状态的 OC 曲线2 4不同 mi 20b 5p、mi 107 水平非小细胞肺腺癌患者的一般临床资料比较以 mi 20b 5p=04李纪远等:血清外泌体 mi 20b 5p mi 107 水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用第 44 卷第 1 期2023 年 1 月1 95、mi 107=1 60 为临界值，将 117 例非小细胞肺腺癌患者分为 mi 20b 5p 高表达组(n=75)和mi 20b 5p 低表达组(n=42)，mi 107 高表达组(n=81)和 mi 107 低表达组(n=36)。mi 20b 5p 高表达组与低表达组、mi 107 高表达组与低表达组的 TNM 分期和淋巴结转移比较，差异均有统计学意义(P 0 05);各组的性别、年龄、BMI、吸烟史、肿瘤部位和肿瘤直径比较，差异无统计学意义(P 0 05)。见表 4、5。表 4不同 mi 20b 5p 水平非小细胞肺腺癌患者的一般临床资料比较指标高表达(n=75)低表达(n=42)t/2值P 值性别(男/女，例)53/2226/160 9420 332年龄(岁)60 83 7 5258 61 7 931 5020 136BMI(kg/m2)23 21 2 1823 85 2 061 5530 123吸烟史44(58 67)21(50 00)0 8190 365肿瘤部位 例(%)0 7520 386左肺54(72 00)27(64 29)右肺21(28 00)15(35 71)肿瘤直径 例(%)0 1120 7375 cm47(62 67)25(59 52)5 cm28(37 33)17(40 48)TNM 分期 例(%)5 5430 019/期33(44 00)28(66 67)A 期42(56 00)14(33 33)淋巴结转移 例(%)6 8550 009是54(72 00)20(47 62)否21(28 00)22(52 38)注:BMI 为身体质量指数;TNM 分期为美国癌症联合会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)肺癌分期。表 5不同 mi 107 水平非小细胞肺腺癌患者的一般临床资料比较指标高表达(n=81)低表达(n=36)t/2值P 值性别(男/女，例)56/2523/130 3130 576年龄(岁)60 59 8 8158 76 8 131 0611 291BMI(kg/m2)23 18 2 3524 04 2 191 8650 065吸烟史 例(%)46(56 79)19(52 78)0 1630 687肿瘤部位 例(%)2 8990 089左肺60(74 07)21(58 33)右肺21(25 93)15(41 67)肿瘤直径 例(%)0 2260 6355 cm51(62 96)21(58 33)5 cm30(37 04)15(41 67)TNM 分期 例(%)6 2420 012/期36(44 44)25(69 44)A 期45(55 56)11(30 56)淋巴结转移 例(%)7 9090 005是58(71 60)16(44 44)否23(28 40)20(55 56)注:BMI 为身体质量指数;TNM 分期为美国癌症联合会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)肺癌分期。2 5 不同 mi 20b 5p、mi 107 水平非小细胞肺腺癌患者的预后分析mi 20b 5p 高表达患者中位生存时间为 29 个月，mi 20b 5p 低表达患者中位生存时间为 36 个月，差异比较有统计学意义(Log rank 2=5 232，P=0 022)。见图 3。mi 107 高表达患者中位生存时间为 29 个月，mi 107 低表达患者中位生存时间为 36 个月，差异比较有统计学意义(Log rank 2=14 198，P 0 001)。见图 4。14第 44 卷第 1 期安徽医学2023 年 1 月Anhui Medical Journal图 3mi 20b 5p 高表达与低表达非小细胞肺腺癌患者的总生存曲线图4mi 107 高表达与低表达非小细胞肺腺癌患者的总生存曲线3讨论非小细胞肺腺癌是全球范围内发病率较高的恶性肿瘤，随着手术治疗、放化疗和免疫治疗等的不断发展，近年来非小细胞肺腺癌的临床治疗效果取得了明显进步，但其死亡率仍居高不下12。对非小细胞肺腺癌进行诊断与病情评估，并及时采取相关治疗措施，是降低患者病死率、提高预后质量的关键。随着 miNAs研究的不断深入，有研究13 表明，miNAs 不仅参与细胞增殖、分化等生物学进程，也参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移，在肿瘤的诊疗及预后评估中显示出重要的应用价值。Li 等14 研究发现，mi 21 5p、mi 20、mi 486 等在非小细胞肺癌中表达上调，具有较高的疾病诊断价值。外泌体是一种由细胞分泌的脂质分子膜包裹的小囊泡，该结构能够保护 miNAs不受核糖核酸酶催化活性的影响，从而更准确地反映肿瘤微环境的改变及肿瘤细胞增殖转移过程15。此外，血清外泌体检测操作简便，患者痛苦较轻、风险较小，更适用于临床肿瘤的筛查与诊断。mi 20b 5p 基因位于染色体 Xq26 2 区域，是mi 106a 363 簇的成员，在多种肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用，是肺癌诊断较好的潜在生物标志物16。Zhang 等17 研究发现，mi 20b 5p 在非小细胞肺癌的血清外泌体、组织和细胞系中均明显高表达，认为过表达的 mi 20b 5p 可通过靶向抑制 B细胞易位基因 3 的表达，发挥促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移的作用。本研究发现，观察组的血清外泌体mi 20b 5p 水平均明显高于对照组;OC 曲线分析结果显示，mi 20b 5p 的 AUC 值为 0 766，提示mi 20b 5p 在非小细胞肺腺癌患者的血清外泌体中高表达，有利于非小细胞肺腺癌的临床诊断。一项有关 mi 20b 5p 对非小细胞肺癌细胞生物学行为影响的研究18 发现，mi 20b 5p 可靶向调控 CyclinD1/CDK4/FOXM1 信号通路，促进细胞增殖和侵袭，并将细胞阻滞于 G1 期抑制其凋亡。此外，mi 20b 5p还可下调转化生长因子 受体 2 表达、通过 Wnt/catenin 信号通路正反馈促进肿瘤细胞的增殖、细胞上皮 间充质转化和细胞转移，进而促进肺癌的发生发展19。这也可能是本研究中高表达 mi 20b 5p 与非小细胞肺癌患者 TNM 分期、淋巴结转移及较差中位生存时间有关的原因。mi 107 是 mi 103/107 簇的成员，可通过调控相关靶点，在骨肉瘤、肝细胞瘤、胃癌等癌症的发生、侵袭及转移中发挥重要作用。张肖丽等20 研究发现，mi 107 在胃癌组织中呈高表达状态，mi 107 表达水平越高，肿瘤分化程度越高、患者预后越差。Zhang 等21 评估了肝癌组织中 mi 107 的表达水平，发现 mi 107 在肝癌组织中的表达有明显上调，可靶向调控轴抑制蛋白 2 的表达促进肝癌细胞增殖。当前，有关 mi 107 在肺癌中的表达及作用尚未完全明确，非小细胞肺腺癌患者血清外泌体中 mi 107 的表达水平也鲜有研究。赵轲等 22 评估血浆 mi 107 表达水平与非小细胞肺癌患者的临床病理特征及预后的关系，发现非小细胞肺癌患者血浆及肿瘤组织中 mi 107 表达升高，并与病理分化、肿瘤大小、淋巴结转移以及 TNM 分期呈正相关;刘荷英等23 的研究则发现，mi 107 可抑制人非小细胞肺癌 A549 细胞增殖和调控细胞周期。本研究发现，观察组的血清外泌体mi 107 水平高于对照组，AUC 值为0 821;与 mi 107 低表达患者相比，mi 107 高表达患者的 TNM 分期更差、淋巴结转移率更高、中位生存时间更短，提示24李纪远等:血清外泌体 mi 20b 5p mi 107 水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用第 44 卷第 1 期2023 年 1 月非小细胞肺腺癌患者的血清外泌体 mi 107 表达水平与患者的临床特征及预后相关，可为非小细胞肺腺癌的诊断及预后预测提供参考。分析其原因可能是:mi 107 可靶向调控 Axin2 或 Dicer1 基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖和迁徙，从而影响肿瘤的浸润与淋巴结转移，继而影响患者的预后24。此外，高表达的mi 107 可通过调控细胞周期蛋白依赖性激酶 8 的表达，提高患者对顺铂等化疗药物的耐药性，影响化疗效果，从而导致患者预后不良25。但也有研究26 显示，mi 107 会增强非小细胞肺癌患者对放疗的敏感性，在累计生存率上获益，与本研究结论存在差异。可能与研究对象疾病类型未完全重合、患者年龄及病情严重程度不同、指标检测方法存在差异有关。有关mi 107 如何影响非小细胞肺癌患者预后还需进一步研究证实。综上所述，外泌体 mi 20b 5p、mi 107 在非小细胞肺腺癌患者血清中呈高表达状态，其表达水平与患者的预后相关，在诊断非小细胞肺腺癌、预测患者预后方面可能具有一定的参考意义。参考文献 1 BODEICK S Adjuvant and neoadjuvant immunothera-py in non small cell lung cancerJ Thorac Surg Clin，2020，30(2):215 220 2 杨栋梁，周胜年，汪会进，等 中性粒细胞/淋巴细胞比值对非小细胞肺癌淋巴结转移的预测价值 J 安徽医学，2020，41(6):702 704 3 SANKA K，GADGEEL S M，QIN A Molecular therapeutictargets in non small cell lung cancer J Expert ev Anti-cancer Ther，2020，20(8):647 661 4 JONNA S，SUBAMANIAM D S Molecular diagnostics andtargeted therapies in non small cell lung cancer(NSCLC):an update J 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例脊髓核磁共振(MI)见脊髓异常病灶，9 例脑 MI 见白质异常信号，11 例神经电生理检查见多发周围神经损害，2 例胃镜见萎缩性胃炎。给予患者维生素 B1和维生素 B12肌肉注射，3 个月后随访，病程 6 个月以内的 9 例患者无神经系统遗留症状，其余患者仍有麻木