甘草药材上的污染真菌类群及其产毒素特性.pdf

Mycosystema 菌 物 学 报 15 May 2010,29(3):335-339 ISSN1672-6472 CN11-5180Q 2010 Institute of Microbiology,CAS,all rights reserved.基金项目：科技部“重大新药创制”科技重大专项（No.2009ZX09502-025-01）；国家中医药管理局中医药行业科研专项（No.200807042）*Corresponding author.E-mail:;Tel:[phone],Fax:[phone] 收稿日期:2009-07-27,接受日期:2009-09-21 甘草药材上的污染真菌类群及其产毒素特性 陈娟 杨蕾 蔡飞 杨美华 高微微*中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193 摘 要：对药材市场上霉变甘草样品的污染真菌进行分析，共得到 4 属 7 种真菌，包括 Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Mucor 属，其中 Penicillium polonicum、Aspergillus parasiticus 以及 P.crustosum 是优势真菌。采用高效液相色谱-质谱联用技术对优势菌菌株产黄曲霉毒素及赭曲霉毒素 A 的特性进行检测。结果表明 A.parasiticus 主要产生黄曲霉毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1）和赭曲霉毒素 A（OTA）；而 Penicillium polonicum 主要产生赭曲霉毒素 A（OTA）。关键词：污染真菌，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素 A Fungi associated with Glycyrrhiza uralensis and their capability of mycotoxin production CHEN Juan YANG Lei CAI Fei YANG Mei-Hua GAO Wei-Wei*Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100193,China Abstract:Mouldiness of medicinal herbs occurred commonly during storage.Fungi associated with mouldy materials of Glycyrrhiza uralensis and their capability of mycotoxin production were investigated.Medicinal materials of G.uralensis were collected from herbal markets.Seven fungal species belonging to Penicillium,Aspergillus,Fusarium and Mucor were isolated.Among them,Penicillium polonicum,Aspergillus parasiticus and P.crustosum were dominant.Mycotoxin production was detected by HPLC-MS technique.Aspergillus parasiticus produced aflatoxins(AFG2,AFG1,AFB2,AFB1)and ochrotoxin A(OTA),while Penicillium polonicum mainly produced ochrotoxin A(OTA).Key words:toxigenic fungi,aflatoxins,ochrotoxin A 中药甘草是豆科甘草属乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 G.inflata Batalin、光果甘草 G.glabra L.的干燥根及根茎，具有解毒、抗肿瘤、抗炎症、调和诸药等多种功效（Kakegawa et al.1992；Fu et al.2004；郑春英和李勇庆 2006），是中药中应用最广泛的药材之一。甘草的主要成分甘草酸（Glycyrrhizic acid）的甜度是蔗糖的 170倍（Mizutani et al.1994），因此除药用之外，还作336 Mycosystema http:/ 为甜味剂被广泛用于糖果、饮料等食品工业生产。甘草主要分布在我国西北的干旱荒漠和草原地区（王玉庆和朱玫 2002）。采收后，经过简单的初加工，包括除去残茎、须根，去掉泥土，捆把，置通风干燥处凉干后，即作为商品出售。由于产地气候环境干燥，发霉情况少见，但是在环境湿度较大的其他地区，即使在通风良好的仓库贮藏，甘草的切口和表皮破损部位也极易发霉（李继平 1993）。前人研究表明，引起药材霉变的真菌主要是曲霉属 Aspergillus、镰刀菌属 Fusarium、毛霉属Mucor、青霉属 Penicillium 和根霉属 Rhizopus 等的一些种（Efuntoye 1996，1999；Halt 1998；Rizzo et al.2004），这些真菌在药材的表面或内部滋生、繁殖，不仅引起药材气味、色泽和品质下降，而且在适宜的条件下可产生有毒代谢产物真菌毒素，其 中 对 人 体 健 康 影 响 最 大 的 是 黄 曲 霉 毒 素（aflatoxin）及赭曲霉毒素 A（ochrotoxin A）。黄曲霉毒素是已知真菌毒素中毒性最强的一类，被国际癌症研究机构（IARC）划定为 I 类致癌物（Joffe 1969；IARC-WHO 1993）。赭曲霉毒素 A（OTA）是近年来又一类引起广泛关注的真菌毒素，它的毒性包括致癌、致畸、破坏免疫系统，对肝、肾脏造成损害等（Tsubouchi et al.1995；OBrien&Dietrich 2005）。甘草作为一种使用广泛的药材及食品添加剂，其化学成分、药理学等方面在国内外已有大量研究，但是有关引起甘草霉变的污染菌类群及其产毒素性质，还未见报道。笔者前期采用免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法（IAC-HPLC）对全国 5个地区（北京、宁夏、河南、浙江、江西）的甘草药材进行了 OTA 含量的检测，其中来源于江西的甘草 OTA 含量最高（84.4g/kg，未发表资料），在此基础上本文首次对江西药材市场上的发霉甘草进行了污染菌的分离、鉴定，并对主要污染菌产生 OTA及黄曲霉毒素的能力进行了测定，旨在对甘草贮藏过程中的真菌毒素所造成的污染风险进行科学评价，为有效地预防这类污染提供理论指导。1 材料与方法 1.1 药材样品 5 批次乌拉尔甘草 Glycyrrhiza uralensis 样品于2008 年 7 月至 8 月间采集自江西药材市场，并由中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定。1.2 仪器和试剂 LC-20AD 高 效 液 相 色 谱 仪（岛 津）；LCMS-2010EV 质谱仪（岛津）；色谱柱：Shim-pack VP-ODS（150mm 2.0mmID，5m）（岛津）；Mytoxin 固相萃取柱（Varian）；黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 标准品，纯度99%（Sigma）；赭曲霉毒素 A 标准品，纯度99%（Osaka）。1.3 污染真菌的分离培养 于每批样品中随机选取10g药材，加入含90mL无菌水和 20 颗玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上130r/min 室温震荡 20min 后，静置 5min，上清液即为 10-1悬液。依次梯度稀释后，选择 10-6浓度，取0.5mL 悬液，加至培养皿中，倒入 50孟加拉红培养基（加氯霉素 100mg/L），水平混合均匀，冷却后封口，放置 25培养箱中培养，每个浓度 4 皿重复。7d 后对长出的菌落进行计数并单孢分离。同种真菌分离的菌株总数占总分离菌株数的比例记为分离频率。1.4 形态学鉴定 青霉属及曲霉属真菌形态鉴定采用查氏酵母浸出液培养基（CYA）、麦芽汁培养基（MEA）。25培养 7d 后观察菌落的培养性状及显微特征，参考 Raper（1965）及 Pitt（1979）的著作进行鉴定。镰刀菌属真菌的鉴定在康乃馨叶琼脂培养基（CLA）上观察大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子及产孢细胞形态，根据菌株的产孢表型及其在 PDA 培养基上的菌落特征，参考 Nelson et al.（1983）和 Leslie et al.（2006）的著作进行鉴定。1.5 分子生物学鉴定 采用 Chen et al.（2007）的方法进行菌丝的收集及基因组 DNA 的提取。青霉属及曲霉属真菌采用通用引物-tublin（Glass&Donaldson 1995），镰刀菌属真菌采用通用引物 TEF-1（Mirete et al.2004）进行序列扩增。PCR 产物由北京诺赛生物公司进行序列测定。测定的-tublin 和 TEF-1 的 DNA 序列通过BLAST软 件 与 从GenBank核 酸 数 据 库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中下载的相关序列进行同源性比较。并上传 NCBI 核酸序列库。1.6 真菌的发酵培养 将菌株接种至含大米培养基的三角瓶中，25Vol.29 No.3 337 菌物学报 培养 3 周后，即用于毒素检测。1.7 毒素检测 1.7.1 前处理：将培养物样品在 60烘箱中干燥，每瓶约用 80%甲醇 100150mL，超声提取 30min，离心，取上清液，定量滤纸过滤。将滤液通过 Varian Mytoxin 固相萃取小柱，过柱后取 10mL 在 60下旋蒸至干，最后用乙腈定容至 1mL 供测定。1.7.2 毒素测定：OTA 的测定：色谱柱为 Shim-pack VP-ODS，150mm 2.0mmID，5m；流动相为甲醇:水=80:20，流速 0.2mL/min，柱温 40；APCI正离子模式，+4.5kV；CDL 电压-20V；雾状 N2 1.5L/min；DEFs 电压+50V；扫描范围 m/z 100500；进样量 10L。黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1 的测定：色谱柱为 Shim-pack VP-ODS，150mm 2.0mmID，5m；流动相为乙腈:水=53:7，流速 0.2mL/min，柱温40；ESI 负离子模式；200热击；CDL 温度250；雾状 N2 1.5L/min；进样量 10L。2 结果与分析 2.1 霉变甘草样品的污染菌类群分析 从 5 个霉变的甘草样品中共分离到 90 株真菌，经形态以及分子生物学鉴定，分别属于 4 属 7 种（表1）。5 个样品中分离频率最高的是 Penicillium polonicum 54%，Aspergillus parasiticus 23%以及 P.crustosum 14%，其他分离到的青霉属真菌有 P.commune 2%，镰刀菌属真菌分离到 2 种，Fusarium oxysporium 2%以及 F.proliforium 1%，毛霉属真菌 1种，Mucor racemosus 2%。2.2 优势污染菌产黄曲霉毒素以及 OTA 的特性 对所分离的青霉属及曲霉属真菌 Penicillium polonicum、P.crustosum、P.commune以及Aspergillus parasiticus 的 6 个菌株培养物（CGMCC 3.13636，CGMCC 3.13637，CGMCC 3.13638，CGMCC 3.13639，CGMCC 3.13640，CGMCC 3.13641）中黄曲霉毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1）以及赭曲霉毒素 A（OTA）产生情况进行测定（表 2），其中 A.parasiticus CGMCC 3.13637 菌株的培养物中同时检测到 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1 及 OTA（图 1，图 2），A.parasiticus 的另一菌株 CGMCC 表 1 5 份霉变甘草样品的污染菌类群分析 Table 1 Occurrence of fungi in 5 mouldy Glycyrrhiza uralensis samples 样品 Sample 真菌种类 Species 123 4 5 总数 Sum 分离频率（%）Frequency(%)Penicillium polonicum 13711 10 8 49 54 P.crustosum 513 2 2 13 14 P.commune 2 2 2 Aspergillus parasiticus1033 2 3 21 23 Fusarium oxysporium 11 2 2 F.proliforium 1 1 1 Mucor racemosus 2 2 2 总数 Sum 291118 16 16 90 100 表 2 优势污染菌产黄曲霉毒素以及赭曲霉毒素 A 的特性 Table 2 Dominant fungal species and their aflatoxins and ochratoxin A producing potentials 真菌种类 Species 菌株号Strain No.AFG2 AFG1 AFB2 AFB1 OTA基因序列号GenBank No.Aspergillus parasiticus 3.13637+GQ340557 A.parasiticus 3.13640-+GQ340558 Penicillium polonicum 3.13639-+GQ340559 P.polonicum 3.13641-+GQ340560 P.crustosum 3.13638-GQ340556 P.commune 3.13636-GQ340555 图 1 赭曲霉毒素 A 的离子流色谱图 A：标准品；B：样品CGMCC 3.13637.Fig.1 Chromatogram of ochrotoxin A.A:Standard;B:Sample CGMCC 3.13637.338 Mycosystema http:/ 3.13640 的培养物中仅检测到 OTA，P.polonicum 的2 个菌株均能产生 OTA（图略），P.crustosum 以及P.commune 的培养物中，几种毒素均未检测到。图 1 为赭曲霉毒素 A（OTA）标准品以及菌株样品 CGMCC3.13637 的离子流色谱图，13.2min 处为 OTA 的特征峰，图 2 为黄曲霉毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1）以及菌株样品CGMCC3.13637的离子流色谱图，11.1，11.5，12.4，13.1min 处分别为 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1 的特征峰。图 2 黄曲霉毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1）的离子流色谱图 A：标准品；B：样品 CGMCC 3.13637.Fig.2 Chromatogram of aflatoxins.A:Standard;B:Sample CGMCC 3.13637.3 讨论 不同药材的污染优势菌不同，菌株的产毒特性也有所差别。Efuntoye（1996）对尼日利亚 8 种药材：印楝、芒果、黑胡椒、白花丹、麻风树、巴戟天、扁桃斑鸠菊、天堂椒的研究表明，污染菌以Aspergillus、Penicillium、Fusarium 属真菌为优势类群，其中 Aspergillus flavus 以及 A.parasiticus 主要产生 aflatoxin，而 Aspergillus ochraceus 主要产生OTA。Rizzo et al.（2004）报道了阿根廷药用和香料植物中的污染真菌及其产毒能力，他们的研究表明Aspergillus alliaceus、A.ochraceus 和 A.sclerotiorum主要产生 OTA。本研究以常用的药材甘草为研究材料，共分离得到 90 株真菌，其中优势种为 Penicillium polonicum 54%，Aspergillus parasiticus 23%以及 P.crustosum 14%。对这 3 种优势真菌的产毒素性质测定表明 A.parasiticus 是 aflatoxins（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1）的主要产生菌，A.parasiticus 以及P.polonicum 是霉变甘草中 OTA 污染的主要产生菌。与其他药材污染菌的研究结果相比，药材甘草上的污染菌类群有一定差异，尤其值得注意的是 P.polonicum 的分离频率最高，而已测定的该种 2 个菌株都能产生 OTA，该结果与甘草药材中 OTA 污染严重超标的情况（OTA 含量 84.4g/kg，未发表资料）吻合，说明甘草 OTA 污染风险亟需重视。Penicillium polonicum 是温带地区食品及饲料中非常普遍的污染菌，Mantle et al.（1991）报道该菌的水提物能引起实验小鼠肾脏的组织病理损害，与 OTA 毒素造成的肾损害症状相似。由于当时使用 HPLC 的方法并未在 P.polonicum 的培养物中检测到 OTA 的存在，因此将该菌产生的毒素暂称为肾毒素 nephrotoxin，但有关 nephrotoxin 的化学结构及性质一直未有新的进展。本文采用更灵敏的LC-MS 检测方法，结果表明 P.polonicum 的培养物能够产生 OTA，推测该菌所造成的组织病理损害可能是 OTA 和其他毒素共同作用的结果，关于该菌产OTA 毒素的比例、产生条件以及产量需更深入的研究来阐明。Aspergillus parasiticus 是最普遍的 aflatoxin 产生菌，Rizzo et al.（2004）报道在实验室相同的培养条件下，该菌的产毒菌株和非产毒菌株各占一半比例。本研究发现 A.parasiticus CGMCC 3.13637除了能产生 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1，还能产生 OTA。许多真菌能同时产生几种真菌毒素，而多种真菌毒素的共同作用的效果可能远远大于每种真菌毒素单独作用之和（Harvey et al.1989）。因此A.parasiticus 造成的污染可能涉及多种毒素的协同作用，比其他污染菌造成的危害更大。目前对于药材的防霉贮藏，常用的措施是控制药材含水量、环境湿度以及药材包装。针对甘草上易污染的产毒素真菌类群，适当的杀菌、抑菌技术可以起到更好的防霉效果。另外霉菌的生长和毒素的产生并不是同步的过程（Astoreca et al.2009），找到霉菌生长和毒素产生的条件差异，能在实际操作中最大限度的降低真菌毒素的安全风险，减少由于真菌污染造成的损害。Vol.29 No.3 339 菌物学报 致谢：感谢中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员在论文撰写中提出的宝贵意见；感谢王龙博士在菌株鉴定方面提供的指导。REFERENCES Astoreca A,Barberis C,Magnoli C,Combina M,Dalcero A,2009.Ecophysiological factor effect on growth rate,lag phase and ochratoxin A production by Aspergillus niger aggregate strains on irradiated peanut seeds.International Journal of Food Microbiology,129(2):131-135 Chen J,Xu LL,Liu B,Liu XZ,2007.Taxonomy of Dactylella complex and Vermispora.I.generic concepts based on morphology and ITS sequences data.Fungal Diversity,26:73-83 Efuntoye MO,1996.Fungi associated with herbal drug plants during storage.Mycopathologia,136(2):115-118 Efuntoye MO,1999.Mycotoxins of fungal strains from stored herbal plants and mycotoxin contents of Nigerian crude herbal drugs.Mycopathologia,147(1):43-48 Fu Y,Hsieh TC,Guo J,Kunicki J,Lee MY,Darzynkiewicz Z,2004.Licochalcone-A,a novel flavonoid isolated from licorice root(Glycyrrhiza glabra),causes G2 and late-G1 arrests in androgen-independent PC-3 prostate cancer cells.Biochemical and Biophysical 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Chinese)附中文参考文献 李继平，1993.甘草霉变原因及保管方法探讨.中药材，16(3):25-26 王玉庆，朱玫，2002.我国甘草资源调查与分析.山西农业大学学报，22(4):366-369 郑春英，李勇庆，2006.甘草解毒作用研究概况.黑龙江医药，19(4):246-247