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乙酰基转移酶 和 蛋白乙酰化在食管癌中的相关性研究 基金项目：承德市科学技术研究与发展计划项目（）；河北省医学科学研究重点课题计划项目（）通讯作者，：河北承德 承德医学院附属医院胸外科梁宗英，赵宝山，郑竞雄，侯继申，孙光蕊【摘 要】目的 探讨食管癌组织中乙酰基转移酶（）表达与 蛋白乙酰化水平，分析二者在食管癌发生过程中的相关性。方法 选取 例食管鳞癌组织及其癌旁正常食管黏膜组织。实时荧光定量聚合酶链反应（）检测 和 的表达，免疫组化及 检测 和 的蛋白表达，免疫荧光验证 和 在癌组织中的定位及表达；免疫共沉淀检测 乙酰化。分析 蛋白乙酰化与 的相关性及其二者与食管癌临床病理特征的关系。构建 干扰序列，脂质体介导法转染至食管癌 细胞。应用 和 检测转染 的食管癌 细胞中 和蛋白表达水平，免疫共沉淀检测 细胞中 蛋白乙酰化水平。结果 食管癌组织中 和 相对表达量高于癌旁组织（.）；食管癌组织中 和 蛋白呈高表达，而癌旁组织则呈低表达。免疫荧光证实 和 蛋白在癌组织中同时呈现高表达状态，二者主要表达于细胞质中，部分表达于细胞核中。食管癌组织中 蛋白发生了乙酰化，且食管癌组织中的乙酰化率显著高于癌旁组织（.）；在食管癌组织中 乙酰化和 表达呈正相关（.，.）；乙酰化和 表达与食管癌的 分期、分化程度和淋巴结转移有关（.）。体外实验显示，干扰下调 对食管癌细胞 和蛋白表达量均无影响（.），但 蛋白的乙酰化水平显著降低（.）。结论在食管病变过程中 参与了 乙酰化修饰，其高表达可能是 乙酰化修饰重要的前期分子事件，在食管癌的诊治中具有潜在应用价值。【关键词】食管癌；乙酰基转移酶；乙酰化修饰中图分类号：.文献标识码：文章编号：（），：，：【】（），（），（），（.），临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（.），（.，.），（.）（.），（.）【】；食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年增加。近年来针对食管癌的综合治疗使其生存率有所提高，但预后仍较差。现代研究发现，基因序列在不改变的情况下通过其表观遗传学的甲基化、乙酰化修饰改变可促进多种恶性肿瘤的发生和发展。蛋白的乙酰化修饰需要乙酰基转移酶的催化，乙酰化修饰后的蛋白功能会加强，参与肿瘤的发生和发展。前期研究表明，是一种抗凋亡基因，在食管癌组织中发生了乙酰化，并与食管癌的增殖、侵袭和转移密切相关。本研究旨在探讨食管癌中乙酰基转移酶 的表达及 蛋白的乙酰化水平，分析乙酰基转移酶 与 乙酰化的关系，进一步阐明 乙酰化修饰在食管癌发生和发展过程中的分子机制。材料与方法.组织标本和细胞收集 年 月至 年 月于承德医学院附属医院胸外科收治的食管鳞癌患者 例，取癌组织为实验组，同时取距癌组织边缘大于 且经病理证实无癌侵犯的正常食管上皮黏膜组织为对照组。纳入研究的患者均无其他肿瘤病史，手术前均无放化疗、免疫及靶向治疗史。例患者中，男性 例，女性 例；岁例，岁 例；分期：期 例，期 例，期 例；低分化 例，中分化 例，高分化 例；有淋巴结转移 例，无淋巴结转移 例。食管癌 细胞由承德医学院附属医院中心实验室提供。本研究经承德医学院附属医院伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。.主要试剂和仪器、和 抗体购自德国 公司；琼脂糖珠购自广州锐博生物科技有限公司。免疫组化 试剂盒和 提取试剂盒购自上海生博医学生物工程科技有限公司。引物及 干扰序列由广州锐博生物科技有限公司设计合成。.实验方法.检测提取组织或细胞总蛋白，测定浓度；制备电泳蛋白上样液，各孔加入电泳蛋白上样液 ，适当位置加入彩虹蛋白预染。电压电泳，当 进入分离胶时，电压转为 ，电泳 。电泳后，切取目标条带分质量 附近适当宽度，按胶大小剪膜，并剪切右上角标记膜正面，以正面贴近胶。以正极滤纸 膜胶滤纸负极顺序制作“三明治”。保持体系温度为 ，转膜。将转膜夹子从转膜装置中取出，置入洗膜液平皿中洗膜，脱脂奶粉 溶液中，封闭。再次重复洗膜 次。按比例孵育一抗，摇匀后，过夜。次日再次洗膜后，孵育二抗，室温孵育 。重复洗膜 次后显影。采用 软件分析蛋白条带的积分光密度 值。.免疫荧光法 组织切片二甲苯及乙醇脱蜡，清洗后抗原修复；湿盒内室温封闭；加一抗（抗体 ，抗体），过夜，复温 ，洗 次；加荧光标记的二抗；染色 ，洗 次；抗荧光淬灭封片剂封片，拍照。.免疫共沉淀（）组织提取蛋白质，加入 琼脂糖珠 和目的蛋白纯抗体 ，混匀后补充 裂解缓冲液至每管总体积 ，充分混匀，取蛋白上清 ，将离心管固定到混匀器上，共沉淀 。离心，弃上清液。裂解缓冲液 洗涤 琼脂糖珠。离心 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，弃上清液。重复洗涤 次，最后一次洗涤完毕后，弃去上清液。裂解缓冲液 和等体积的 上样缓冲液混合，煮沸 ，离 心；行 实验。免疫共沉淀中一抗 抗体的蛋白条带灰度值 总蛋白中 蛋白条带灰度值 蛋白乙酰化率。.免疫组织化学法染色 将组织切片脱蜡、破膜，高温修复抗原。切片自然冷却后山羊血清室温封闭。清洗后，在湿盒中一抗（兔抗人 单克隆抗体，；兔抗人 单克隆抗体，）孵育，过夜。次日二抗（山羊抗兔）孵育。显色，苏木素复染。结果判定标准：（）根据细胞染色强度评分：无着色为 分，淡黄色为 分，棕黄色为 分，棕褐色为 分；（）根据阳性细胞百分率评分：阳性细胞为 分，为 分，为 分，为 分。两项得分相加作为最终评分：分为阴性，分为阳性。.实时荧光定量聚合酶链反应（）提取试剂盒提取总，应用 按说明书进行反转录。用 荧光定量试剂盒检测 和 的表达水平，相对表达量以 计算。各引物序列见表。表 基因引物序列基因引物序列 上游引物：下游引物：上游引物：下游引物：上游引物：下游引物：.细胞培养、分组及转染 取细胞，应用 培养基混匀，离心；弃上清，培养基混匀后转入培养瓶；细胞 孵箱常规培养，将细胞培养至对数生长期后进行实验。以转染 细胞为实验组（），转染无 细胞为阴性对照组（），正常细胞为空白对照组（）。收集对数生长期细胞悬液，细胞计数，接种到 孔板中，常规培养。用 （）稀释.储存液（），轻轻混匀，室温孵育；加入 （），混匀后孵育；将 混合液加入到.细胞培养基（）中，使总体积达 ，混匀；继续培养 后荧光倒置显微镜下观察转染效果。.统计学分析 采用 .版软件进行统计学处理。计量资料用均数标准差表示，计数资料采用检验，配对样本两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用 相关检验。以.为差异有统计学意义。结 果.和 相对表达量 结果显示，在食管癌组织中的相对表达量为.，高于癌旁组织的.；在食管癌组织中的相对表达量为.，高于癌旁组织的.，差异有统计学意义（.）。见图。：癌组织；：癌旁组织；.图 和 在食管癌及癌旁组织中的相对表达量.和 蛋白在食管癌组织中的表达 蛋白在食管癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为.（）和.（），差异有统计学意义（.）；蛋白在食管癌组织中的阳性表达率为.（），高于癌旁组织的.（），差异有统计学意义（.）。免疫荧光结果显示，和 蛋白在食管癌组织中同时呈现高表达状态，二者主要表达于细胞质中，部分表达于细胞核中。见图、图。.和 蛋白表达量 蛋白在食管癌组织中的表达量为（.），高于癌旁组织的（.）；差异有统计学意义 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（.）。蛋白在食管癌组织中的表达量为（.），高 于 癌 旁 组 织 的（.），差异有统计学意义（.）。见图。.乙酰化水平 免疫共沉淀实验结果显示，蛋白在食管癌组织中的乙酰化率为（.），明显高于癌旁组织的（.），差异有统计学意义（.）。见图。.食管癌组织中 乙酰化与 的相关性分析 食管癌组织中 乙酰化蛋白的阳性表达率为.（），而 阳性表达率为.（）；乙 酰 化 蛋 白 和 同时阳性表达 例。相关性分析显示，食管癌组织中 蛋白乙酰化和 表达呈正相关（.，.）。见表。、：和 在癌组织中的阳性表达；、：和 在癌旁组织中的阴性表达；：癌组织；：癌旁组织图 和 在食管癌及癌旁组织中的表达（）图 和 在食管癌组织中的定位及表达（）：蛋白表达的电泳图；：蛋白表达量的柱状图；：食管癌组织；：癌旁组织；.图 检测 和 蛋白表达量：检测的电泳图；：蛋白乙酰化率；：癌组织；：癌旁组织；.图 食管癌和癌旁组织中 乙酰化水平 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，表 食管癌组织中 乙酰化与 的相关性分析 乙酰化阳性阴性阳性.阴性.乙酰化和 与食管癌临床病理特征的关系 乙酰化、阳性表达与食管癌的 分期、分化程度及淋巴结转移有关（.），而与性别和年龄无关（.）。见表。表 乙酰化和 蛋白表达与食管癌临床病理特征的关系临床病理参数乙酰化（）阳性性别.男.女.年龄（岁）.分期.分化程度.高.中.低.淋巴结转移.无.有.干扰下调 效果合成的 含有 红色荧光标记的标签，转染 细胞成功后荧光显微镜下可见细胞内有红色荧光表达（图）。检测结果显示，实验组 相对表达量为.，阴性对照组及空白对照组的相对表达量分别为.和.，实验组 表达量明显低于阴性对照组及空白对照组（.）。检测结果显示，实验组 蛋白表达量明显低于阴性对照组及空白对照组（.）。见图。：明视野；：荧光显微镜；：和 的叠加图 转染 细胞后荧光显微镜下观察结果：相对表达量；：蛋白表达；：组；：阴性对照组；：空白对照组；.图 干扰 后 和蛋白表达量.干扰 后各组细胞中 及蛋白表达 和 检测结果均显示，干扰下调 后，实验组 和蛋白的表达水平与阴性对照组和空白对照组比较，差异均无统计学意义（.）。见图。.干扰 对食管癌 细胞 乙酰化的影响 免疫共沉淀检测结果显示，干扰下调 后，实验组 蛋白乙酰化率为（.），明显低于阴性对照组和空白对照组的（.）和（.），差异有统计学意义（.）。见图。讨 论食管癌早期临床症状不典型，常易被忽略，当临床症状明显时，病情大多已进展为中晚期。尽管针对食管癌的诊疗手段已取得较大进展，然而由于手术连同放化疗的综合治疗对患者产生了较大 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：相对表达量；：蛋白表达；：组；：阴性对照组；：空白对照组图 干扰 后 和蛋白表达量：检测的电泳图；：蛋白乙酰化率；：组；：阴性对照组；：空白对照组；.图 干扰 后 蛋白乙酰化水平的创伤，使其预后差，相对生存率低。因此，提高食管癌的早期诊断率、发现评估预后的新指标是食管癌治疗的重中之重。食管癌在其发生和发展过程中，多种细胞成分的水平可能发生变化，其中一些可以用于肿瘤的检测，甚至可以用于监测恶性状态和预后，这也为食管癌的基因靶向治疗提供了新的思路。近代肿瘤分子学研究发现多种基因序列改变可以导致肿瘤的发生。目前临床上肿瘤的靶向治疗也大多针对肿瘤内特异基因序列改变而实现。现代医学研究发现，在基因序列无改变的情况下，基因的甲基化、乙酰化及泛素化修饰同样会影响肿瘤基因的转录、翻译和功能的改变，进而导致肿瘤的发生和发展。研究显示，基因转录翻译后生成的蛋白质乙酰化修饰在生命体中具有十分重要的作用，参与多种肿瘤的发生。以往研究大多数关注于组蛋白的乙酰化修饰在肿瘤中的作用机制，而近年研究发现非组蛋白也可以发生乙酰化修饰，并参与多种肿瘤的发生和发展。是一种凋亡抑制基因产物，在多种肿瘤中呈高表达，可以抑制肿瘤细胞凋亡，导致其异常增殖。已有研究发现，在食管癌组织中呈高表达，而且与食管癌的增殖、凋亡和侵袭相关。但目前关于 在食管癌中作用的研究均以基因的改变为切入点，关于 在表观遗传学方面的改变对肿瘤发生发展所起作用的研究鲜有报道。本研究发现，蛋白在食管癌组织中 相对表达量和蛋白表达量均明显高于正常食管黏膜组织；通过免疫共沉淀实验结果证实 蛋白在食管癌组织中发生了明显的乙酰化修饰，且乙酰化水平与食管癌的 分期、肿瘤分化 程 度 及 淋 巴 结 转 移 具 有 相 关 性。这 说 明 是一种乙酰化蛋白，而且其高表达及其乙酰化修饰参与了食管癌的增殖、侵袭和转移。这可能是因为 蛋白的乙酰化修饰改变了蛋白的构象，进而抑制了食管癌细胞的凋亡，促进食管癌的进展。乙酰化修饰需要在乙酰基转移酶的参与下完成，故乙酰基转移酶在蛋白质乙酰化修饰过程中的作用至关重要。属于一种组蛋白乙酰基转移酶，其不仅可以催化组蛋白发生乙酰化，而且也可以催化多种非组蛋白底物发生乙酰化，并参与癌症的发生和发展。本研究食管癌组织中 和蛋白的表达升高，且其癌组织中的阳性表达与肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移相关。随着肿瘤分期的增加、肿瘤分化程度的降低，蛋白的表达量逐渐上升，在淋巴结转移者中的表达明显升高。这提示 可能通过自身功能或者靶向调控其他基因和蛋白途径，促进食管癌细胞自身的增殖、侵袭和迁移，进而使得食管癌的恶性程度增强，导致其容易通过淋巴结发生转移。研究证实，抑制乙酰基转移酶的表达可以使肿瘤细胞内乙酰化蛋白的乙酰化状态发生改变。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，在沉默或下调乙酰基转移酶促进相关蛋白发生去乙酰化的作用机制中，沉默 有可能发挥更高的去乙酰化及抑制肿瘤细胞的作用。实验证实，抑制乙酰化转移酶的表达后，在不同的肿瘤细胞中通过去乙酰化途径抑制肿瘤细胞的作用亦不相同。这就说明，在不同肿瘤中对不同蛋白乙酰化的调控结局并不一致。但在食管癌中，作为乙酰基转移酶是否参与 乙酰化修饰 尚 不 明 确。本 研 究 分 析 了 食 管 癌 组 织 中 和 乙酰化水平的相关性，结果显示在食管癌组织中 乙酰化水平与 的阳性表达具有相关性，二者呈正相关。通过荧光组化实验证实，和 共同表达于食管癌细胞质，且二者同时呈现高表达状态。进一步通过体外验证 与 乙酰化相关性的实验结果显示，干扰沉默 后食管癌 细胞内 和蛋白表达无明显变化，说明沉默 对 的表达并无影响，但是实验组 乙酰化率却明显降低。这提示食管癌细胞内 作为乙酰基转移酶催化非组蛋白 的乙酰化修饰，进而调控食管癌的发生和发展。这也表明在食管癌发生发展过程中，作为乙酰基转移酶可能是调控 发生乙酰化的一个重要上游分子学事件。综上所述，在食管癌中 的表达与 乙酰化水平密切相关，的高表达可能促进了 的高乙酰化状态，二者可能是促进食管癌发生发展的重要生物学特征。本研究仅在组织和细胞水平证实乙酰基转移酶 通过 乙酰化对食管癌细胞产生影响，但其体内功能验证及其具体调控机制尚需进一步深入研究。这为食管癌的早期诊断及预后判断提供了分子生物学指标，具有十分重要的意义。参考文献 ，：，（），（）：赫 捷，陈万青，李兆申，等 中国食管癌筛查与早诊早治指南（，北京）中国肿瘤，（）：，：，（）：陈俊豪，丁 杰，李显，等 组蛋白去乙酰化酶及去甲基化酶抑制剂在胃肠道肿瘤的研究进展现代消化及介入诊疗，（）：，丁娇丽，张志鹏，刘婧，等 基于组蛋白去乙酰化酶设计的多靶点抗肿瘤药物研究进展 中国新药杂志，（）：梁宗英，侯继申，张 乐，等 食管癌 乙酰化水平与 表达的相关性及其临床意义 医学临床研究，（）：曹启迪，逯艳艳，马颖才 食管癌的早诊早治 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