单增李斯特菌基因组-DNA提取方法比较.pdf

张?喆,吕淑霞,祝儒刚,等.单增李斯特菌基因组 DNA 提取方法比较 J.江苏农业科学,2011,39(2):67-69.单增李斯特菌基因组 DNA提取方法比较张?喆,吕淑霞,祝儒刚,徐?斌,金雪花(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110866)?摘要:为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组 DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶 K 法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组 DNA,利用 PCR扩增结果判断所得 DNA样品的质量。结果为,3种不同方法均能扩增出 234 bp条带,溶菌酶-蛋白酶 K法提取的 DNA模板检出限最低,为 1.25?102CFU/mL。结论为,溶菌酶-蛋白酶 K 法提取的 DNA 模板进行 PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组 DNA 适用于 PCR扩增和其他分子生物学研究。?关键词:单增李斯特菌;DNA提取;聚合酶链反应(PCR)?中图分类号:Q78?文献标志码:A?文章编号:1002-1302(2011)02-0067-02?单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种短小的革兰氏阳性无芽孢杆菌,属人畜共患病的致病细菌,临床上主要导致脑膜炎、败血症和孕妇流产等。由于其高致病性,在国内外食品安全检测中日益受到重视 1。随着分子生物学的发展,应用 PCR方法对单增李斯特菌进行检测可以缩短检测时间,提高检测效率。提取高质量的基因组 DNA是进行食品安全性检测的前提,目前,从菌体中提取单增李斯特菌基因组DNA 的方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得 DNA的量及纯度各不相同,导致在后续试验中 PCR扩增、DNA 测序等应用效果的不同。本研究采用了 3种不同的 DNA 提取方法,针对单增李斯特菌的致病性基因片段设计 1对引物,对不同的方法提取出的 DNA 进行 PCR扩增,比较灵敏度,选择出一种简单,快速且灵敏度高的方法,为进一步进行单增李斯特菌的 PCR分子检测研究提供指导。1?材料与方法1.1?材料1.1.1?菌种?单增李斯特菌标准菌株为 ATCC19111,其他菌株均为笔者所在实验室保存。1.1.2?试剂?Taq DNA 聚合酶、dNTPs、10?PCR Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)、Loading Buffer、1 000 bp M arker,Ta KaRa公司;PCR引物选择种特异性 hly基因为目的基因,根据文献设计,由 TaKaRa公司合成,引物序列为 F:5?-CGGAGGTTC-CGCAAAAGATG-3?,R:5?-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3?,引物长度为 20 bp,退火温度 58?,扩 增片段长度为234 bp。其他试剂均为国产分析纯2。1.1.3?仪器?PCR仪,TECHNE公司;凝胶成像系统,伯乐收稿日期:2010-12-11基金项目:教育部留学回国人员基金(编号:2006-331);沈阳市科技局基金(编号:090009)。作者简介:张?喆(1984?),男,硕士研究生,主要研究方向为食品安全性检测。E-mai:l cn_zhangzhe 。通信作者:吕淑霞,女,博士,教授,博导,研究方向为微生物生物化学与分子生物学。E-mai:l lushux ia hot ma i.l com。公司。1.1.4?培养基?胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB-YE):胰蛋白胨 15 g,大豆蛋白胨 5 g,氯化钠 5 g,酵母膏 6 g,蒸馏水 1 000mL,p H 值 7.4。1.2?方法1.2.1?菌株培养?单增李斯特菌接种于胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基中,37?过夜增菌培养。1.2.2?基因组 DNA 提取方法1.2.2.1?溶菌酶-蛋白酶 K 法?(1)取过夜培养的菌液500?L加入 1.5mL离心管中,12 000 r/m in离心 10m in得菌体,弃上清液;(2)95?L无菌蒸馏水重悬,加入 4?L溶菌酶(50mg/mL),用枪头混匀,37?温浴 15m in;(3)加入 1?L蛋白酶 K(20mg/mL),振荡数秒,置于 58?恒温水浴锅内孵育 50m in;(4)95?加热 8 m in,使酶失活;(5)12 000 r/m in离心 5m in,取上清液备用。1.2.2.2?氯仿/异戊醇法?(1)取过夜培养的菌液 500?L加入 1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心 10m in得菌体,弃上清液;(2)100?L无菌蒸馏水重悬 DNA,加入 100?L T ris-酚,轻轻混匀后,12 000 r/m in离心 5m in,去上清液转移至新离心管中;(3)加 入 100?L 氯 仿/异戊 醇,颠倒 混匀后,12 000 r/min 离心 5m in,转移上清液至新离心管中;(4)加入预 冷 的2倍 体 积 的 无 水 乙 醇,混 匀 后,12 000 r/min离心 10m in,弃上清液;(5)加入 40?L无菌蒸馏水,-20?保存备用。1.2.2.3?液氮冻融法?(1)取过夜培养的菌液 500?L加入1.5 mL离心管中,12 000 r/m in离心 10 m in得菌体,弃上清液;(2)加入 95?L无菌蒸馏水混匀,放入 100?沸水中静置1 m in,立 即 转移 至 液氮 中 冷冻 2 m in,反 复 5 次;(3)12 000 r/min离心 5m in,取上清液备用。1.2.3?PCR 检测?以提取的基因组 DNA为模板,用单增李斯特菌 hly 基因的特异引物进行 PCR 扩增。反应体系为30?L:模板 DNA 1?L;DNATaq 聚合酶(5 U/?L)0.3?L;10?PCR Buffer 5?L;dNTP(2.5mmol/L)1?L;上、下游引物(10 pmol/?L)各 1?L;灭菌去离子水 20.7?L。循环参数为:95?预变性 2m in,94?变性 50 s,58?退火 30 s,72?延伸30 s,30个循环,最终 72?延伸 5 min。PCR 产物用 2%琼脂?67?江苏农业科学?2011年第 39卷第 2期糖凝胶电泳检测。1.2.4?特异性检测?取单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、热带假丝酵母、伤寒沙门氏菌、芽孢杆菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌纯培养物制备细菌基因组 DNA,进行 PCR 扩增反应与电泳检测分析。1.2.5?灵敏度分析?分别取 10倍梯度稀释的菌液 1 mL进行平板菌落计数,各稀释度至少重复 3次,取每个平板上菌落数在 30 300个进行计数。最后取其平均值作为纯培养菌液浓度;取 10倍梯度稀释的菌液 500?L,按照上述 3种方法提取基因组 DNA,进行 PCR检测。2?结果与分析2.1?单增李斯特菌的特异性检测单增李斯特菌的基因组 DNA 能扩增出 234 bp的特异性片段,非单增李斯特菌没有特异条带产生(图 1)。说明本试验建立的 PCR快速检测方法具有良好的特异性。2.2?不同方法提取基因组 DNA的 PCR检测灵敏度平板计 数得出 过夜 培养 菌 液菌 落数 为 1.25?108CFU/mL。单增李斯特菌为革兰氏阳性菌,细胞壁较厚,常规方法不易去除细胞壁,因此不同方法提取的 DNA 质量不同,用它们做模板进行 PCR 扩增的结果也不相同。分别用 3种方法对梯度稀释的菌液提取基因组 DNA 后进行 PCR检测,如图 2、图 3、图 4所示。?用特异引物 hly 对 3种方法提取的基因组 DNA 进行PCR扩增,扩增后的电泳图谱可以看出 3种方法提取的 DNA模板都能扩增出条带,并且产物条带亮度随着模板浓度的降低而减弱。但溶菌酶-蛋白酶 K法 提取的基因组 DNA经PCR扩增灵敏度可以达到 1.25?102CFU/mL,而氯仿/异戊醇法和液氮冻融法提取的基因组 DNA经 PCR扩增后灵敏度为 1.25?103CFU/mL。酶化法提取的基因组 DNA 作为模板灵敏度高,重复性好,结果理想。3?讨论比较了 3种不同的基因组 DNA提取方法,结果表明,溶菌酶-蛋白酶 K 提取的基因组 DNA经 PCR扩增灵敏度高于液氮冻融法和氯仿/异戊醇法,达到了 1.25?102CFU/mL,后2种方法提取的基因组 DNA 经 PCR 扩增后灵敏度都是 1.25?103CFU/mL,与国内外的报道一致3-6。究其原因,单增李斯特菌为革兰氏阳性菌,细胞壁厚,常规方法难以破碎细胞壁,或者细胞壁破碎不完全,不能使得细胞中 DNA 释放出来 7-8。而溶菌酶-蛋白酶 K 法由于使用了溶菌酶来破坏细菌的细胞壁以及用蛋白酶 K 降解随着细胞破裂而释放出来的蛋白质,而在 PCR检测中蛋白质会影响到检测结果的灵敏度,因此溶菌酶-蛋白酶 K 法提取的基因组 DNA 比其他 2种方法灵敏度高。从 3种提取基因组 DNA方法的操作程序上看,溶菌酶-蛋白酶 K法只要加入 2种酶,不需要复杂的操作。而氯仿/异戊醇法步骤复杂,且要用到有毒或有腐蚀性的有机试剂,对试验人员易造成伤害;液氮冻融法的步骤简单,可以满足一般PCR反应的要求,但是对于食品安全性检测要求灵敏度较高的试验,由于其步骤简单,没有相应去除蛋白质的步骤,因此灵敏度不高。本研究中获得的结果都是经过 3次以上的重复试验,这(下转第 69页)?68?江苏农业科学?2011年第 39卷第 2期张?婷,刘双青,郭淑倩,等.油茶 AFLP分子标记体系的建立 J.江苏农业科学,2011,39(2):69-71.油茶 AFLP分子标记体系的建立张?婷1,2,刘双青2,郭淑倩2,姚?瑶2(1.荆楚理工学院生物工程学院,湖北荆门 448000;2.武汉生物工程学院生物技术系,湖北武汉 430415)?摘要:以油茶 DNA为材料,对 AFLP分析中的基因组 DNA 酶切用量、连接液稀释倍数、预扩增产物稀释倍数、M g2+浓度等 4个因素进行优化比较。结果表明,用 EcoR?和M se?双酶切 500 ng基因组 DNA 效果最好,酶切产物加接头后稀释 10倍进行预扩增效果较好。在 M g2+浓度为 50?mol/L时,预扩增产物稀释 90倍作为选择性扩增模板,扩增效果最佳。此体系的建立为 AFLP在油茶遗传多样性研究中的应用打下了基础。?关键词:油茶;AFLP;酶切?中图分类号:S794.4?文献标志码:A?文章编号:1002-1302(2011)02-0069-03(上接第 68页)表明建立的检测方法有较好的重复性,所提取出来的模板DNA 适用于食品安全性快速检测的需求。参考文献:1 G rayM J,Zadoks R N,FortesE D,et a.l Listeriamonocytogenes iso-lates from foods and humans for m distinct but overlapping populations J.ApplEnvironM icrobio,l 2004,70:5833-5841.2 ZhouX,JiaoX.Polymerase chain reaction detection ofListeria mono-cytogenes using oligonucleotide pri mers targeting actA gene J.Foodcontro,l 2005,16:125-130.3李盛丰,赵?娇,钟名华,等.单增李斯特菌不同 PCR 快速检测方法比较 J.中国公共卫生,2008(8):1021-1023.4王?彬,倪宏波.单核细胞增生李斯特菌毒力因子研究进展 J.黑龙江八一农垦大学学报,2008(2):62-67.5苏靖华.不同方法检测食品中单核细胞增生李斯特菌比较 J.上海预防医学杂志,2009(8):383-384.6Liu D,A ins worth A J,A ustin FW,et a.l U seofPCR pri mers derivedfrom aputative transcriptional regulatorgene for species-specificde-ter m ination of Listeria monocytogenes J.International Journal ofFoodM icrobiology,2004,91:297-304.7谭丙乾.单核细胞增多性李斯特菌 PCR和 PCR-ELISA检测方法的建立 D.武汉:华中农业大学,2008:72-74.8巢国祥,徐?勤,周晓辉,等.单核细胞增生李斯特菌 PCR 快速检测方法建立及应用 J.中国人兽共患病杂志,2004,20(9):797-800.?AFLP(a mplified fragment length polymorphis m,扩增片段长度多态)是 RFLP和 PAPD相结合的一种标记技术,它主要对基因组 DNA 限制性酶切后,对酶切片段进行选择性扩增,不同个体中存在碱基突变会增加或减少酶切位点,造成酶切片段的长度不等,产生多态性。AFLP由于检测效率高、可靠性好、重复性高、多态性高等特点而受到遗传育种学家的青睐,被广泛用于动植物分子标记辅助育种的相关领域1-2。油茶(Camellia oleifera)系山茶科山茶属油料植物,是我国南方的特有树种,与油棕、油橄榄、椰子并称为世界四大木本油料树种3。油茶的主要产品是茶油,具有很高的社会经济价值。油茶与其他茶科植物相比,分子水平的研究开展较晚。本研究对油茶 AFLP分析体系中的关键因素进行了优化,为 AFLP分子标记技术在油茶遗传多样性研究中的应用打下基础。1?材料与方法1.1?材料油茶植株幼嫩叶片采自湖北武汉新洲地区,置于事先准备好的冰盒中带回实验室,-20?长期保存。收稿日期:2010-06-02基金项目:湖北省教育厅项目(编号:B20094001);武汉市教育局项目(编号:2008K080)。作者简介:张?婷(1980?),女,湖北襄樊人,硕士,讲师,研究方向为生物化学与分子生物学。E-mai:l ztx ianyun 。1.2?试剂试验采用的限制性内切酶 EcoR?、M se?为 NEB公司产品。T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合 酶、dNTPs和 DL 2000marker购自宝生物工程(大连)有限公司,本试验中的 EcoR?接头、M se?接头、预扩增引物、选择性扩增引物由上海生工生物工程技术服务公司合成(表 1)。表 1?试验中的 AFLP引物引物引物序列(5?3?)缩写EcoR?接头CTCGTAGACTGCGTACCAd-E-1AATTGGTACGCAGTCAd-E-2M se?接头GACGATGAGTCCTGAGA d-M-1TACTCAGGACTCATA d-M-2预扩增引物GACTGCGTACCAATTCPre-EGATGAGTCCTGAGTAAP re-M选择性扩增引物GACTGCGTACCAATTCAAE-CAAGATGAGTCCTGAGTAAGAM-AGA1.3?方法1.3.1?基因组 DNA 的提取?采用改良的 CTAB法提取基因组 DNA 4,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果,并将基因组DNA 稀释至 100 ng/?L,保存备用。1.3.2?基因组 DNA 的酶切反应?基因组 DNA 的双酶切反应总体积 20?L,基因组 DNA 用量设 5个梯度:100、300、500、700、900 ng,EcoR?限制性内切酶(20 U/?L)0.5?L,M se?69?江苏农业科学?2011年第 39卷第 2期