超高效液相色谱-串联质谱联用法测定香精香料中的香豆素和黄樟素.pdf

超高效液相色谱 串联质谱联用法测定香精香料中的香豆素和黄樟素黄善松，范 忠*，黄世杰，王维刚，蒋宏霖，朱 静，陆冰琳(广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西南宁 530001)摘要 目的 准确快速地测定香精香料中的香豆素和黄樟素。方法 以 60%乙醇水溶液为溶剂，样品经振荡萃取后，提取液经 0 22m 滤膜过滤，采用超高效液相色谱 串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定香豆素和黄樟素。结果 该方法回收率的结果在 950%994%，日内、日间测定结果的变异系数分别小于6%和8%，香豆素和黄樟素的定量限分别为770 和681 g/kg。结论 该方法可有效去除杂质干扰，分析时间短，具有高灵敏度、高精密度、高准确度等优点，适用于香精香料中的香豆素和黄樟素的测定。关键词香豆素;黄樟素;香精香料;超高效液相色谱 串联质谱联用法中图分类号S6099文献标识码A文章编号0517 6611(2014)20 06805 02UPLC-MS/MS Determination of Safrole and Coumarin in FlavorHUANG Shan-song，FAN Zhong et al(Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co，Ltd，Nanning，Guangxi 530001)Abstract ObjectiveThe research aimed to obtain accurate and rapid determination of Safrole and Coumarin in flavor MethodWith 60%ethanol water solution as solvent，the sample was extracted and oscillated，the solvent was filtered with 0 22 m filter membrane Safrole andCoumarin was determined by UPLC-MS/MS，esultThe limit of quantifications of Safrole and Coumarin were 770 and 681 g/kg，respec-tively The intra-day and inter-day precision was less than 6%and 8%，respectively The recoveries of the spiked sample wre 950%to 994%ConclusionThe method effectively removed impurities and reduced extremely the preprocessor time It was concluded that the method had highrecovery，high sensitivity and good reproducibility The developed analytical method had been applied successfully to the determination of Safroleand Coumarin in flavorKey wordsSafrole;Coumarin;Flavor;UPLC-MS/MS基金项目广西区科技厅科技攻关项目(桂科攻 11194006)。作者简介黄善松(1971 )，男，广西桂林人，工程师，从事卷烟产品方面的研究。*通讯作者，从事烟草化学研究。收稿日期2014-06-10美国食品和药品管理局(FDA)早在 1954 年就禁止在食品中添加香豆素，英国食品标准化委员会也于 1965 年就将香豆素列为禁止在食品中使用的添加剂，我国也禁止将其作为食品添加剂1。黄樟素主要来源于植物精油，曾用作饮料和食品中香料2。黄樟素能在肝组织中形成黄樟素 脱氧核糖核酸(DNA)加合物，食物中黄樟素的含量在 0 5%以上时引起肝细胞瘤，有致癌作用，是消化系统、血液系统、泌尿系统的强致癌物，世界各国均禁止使用3。在香精、香料生产过程中有可能由天然植物精油带入黄樟素、香豆素等成分，因此对香精香料中香豆素和黄樟素进行测定和质量控制是非常必要的。目前，香豆素和黄樟素的测定方法主要有气相色谱4、液相色谱5 6 和气相色谱 质谱联用法7、气相色谱 串联质谱法8 9。超高效液相色谱 串联质谱联用法具有更好的分离度和选择性、更高的灵敏度和更快的分析速度。但目前采用超高效液相色谱 串联质谱联用法同时测定香精香料中黄樟素和香豆素的方法未见报道。因此，笔者采用超高效液相色谱分离，电喷雾串联质谱进行定性和定量，建立了灵敏度高、准确可靠的超高效液相色谱 串联质谱联用(UP-LC-MS/MS)的测定方法。1材料与方法11材料主要仪器:Agilent 1290 超高效液相色谱仪，美国Agilent 公司;API 3200 三重四极杆串联质谱联用仪，美国 AB公司;多功能全自动振荡仪;分析天平(感量01 mg)。主要试剂:香豆素、香豆素-d4，购自 Dr Ehrenstorfer Gm-bH 公司，纯度98%;黄樟素购自迪马公司，纯度97%;乙腈为色谱纯，水为去离子子水，其他试剂均为分析纯。12供试溶液的制备称取香豆素 0 01 g，黄樟素 0 01 g，精确至 0000 1 g，以60%乙醇水溶液定容至 500 ml，再通过稀释配含黄樟素和香豆素分别为 5 g/ml;称取一定量香豆素-d4，用 60%乙醇水溶液配制浓度为 125 g/ml 的内标溶液。13样品前处理称取约 03 g(精度 0 001 g)香精香料于50 ml 三角瓶中，加入 40 l 内标溶液，然后用移液管移取 10ml 60%乙醇水溶液，振荡萃取 10 min，转速 150 r/min，取上层清液，经022 m 尼龙滤膜过滤后，供 UPLC-MS/MS 测定。14分析条件色谱条件:色谱柱为 Agilent ZOBAX Sta-bleBond SB-C18色谱柱(100 mm 21 mm，粒径18 m);进样量 5 l;柱温为40;流动相为02%甲酸溶液 乙腈(体积比 4060)，等梯度洗脱;流速为 0 25 ml/min，总分析时间为5 min。质谱条件:质谱检测采用 ESI 离子源，在正离子检测方式下，选择 MM 工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为:雾化气 345 105Pa，辅助加热气 3 45 105Pa，气帘气 689 104Pa，电喷雾电压 5 000 V，干燥温度 600。具体化合物的 MM 分析参数见表 1。表1各种待测物及内标的 MM 参数化合物母离子(m/z)子离子(m/z)驻留时间ms去簇电压V碰撞能量V保留时间min香豆素14719111005527199147110311005515199黄樟素162913001003127272162911721003135272香豆素-d415119511005527195151110711005515195注:加粗字为定量用的参数，非加粗字为辅助定性参数。安徽农业科学，Journal of Anhui Agri Sci 2014，42(20):6805 6806，6844责任编辑李菲菲责任校对况玲玲DOI:10.13989/ki.0517-6611.2014.20.1052结果与分析21质谱条件的优化在正离子模式下以流动注射的方式先对1 mg/L 香豆素等目标化合物的标准溶液进行母离子全扫描，确定其母离子，然后分别以其分子离子选择其子离子(碎片)，每种物质先选择 2 个碎片，再从中选取信号较强、又无互相干扰的碎片定性和定量参数(表1)。22色谱条件及色谱柱的选择在流动相中加入 0 2%甲酸水溶液有助于香豆素等目标化合物 M+H+母离子的形成，并能增强检测的灵敏度。为选择适宜的色谱柱，对 3 种类型的色谱柱:ZOBAXStableBond SB-C18柱、ZOBAX Eclipse Plus C18柱和 WatersSymmetry C18柱的分离效果进行了比较。结果显示，ZOBAXStableBond SB-C18柱可以实现香豆素和黄樟素的良好分离，且峰形好，分析时间短(图1)。注:1、2、3 为标准品，4、5、6 为样品。图1标准品及样品中香豆素、黄樟素、香豆素-d4的 MM 色谱2 3提取液的考察该试验考察了不同体积比甲醇水溶液、不同体积比乙醇水溶液作为提取溶剂的提取效率。结果发现，60%乙醇水溶液的提取效果较好，回收率高，还可降低样品中有机杂质进入色谱柱中的量，减少基质效应，并有效保护色谱柱。因此，该方法选择 60%乙醇水溶液作为提取液。24标准曲线、方法检测限取混合储备液 0 05、0 10、050、100、2 00、4 00、8 00 ml，各加入内标溶液 40 l，用60%乙醇水溶液定容至 10 ml，摇匀，得 7 级工作标准溶液。对上述系列标准溶液进行 UPLC-MS/MS 分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，得到标准曲线、线性范围和相关系数(表 2)。以 3 倍信噪比(S/N)为检测限，10 倍信噪比(S/N)为定量限，结果见表2。表2分析方法的线性范围、标准曲线、相关系数、检测限和定量限化合物线性范围g/L标准曲线相关系数检测限g/kg定量限g/kg香豆素250 4 0000Y=0036 5X+0040 10999 9231770黄樟素250 4 0000Y=0056 5X+0030 50999 820468125精密度和回收率试验精密度试验:取同一样品进行 5次日内和日间平行测定，考察了方法的精密度，得出该方法日内、日间测定结果的变异系数分别小于 6%和 8%，说明该方法精密度高。回收率试验:在高(样品中目标物含量 2 倍)、中(样品中目标物含量 1 倍)、低(样品中目标物含量 0 5 倍)3 个水平上进行了样品加标回收率的测定。结果表明，回收率的结果在 950%994%，回收率良好。26实际样品的测定采用该方法对市场上的 80 多种香精香料样品进行香豆素和黄樟素的检测，其中 3 个样品中检出香豆素(含量分别为 137 1、456 0、25 1 mg/kg)，1 个样品中检出黄樟素(含量为 1415 g/kg)。3结论该试验建立了快速准确测定香精香料中的香豆素和黄樟素的 UPLC-MS/MS 测定方法。该方法简便、快速、准确，日(下转第 6844 页)6086安徽农业科学2014 年家庭农场在农业技术推广中的作用。该家庭农场主营花生、薯类农作物种植及鸡、生猪饲养，有农业人口 5 人，劳动力 4人，经营租赁河滩荒地 14 67 hm2，租期 17 年，拥有农用车 2台，拖拉机3 台，其他农机10 多台(套)。311农场主对科学技术的要求最为迫切。该农场主在种植地膜花生、地膜土豆的过程中，多次到县农业局学习种植技术，并经常到种植大户那里参观学习，只要有机会就索要相关资料，掌握生产全过程技术，努力做好防病治虫工作。短短2 年时间，农场主就从一名“门外汉”，成为了让附近农民刮目相看的科技致富能人。312农场主以科学技术提高农业生产效率。该农场过去是鹅卵石滩涂荒地，通过对沙石的清理改造，变成了如今的平整松软的良田。因此农场主对土地资源极其珍惜，采用引进良种、配方施肥、地膜覆盖等技术，提高土地单产。2013 年该农场主利用冬闲时节规范种植 13 33 hm2优质土豆，单位面积产量超过375 万 kg/hm2，产值超过 160 万元。313农场主以现代农业提高生产力。现代农业最显著的特征就是农业机械现代化，为了提高工作效率，农场主对现有的品种、机械都有明确的选择，不断追求新品种、新机械的配套，促进了农业技术的推广和发展。32家庭农场应该是农场技术推广的主体321家庭农场扩张必然需求农业技术的进步。家庭农场是现代农业生产的基本单位，也是作为家庭收入的主要来源。2013 年农村居民人均纯收入 8 896 元，要把新生代农户留在土地上，必然其收入要与外出务工收入相当或更高，而传统的耕作方式是不可能达到如此高的收入，只有通过掌握现代农业技术才有可能实现。322家庭农场成员必须掌握现代农业技术。现在农村劳动力的价格普遍上涨，传统方式的农业生产已经无法承载这种变化，作为家庭农场只有规模经营和生产高附加值产品，才能保证收入的稳定增长。要达到这个目标，就要求提高农户的科学种田水平。很多地方规定，要成为职业农民就必须有一定的文化知识，通过培训掌握一定的生产技能，获得新型农民证书后，才有资格注册家庭农场，从而适应现代农业的要求，充分发挥科学技术进步带来的效益。323家庭农场水平提高要与农业机械配套。家庭农场的农场主，要扩大生产规模2，提高农业经济收入，也必然要提高自身的机械化水平。据 2013 年统计，全国小麦基本实现全过程机械化，水稻机械种植水平达到 30%，玉米机收水平达到 40%，油菜、棉花机械化水平还不到 10%。由于我国的土地和人口分布差异较大，形成了北方人少地多和南方人多地少的格局，尤其是西南地区有较多的山地，土地面积小，坡度大，不适合大型机械化耕作，而过去是以家庭联产承包制的生产模式，农户是不可能投入较多的机械设备，从而长期制约了我国南方的农业生产。当前家庭农场不断涌现，规模不断扩大，迫使家庭农场推广适合本地的生产机型，从而促进了农业机械的推广。324家庭农场将是农业推广的主力军。随着我国经济水平的提高，家庭联产承包责任制下的小农户经营的优越性已不再明显。家庭农场顺应了劳动力转移、城镇化建设、农机加速推广的历史发展进程，有效地整合了土地、劳力、农机资源，在未来农业的发展和多元化农业科技创新体系的构建中，将加快我国农业科技创新和推广的发展3。4发展家庭农场促进农业技术推广的对策建议41扩大农场规模，促进规模效益我国的农业过去一直是小户经营，规模相当小，只有不断通过流转的方式，形成规模化的家庭农场，使农场主成为职业农民，才能深入地学习钻研农业技术，从而促使农民把农业技术推广变成一种自觉的行动。42加快农村土地确权工作，促进农业用地有效流转加快土地承包经营权确权登记工作，建立规范的土地流转机制，产生更多更大的家庭农场，更好地推动农业技术推广。43加大政策支农力度，培养家庭农场技术人员加大扶持家庭农场力度，为家庭农场的发展创造良好的政策环境。农业技术推广工作能否顺利实现，最终还是取决于对家庭农场人员的培养，让他们都成为“专家”，可以更好地解决推广工作当中所遇到的各种问题，尽快实现农业技术推广的价值。参考文献 1王嘉康浅谈家庭农场的发展 J 上海农村经济，2011(6):37 40 2黄延廷家庭农场优势与农地规模化的路径选择 J 重庆社会科学，2010(5):21 24 3李雅莉农业家庭农场优势的相关理论探讨 J 农业经济，2011(7):14檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪15(上接第 6806 页)内、日间测定结果的变异系数分别小于 6%和 8%，回收率的结果在95 0%99 4%，香豆素和黄樟素的定量限分别为770 和681 g/kg，可用于香精香料中的香豆素和黄樟素的确证检验。参考文献 1凡实 食品添加剂的使用要求与管理 J 肉类研究，2003(4):30 33 2孙凌峰，汪洪武，汤敏燕黄樟素的天然来源及其在合成香料中的利用 J 香料香精化妆品，1998(2):14 17 3章瑜，陈跃进 黄樟油的毒性研究 J 苏州医学院学报，1995，15(2):241 242 4周贻兵，滕明德，张明时毛细管柱气相色谱法测定烟用香精中黄樟素和香豆素 J 理化检验(化学分册)，2011(1):39 40，43 5刘正聪，陆舍铭，王海利，等 超高效液相色谱法测定天然原料中的香豆素含量 J 香料香精化妆品，2009(4):27 29 6杨运红HPLC 测定烟用香精中的香豆素和黄樟素 J 光谱实验室，2012，29(4):2330 2334 7吴惠勤，朱志鑫，黄晓兰，等 气相色谱 质谱联用法测定烟用香精中黄樟素及香豆素 J 理化检验(化学分册)，2010(6):607 609 8李长于，李祖光，周示玉，等 气相色谱 串联质谱法测定香精香料中的香豆素和黄樟素 J 质谱学报，2011(5):265 270 9李长于，李祖光，周示玉，等 顶空固相微萃取 气相色谱 串联质谱法测定香精香料中黄樟素 J 理化检验(化学分册)，2013(2):216 218，2214486安徽农业科学2014 年