炎症微环境中ERN1调节软骨细胞炎症因子的实验研究_梁利.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（2）：314-324杂志网址：http:/炎症微环境中ERN1调节软骨细胞炎症因子的实验研究*梁利，邓琳，罗瑞，冯乃波，李小丽，范梦恬，郭风劲（重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室，重庆 400016）摘要 目的：探讨内质网到细胞核信号1（endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1，ERN1）基因对炎症微环境中软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的影响。方法：通过CRISPR-Cas9系统构建人ERN1基因敲除的C28/I2软骨细胞株（ERN1 KO）；从C57BL/6J背景的ERN1软骨特异性敲除（ERN1 cKO）小鼠软骨组织分离原代软骨细胞，分别为对照组（ERN1flox/flox）、ERN1 cKO组（ERN1flox/flox-Col2Cre+）；在C28/I2人正常软骨细胞中过表达ERN1腺病毒（AdERN1），以AdGFP为对照组；实验采用10 g/L白介素1（interleukin-1，IL-1）诱导过表达ERN1软骨细胞或ERN1缺陷软骨细胞，形成炎症微环境，用qPCR和Western blot检测IL-1处理ERN1缺失或过表达ERN1细胞后，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-4、IL-6、IL-10等炎症因子和软骨分解代谢标志物基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）、含血小板结合蛋白基序的解整联蛋白及金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS5）的表达。前交叉韧带切除（anterior cruciate ligament resection，ACLT）术制作ERN1 cKO小鼠骨关节炎（osteoarthriti，OA）模型，免疫组化法检测软骨组织TNF和IL-1的表达。结果：成功将ERN1单向导RNA（sgRNA）构建至LentiCRISPRv2载体，并在C28/I2细胞中成功筛选出ERN1敲除稳定细胞株。qPCR 结果显示，在体外炎症微环境中，敲除 ERN1可上调软骨细胞促炎细胞因子 IL-6和 TNF mRNA水平（P0.05），下调抗炎细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平（P0.05）。Western blot结果显示，当软骨细胞处于炎症微环境中，敲除ERN1可显著上调TNF表达（P0.05），增强ADAMTS5和MMP13的表达（P0.05），而过表达ERN1则显著抑制TNF表达（P0.05）。免疫组化法结果显示，ACLT术后ERN1 cKO可促进TNF、IL-1表达。结论：ERN1基因通过调节促炎及抗炎因子平衡参与炎症反应。关键词 ERN1基因；炎症因子；软骨细胞；软骨分解代谢中图分类号 R329.2；R363.2+1 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.014Regulatory effect of ERN1 on biological properties of chondrocytes in an inflammatory microenvironmentLIANG Li，DENG Lin，LUO Rui，FENG Naibo，LI Xiaoli，FAN Mengtian，GUO Fengjin（Department of Cell Biology and Genetics，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To explore the effect of endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1（ERN1）gene on the biological properties of chondrocytes in an inflammatory microenvironment.METHODS：The ERN1 knockout C28/I2 human normal chondrocyte cell line ERN1 KO was constructed by CRISPR-Cas9 system.Primary chondrocytes from ERN1 cartilage-specific knockout mice with C57BL/6J background were isolated，and the experiments were divided into control group（ERN1flox/flox），ERN1 cKO group（ERN1flox/flox-Col2Cre+）.ERN1 adenovirus（AdERN1）was over-expressed in C28/I2 human normal chondrocytes，with AdGFP as the control group.Interleukin-1（IL-1）at 10 g/L was used in chondrocytes to form an inflammatory microenvironment.The expression of inflammatory factors tumor necrosis factor （TNF），文章编号 1000-4718（2023）02-0314-11 收稿日期 2022-08-22 修回日期 2022-11-01*基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81871769）；重庆市科委面上项目（No.cstc2020jcyj-msxmX0175）；重庆市科委博士后科学基金项目（No.cstc2021jcyj-bshX0214）；重庆医科大学研究生拔尖人才培育项目（No.BJRC202019）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：314IL-4，IL-6 and IL-10，and cartilage catabolism markers matrix metalloproteinase 13（MMP13）and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5（ADAMTS5）in chondrocytes after ERN1 deletion or overexpression in the inflammatory microenvironment induced by IL-1 was detected by qPCR and Western blot.RESULTS：The ERN1 sgRNA was successfully constructed into LentiCRISPRv2 vector，and ERN1 knockout stable cell line were successfully screened in C28/I2 cells.qPCR results showed that in the inflammatory microenvironment in vitro，ERN1 deficiency up-regulated the mRNA levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF in chondrocytes（P0.05），and down-regulated the mRNA levels of anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10（P0.05）.Western blot results showed that when chondrocytes were in the inflammatory microenvironment，ERN1 deficiency significantly up-regulated the expression of pro-inflammatory cytokine TNF（P0.05），and enhanced the expression of cartilage catabolism markers ADAMTS5 and MMP13（P0.05）.The expression of TNF was significantly inhibited after over-expression of ERN1（P0.05）.CONCLUSION：ERN1 regulates the inflammatory sensitivity of chondrocytes by regulating the levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors，and then participates in the inflammatory response.KEY WORDS ERN1 gene；inflammatory factors；chondrocytes；cartilage catabolism软骨细胞作为软骨中存在的唯一细胞，是软骨基质分解代谢的主要来源，其维持基质成分的平衡1。在正常生理条件下，软骨成分的降解和合成保持动态平衡。同时，由年龄、肥胖、代谢紊乱、创伤、劳损、遗传等因素引起的炎症都是诱发骨关节炎的重要因素2。据报道，炎症细胞因子如 IL-1 和TNF等通过调控炎症介质的产生和一系列基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族成员的表达，在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的发病机制中发挥着重要作用3。IL-1启动炎症相关信号通路的激活并刺激 MMPs的表达，从而导致软骨基质的破坏4。因此，抑制IL-1和IL-1诱导的炎症介质表达会减缓OA的进展5-6。大量研究表明未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）参 与 机 体 的 免 疫 应 答 和 炎 症 反应7-8。人肌醇需求酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）是位于内质网膜的跨膜蛋白，由内质网到细胞核信号1（endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1，ERN1）基因编码，是UPR的重要分子传感器，参与调节蛋白质折叠和维持肉质网（endoplasmic reticulum，ER）稳态9。IRE1与软骨或骨骼生长和发育密切相关10。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的定向诱导可导致软骨产生Schmid型干骺端软骨发育不全病理变化11。IRE1的缺乏会增加软骨细胞的凋亡，而IRE1的激活会增强软骨 细 胞 的 活 力 并 减 少 骨 关 节 炎 中 相 关 细 胞 的凋亡10。虽然一些文献报道了IRE1在骨骼发育及相关疾病中的作用，但是IRE1对OA软骨细胞炎症反应的影响仍不清楚。本研究通过构建ERN1缺陷软骨细胞、ERN1软骨特异性敲除小鼠原代软骨细胞及过表达ERN1重组腺病毒，观察ERN1在炎症微环境中对软骨细胞炎症和分解代谢的影响，探讨 ERN1/IRE1对炎症微环境中软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的影响。材料和方法1实验小鼠C57BL/6J背景的ERN1flox/+小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司，相同背景的 Col2-Cre工具鼠由中国人民解放军陆军军医大学陈林教授馈赠。通过Cre-LoxP繁殖获得ERN1flox/flox对照（control）小鼠和 ERN1flox/flox-Col2Cre 软骨特异性敲除（ERN1 cKO）小鼠。所有动物研究均按照机构指南进行，并得到重庆医科大学伦理委员会的批准。2细胞、质粒和病毒293T细胞株由本实验室保存。人正常软骨细胞C28/I2、CRISPR-Cas9 载体 LentiCRISPRv2 及慢病毒包装质粒psPAX2、VSVG由美国纽约大学刘传聚教授馈赠。慢病毒包装用阳性对照质粒Lenti-GFP由本实验室保存。过表达ERN1腺病毒（AdERN1）及对照（AdGFP）由本实验室保存。3主要试剂BsmBI 酶、CIP 酶、T4 连接酶（NEB）；T4 PNK 酶（TaKaRa）；-EcoT14 I/Bgl digest DNA Marker（TaKaRa）；STBL3 感受态（擎科生物）；Polybrene、PEI（Sigma）；嘌呤霉素（Abcam）；型胶原酶（Worthington）；血清（BIOAGRIO）；DMEM、DMEM/F12 培养基（BI）；RIPA强裂解液、青链霉素（碧云天）；Trizol试剂（Invitrogen）；逆转录试剂盒、2SYBR Green（Novoprotein）；抗 GAPDH 和含血小板结合蛋白基序的解整联蛋白及金属蛋白酶 5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 5，ADAMTS5）抗体（Affinity）；抗 MMP13 抗体（Proteintech）；抗 IRE1315（CST）；抗TNF和IL-1抗体（Novus）；小鼠基因组提取试剂盒（Bimake）。本实验中所有引物由北京擎科生物科技有限公司重庆分公司合成，见表13。4主要方法4.1构建C28/I2细胞敲除ERN1稳定细胞株（1）LentiCRISPR-sgERN1质粒构建：将合成的oligo引物正反义链退火形成双链DNA，T4 PNK酶加磷；BsmBI内切酶酶切lentiCRISPRv2质粒，质粒长度为14 873 bp，酶切后CIP酶去磷酸化，凝胶电泳弃掉约2 kb的小片段，胶回收纯化大片段；T4 DNA连接酶连接4 过夜；STBL3感受态转化涂板；挑取单克隆菌摇菌，测序；（2）慢病毒包装：将测序正确的质粒进行293T细胞慢病毒包装，包装质粒比例为 LentiCRISPR-sgRNA psPAX2 VSVG=3 2 1，以 Lenti-GFP 为包装效率阳性对照，PEI辅助转染；收集 7296 h病毒上清；（3）筛选 ERN1 敲除稳定细胞株：感染 C28/I2 细胞，以 Lenti-GFP感染为阳性对照，polybrene辅助感染；0.5 mg/L puromycin 筛选，当 C28/I2 空细胞杀死完后，收取部分感染慢病毒的细胞进行Western blot鉴定，将有明显敲低效果的细胞进行单克隆细胞株筛选，Western blot鉴定敲除效果。4.2小鼠基因型鉴定剪取 23周待鉴定小鼠脚趾，提取基因组；以基因组为模板，分别用ERN1 flox引物和Col2-Cre引物进行PCR扩增；2%琼脂糖凝胶电泳；基因型结果判读：ERN1野生型只有361 bp一条 带，ERN1flox/+杂 合 子 有 361、486 bp 两 条 带，ERN1flox/flox纯合子只有486 bp一条带；Col2-Cre阳性有300 bp条带，阴性则无条带。4.3分离小鼠原代软骨细胞收集新生 6 d 的ERN1flox/flox对照（control）小鼠和 ERN1flox/flox-Col2Cre 特异性敲除（ERN1 cKO）小鼠；取下膝关节软骨；PBS清洗；1 g/L 型胶原酶37 消化1216 h；加含10%血清、1%青链霉素的 DMEM/F12培养基培养，48 h换液传代。4.4qPCR（1）过表达ERN1：接种C28/I2细胞，待细胞贴壁后，分别加入最适滴度的AdGFP（对照组）和 AdERN1（过表达 ERN1 组），polybrene 辅助感染，感染5 h后更换新鲜的完全培养基培养；此外，根据实验在细胞感染AdGFP和AdERN1腺病毒5 h换液时，分别加IL-1使终浓度为10 g/L模拟细胞炎症微环境；（2）敲除ERN1：接种敲除ERN1的C28/I2细胞（ERN1 KO1和ERN1 KO2）及对照（parental）；接种ERN1小鼠原代软骨细胞（对照组）和ERN1 cKO小鼠原代软骨细胞（NER/cKO 组）；待细胞贴壁，分别加IL-1使终浓度为10 g/L模拟细胞炎症微环境。收集IL-1作用36 h后的细胞，Trizol法提取RNA，参照试剂盒说明书逆转录为cDNA，进行qPCR测定。4.5Western blot细胞处理方法同qPCR；收集IL-表1小鼠ERN1基因型鉴定引物Table 1.Mouse ERN1 genotyping primersNameERN1 FloxCol2-CrePrimer sequence（5-3）F：ACCCAAGAGAAGGAAGCCAGAGAR：CCAGGGTCGAGACAAACAACAAGF：GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTTR：GCATCGACCGGTAATGCAGGCF：forward；R：reverse.表2CRISPR-Cas9 oligo引物Table 2.CRISPR-Cas9 oligo primersNamesgERN1-1sgERN1-2sgERN1-3Primer sequence（5-3）F：CACCGACATCCCGAGACACGGTGGTR：AAACACCACCGTGTCTCGGGATGTCF：CACCGCTTAAGCATGGAGTCCACGGR：AAACCCGTGGACTCCATGCTTAAGCF：CACCGGAGAACCCTACCTACACGGR：AAACCCGTGTAGGTAGGGTTCTCCF：forward；R：reverse.表3qPCR引物Table 3.qPCR primersNameGAPDH（M）ERN1（M）GAPDH（H）ERN1（H）IL-4（H）IL-6（H）IL-10（H）TNF（M）IL-4（M）IL-6（M）Primer sequence（5-3）F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTGR：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCAF：ACACCGACCACCGTATCTCAR：CTCAGGATAATGGTAGCCATGTCF：GGAGCGAGATCCCTCCAAAATR：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGGF：CACAGTGACGCTTCCTGAAACR：GCCATCATTAGGATCTGGGAGAF：ATGGGTCTCACCTCCCAACTR：GATGTCTGTTACGGTCAACTCGF：ACTCACCTCTTCAGAACGAATTGR：CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGF：GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGR：TCACATGCGCCTTGATGTCTGF：CCTGTAGCCCACGTCGTAGR：GGGAGTAGACAAGGTACAACCCF：AGTTGTCATCCTGCTCTTCTTTCTR：TCTGTGGTGTTCTTCGTTGCTF：CTGCAAGAGACTTCCATCCAGR：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTCGM：mouse；F：forward；R：reverse；H：human.3161 作用 48 h 的细胞，RIPA 裂解液提取细胞蛋白；SDS-PAGE胶分离，220 mA恒流，1 KD/min转移目的蛋白至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h，GAPDH（1 8 000）及其余抗（1 1 000）4 孵育过夜，TBST洗膜，孵育抗羊抗兔（1 10 000）室温2 h，洗膜，ECL显影。4.6前交叉韧带切除（anterior cruciate ligament transection，ACLT）术随机选取810周龄的雄性小鼠ERN1flox/flox（control）和 ERN1flox/flox-Col2Cre（ERN1 cKO）各6只，麻醉，膝关节处脱毛，剪开膝关节处皮肤暴露关节腔，手术组切断前交叉韧带，髌韧带复位，缝合，消毒伤口。假手术（sham）组，不切断前交叉韧带，其余方法同手术组。4.7免疫组化ERN1 cKO和control小鼠ACLT术后8周的膝关节石蜡切片进行脱蜡水化；抗原修复，复合消化液37，30 min；加辣根过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min；正常山羊血清封闭；加入抗（1 200），4 孵育过夜；孵育生物素标记羊抗兔/鼠抗（37、1 h）；HRP标记链霉卵白素工作液室温孵育15 min；DAB显色；脱水，封片，镜检。5统计学处理应用Graphpad Prism 6软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差（meanSD）表示。两组间的比较采用 t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，以P0.05认为差异有统计学意义。结果1人ERN1基因敲除C28/I2稳定细胞株的构建和鉴定LentiCRISPRv2载体经BsmB I酶切线性化，切下约2.0 kb片段，见图1A；弃掉小片段DNA，胶回收获得大片段DNA，见图1B；与退火的寡聚核苷酸双链连接，转化，挑菌，测序，成功将3条ERN1 sgRNA逐一连接至载体，测序结果，见图1C；以Lenti-GFP质粒为对照，293T细胞包装慢病毒，包装 96 h时细胞荧光，见图1D；收集慢病毒上清，感染C28/I2人软骨细胞，感染48 h时细胞荧光，见图1E；经嘌呤霉素筛选得到 ERN1基因敲低细胞株，Western blot 结果显示sgERN1 1#、sgERN1 2#有显著敲低效果，见图1F；进一步经过多轮单克隆细胞株筛选，成功获得 ERN1 KO1、ERN1 KO2敲除细胞株，Western blot鉴定结果，见图1G。2ERN1敲除 C28/I2软骨细胞中抗炎因子水平降低、致炎因子水平升高采用不同浓度梯度IL-1处理C28/I2细胞不同时间，Western blot 结果显示，随着 IL-1 浓度增加，IRE1表达也随之增加；在10 g/L IL-1诱导C28/I2细胞 36 h、48 h 时，IRE1 蛋白表达显著增加（P0.01），见图 2。同时 IL-1 处理敲除 ERN1 基因的C28/I2软骨细胞稳定细胞株，其qPCR结果显示，与Parental细胞比较，IL-1诱导时，敲除ERN1明显抑制抗炎因子 IL-4、IL-10 的 mRNA 水平（P0.01），促进致炎因子 IL-6的 mRNA 水平（P0.01），见图 3A。Western blot结果显示，ERN1敲除C28/I2软骨细胞与对照Parental比较，无IL-1诱导时，TNF蛋白表达无明显差异；但在 IL-1 诱导时，ERN1 敲除细胞株ERN1 KO1+IL-1、ERN1 KO2+IL-1组TNF表达显著升高（P0.05），见图3B、C。3ERN1 cKO小鼠原代软骨细胞中致炎因子升高、抗炎因子降低分离ERN1缺陷小鼠原代软骨细胞，IL-1处理，qPCR结果显示，与对照组相比，ERN1缺陷显著增强TNF、IL-6 mRNA 水 平（P0.01），抑 制 IL-10 的mRNA水平（P0.05），见图4A。Western blot结果显示，未加 IL-1 处理，正常生理条件下 control 组与ERN1 cKO 组 TNF 表达无明显差异，而在 IL-1 诱导 时，ERN1 cKO 显 著 上 调 TNF 蛋 白 表 达（P 0.05），见图4B、C。4软骨细胞中ERN1过表达上调抗炎因子、下调致炎因子在C28/I2细胞中转染ERN1腺病毒（AdERN1），AdGFP为对照。软骨细胞经IL-1处理，qPCR结果显示，与AdGFP组比较，过表达ERN1显著上调IL-4和IL-10 mRNA水平（P0.05），下调IL-6 mRNA水平（P0.01），见图 5。Western blot 结果显示，过表达ERN1在IL-1处理前后都会抑制TNF蛋白表达，且在IL-1诱导后，AdERN1抑制TNF表达更显著（P0.01），见图6。5ERN1缺陷C28/I2软骨细胞中，IL-1促进软骨分解代谢收集 ERN1 缺陷 C28/I2 软骨细胞 ERN1 KO1、ERN1 KO2和对照parental细胞蛋白进行Western blot检测，结果显示，无 IL-1 处理时，parental 和 ERN1 KO1、ERN1 KO2 细胞的分解代谢标志物 MMP13、ADAMTS5表达无明显差异，且蛋白表达量低，见图7A；而细胞在IL-1处理后，与parental组比较，ERN1缺陷显著上调MMP13和ADAMTS5的蛋白表达水平（P0.05），见图7B。6ERN1 cKO小鼠原代软骨细胞中，IL-1上调分317解代谢收集 ERN1 缺陷小鼠原代软骨细胞 ERN1 cKO和对照小鼠原代软骨细胞蛋白，Western blot结果显示，无IL-1处理时，与control组相比，ERN1 cKO组的ADAMTS5差异不显著，MMP13表达显著降低，见图 8A；在 IL-1 处理后，ERN1 cKO 细胞 MMP13 和ADAMTS5 的蛋白表达水平显著上调（P0.05），见图8B。Figure 1.Construction and screening of stable cell lines with specific ERN1 knockout in C28/I2 cells using CRISPR-Cas9 technology.A：the result of restriction enzyme digestion of LentiCRISPRv2（M：-EcoT14 I/Bgl II digest DNA marker；1：LentiCRISPRv2 digested by BsmB I）；B：the result of gel purification（M：DNA marker；1：LentiCRISPRv2 plasmid without digestion；2：result of gel purification of larger band）；C：DNA sequence of LentiCRISPRv2-sgRNA plasmids；D：packaging of lentivirus positive control lenti-GFP in 293T cells；E：infection of Lenti-GFP supernatant in C28/I2 cells；F：ERN1 knockdown effect with puromycin screening was identified using Western blot in C28/I2 cells；G：Western blot confirmation of ERN1 knockout in C28/I2 cells.图1CRISRP-Cas9技术构建和筛选ERN1敲除C28/I2软骨细胞稳定细胞株318Figure 2.Expression changes of IRE1 in C28/I2 cells treated with different concentrations of IL-1 for 24 h（A）or with 10 g/L IL-1 for different time（B）were detected by Western blot.MeanSD.n=3.*P0.01 vs 0 h group.图2不同浓度IL-1作用24 h或10 g/L IL-1作用不同时间后C28/I2细胞IRE1的表达变化Figure 3.The mRNA and protein levels of ERN1 and inflammatory factors in ERN1-deficient C28/I2 chondrocytes were detected.A：the mRNA levels of ERN1，IL-4，IL-10 and IL-6 detected by qPCR；B：the protein level of TNF in cells without IL-1 stimulation detected by Western blot；C：the protein level of TNF in IL-1-induced ERN1 knockout C28/I2 cells detected by Western blot.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs parental+IL-1 group.图3IL-1诱导的ERN1缺陷C28/I2软骨细胞中炎症因子TNF-、IL-10、IL-6和IL-4的mRNA和蛋白水平319Figure 4.The mRNA and protein levels of ERN1 and inflammatory factors in ERN1 cKO mouse primary chondrocytes were detected.A：the mRNA levels of ERN1，TNF，IL-10 and IL-6 in IL-1-induced ERN1 cKO mouse primary chondrocytes were detected by qPCR；B：the protein levels of TNF were detected by Western blot in primary chondrocytes without IL-1 stimulation；C：the protein levels of TNF in IL-1-induced ERN1 cKO mouse primary chondrocytes were detected by Western blot.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs control+IL-1 group.图4IL-1诱导的ERN1 cKO原代软骨细胞炎症因子TNF、IL-10和IL-6 mRNA和蛋白水平Figure 5.The mRNA levels of ERN1 and inflammatory factors IL-4，IL-10 and IL-6 were detected by qPCR after over-expression of ERN1 in IL-1-induced C28/I2 cells.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs AdGFP+IL-1 group.图5IL-1诱导的过表达ERN1 C28/I2软骨细胞炎症细胞因子IL-4、IL-10和IL-6的mRNA水平320Figure.6.The protein levels of IRE1 and TNF were detected after over-expression of ERN1.A：the protein levels of IRE1 and TNF were detected by Western blot after over-expression of ERN1 without IL-1 stimulation；B：the protein levels of IRE1 and TNF were detected by Western blot after overexpression of ERN1 in IL-1-induced C28/I2 cells.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs AdGFP+IL-1 group.图6Western blot检测过表达ERN1的C28/I2软骨细胞IRE1和TNF蛋白水平Figure 7.The protein levels of ADAMTS5 and MMP13 in ERN1-deficient C28/I2 chondrocytes were detected.A：the protein levels of MMP13 and ADAMTS5 in ERN1 knockout C28/I2 cells were detected by Western blot without IL-1 stimulation；B：the protein levels of MMP13 and ADAMTS5 in IL-1-induced ERN1 knockout C28/I2 cells were detected by Western blot.MeanSD.n=3.*P0.01 vs parental+IL-1 group.图7Western blot检测IL-1诱导的ERN1缺陷C28/I2软骨细胞ADAMTS5和MMP13蛋白水平3217ERN1缺陷对小鼠骨关节炎软骨的影响收集ACLT术后8周的ERN1 cKO和control小鼠膝关节，进行石蜡切片。免疫组化染色结果显示，与control小鼠相比，ERN1 cKO组IL-1和TNF表达水平显著升高（P0.01），见图9。讨论关节软骨细胞由于年龄、肥胖、炎症、代谢障碍、创伤、劳损、遗传等因素所引发的炎症是诱发骨关节炎的首要因素，炎症因子与软骨细胞、胞外基质蛋白和细胞粘附分子之间的一系列复杂精细的调控与骨关节炎等相关疾病的发生密切相关。研究表明炎症与UPR在许多方面存在联系。UPR与细胞内炎症反应信号通路的偶联是引发炎症反应的主要原因之一，也是许多炎症疾病的发病机制和病理基础12。ERS 已被证实与多种疾病的发生、发展有关，包括OA13、类风湿性关节炎14和其他炎症性疾病15-16。IRE1作为UPR的经典传感器，在不同的生物体、组织和疾病中具有多样化功能。在肿瘤细胞中，抑制IRE1活性可降低肿瘤细胞增殖并增加乳腺癌、结肠直肠癌和肝癌等各种癌症类型的化学敏感性17-19。ERN1骨髓特异性缺失Ern1f/f，Lyz2-Cre小鼠在很大程度上逆转高脂肪饮食诱导的白色脂肪组织中的M1-M2极化失衡，并阻断高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症和肝脂肪变性20。IRE1 激活的ERS和机体免疫细胞中的UPR信号通路IRE1可以增加炎症细胞因子的释放，进一步促进炎症的产生21-22。但IRE1在软骨细胞中的功能与作用却很少报道，本研究探讨了ERN1/IRE1在炎症微环境中与软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的关系，为后续深入解读IRE1在软骨细胞的功能奠定基础。Figure 8.The protein levels of ADAMTS5 and MMP13 in ERN1 cKO mouse primary chondrocytes were detected.A：the protein levels of MMP13 and ADAMTS5 in ERN1 cKO mouse primary chondrocytes without IL-1 stimulation were detected by Western blot；B：the protein levels of MMP13 and ADAMTS5 in IL-1-induced ERN1 cKO mouse primary chondrocytes were detected by Western blot.MeanSD.n=3.*P0.05 vs control+IL-1 group.图8Western blot检测IL-1诱导的ERN1 cKO小鼠原代软骨细胞ADAMTS5和MMP13蛋白水平Figure 9.The expression and distribution of IL-1（