异体滑膜及青少年软骨颗粒移...”缺损及移植细胞的转归研究_闫文强.pdf

中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12异体滑膜及青少年软骨颗粒移植修复兔半月板“白区”缺损及移植细胞的转归研究闫文强吴桐樊逸菲麦合木提麦麦提敏赵逢源李豫皖曹宸喜胡晓青程锦敖英芳北京大学第三医院运动医学科，北京大学运动医学研究所，运动医学关节伤病北京市重点实验室（北京100191）摘要目的：探讨异体滑膜和青少年软骨颗粒移植在半月板“白区”缺损修复上的协同作用；研究移植细胞的转归（存活和分化）；研究滑膜间充质干细胞和软骨细胞间的相互作用。方法：选取2只未成年雄性兔作为滑膜及青少年软骨颗粒供体。选取 24只成年雌性兔（共48个膝关节）制备半月板缺损模型，分为以下几组：空白组，半月板缺损无任何处理；单纯纤维蛋白胶组，在半月板缺损处填充单纯纤维蛋白胶；纤维蛋白胶+滑膜移植组，纤维蛋白胶包裹异体滑膜碎片填充到半月板缺损处；纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组，纤维蛋白胶包裹异体滑膜和异体青少年软骨颗粒填充到半月板缺损处，每组样本量为12个膝关节。分别在术后8周和16周取材，通过组织学和免疫组织化学染色评估半月板缺损修复程度，针对雄性个体特有的Y染色体性别决定区基因（SRY）进行核酸原位杂交，并结合免疫荧光共定位评估移植细胞的存活和分化。其次，建立体外兔滑膜间充质干细胞和软骨细胞共培养系统，检测半月板纤维软骨细胞相关基因转录水平，并探索细胞间相互作用的可能机制。结果：在术后8、16周，相较于空白组、单纯纤维蛋白胶组及纤维蛋白胶+滑膜移植组，纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组的缺损表现出良好的结构完整性、表面光滑度和边缘整合度，修复组织中可见较多的半月板样纤维软骨细胞，并且，细胞周围的基质在甲苯胺蓝和II型胶原免疫组织化学染色中表现为强阳性。在术后16周，纤维蛋白胶+滑膜移植组及纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组的SRY核酸原位杂交信号表现为强阳性，表明移植细胞在受体中至少可存活16周。其次，核酸原位杂交和SOX9免疫荧光共定位显示表面移植滑膜组织中的细胞表现为SOX9阳性，表明移植滑膜组织中的细胞可分化为半月板纤维软骨细胞。滑膜间充质干细胞和软骨细胞共培养后半月板基质相关基因的转录水平与半月板纤维软骨细胞相似，并且，滑膜间充质干细胞和软骨细胞之间可通过细胞外囊泡相互作用。结论：异体滑膜和青少年软骨颗粒移植可协同促进半月板“白区”缺损修复；移植细胞在受体中至少可存活16周；移植滑膜组织中的细胞在半月板缺损处可分化为半月板纤维软骨细胞。关键词半月板损伤；半月板修复；滑膜；异体青少年软骨颗粒The Fate of Donor Cells in Synovium and Particulated Juvenile Allograft Cartilage for the Repair ofMeniscal“white zone”DefectsYan Wenqiang，Wu Tong，Fan Yifei，Maihemuti Maimaitimin，Zhao Fengyuan，Li Yuwan，Cao Chenxi，HuXiaoqing，Cheng Jin，Ao YingfangDepartment of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Institute of Sports Medicine of PekingUniversity，Beijing Key Laboratory of Sports Injuries，Beijing 100191，ChinaCorresponding Author:Ao Yingfang，Email:Abstract Objective To explore the synergistic effect of synovium and particulated juvenile allograftcartilage（PJAC）on repairing meniscal defects in the avascular zone，track the survival and differentia收稿日期：2022.04.05基金项目：国家自然科学基金（82172420，81972101，81802161，81871770）第1作者：闫文强，Email：；通信作者：敖英芳，Email： 941DOI:10.16038/j.1000-6710.2022.12.012中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12tion of donor cells and interactions between synovial cells and chondrocytes.Methods In this study，2immature male rabbits were raised as synovium and particulated cartilage donors.Meanwhile，24 adultfemale rabbits were selected and induced cylindrical full-thickness defects measuring 2.0 mm in theavascular portion of medial menisci in both knees.They were then randomly divided into a blankgroup，a fibrin gel group，a fibrin gel+synovium transplant group as well as a fibrin gel+synoviumand PJAC transplant group，each of 12 rabbits.The blank group was left untreated，while the fibringel group，fibrin gel+synovium transplant group as well as fibrin gel+synovium and PJAC transplantgroup were filled into the meniscal defects with fibrin gel，fibrin gel encapsulating synovium fragments，as well as fibrin gel encapsulating synovium fragments and PJAC respectively.Rabbits were sacrificed 8 and 16 weeks postoperatively，and the histological and immunohistological methods were applied to assess the degree of meniscal repair.The in situ hybridization（ISH）for male-specific sex-determining region Y-linked（SRY）gene and immunofluorescence for Sry-type HMG-box 9（SOX9）wereconducted to evaluate the survival and differentiation of donor cells.Moreover，in vitro cell coculturesystemofsynovium derived mesenchymal stem cells（SMSCs）and chondrocytes was built，and their interaction was analyzed.Results Eight and 16 weeks after the operation，better structural integrity，superficial smoothness and marginal integration were observed in the fibrin gel+synovium and PJAC transplantgroup，compared with the other 3 groups，with more meniscus-like fibrochondrocytes in the repairedtissue，and the matrix around such cell clusters being strongly positive after the toluidine blue andtype 2 collagen immunohistochemistry staining.The SRY signals of ISH were positive in both the fibrin gel+synovium transplant and fibrin gel+synovium and PJAC transplant groups 16 weeks postoperatively，which indicated that donor cells survived for at least 16 weeks in the recipient.Moreover，thetransplanted synovial cells were found differentiating into meniscal fibrochondrocytes as they demonstrated the positive SOX9 expression.The transcriptional levels of meniscal matrix related genes after thecoculture of SMSCs and chondrocytes were similar to meniscal fibrochondrocytes.Meanwhile，SMSCsand chondrocytes could interact through extracellular vesicles.Conclusion The synovium and PJACtransplant facilitates meniscal repair synergistically.The donor cells survive for at least 16 weeks inthe recipient and synovial cells differentiate into fibrochondrocytes in the meniscal defect.Key wordsmeniscal injuries;meniscal repair;synovium;particulated juvenile allograft cartilage半月板是股骨髁和胫骨平台之间的纤维软骨组织，在膝关节的承重、载荷传递、润滑和减震中起关键作用1。半月板损伤是最常见的膝关节相关损伤之一，可发生于各个年龄人群，包括儿童、年轻人、老年人以及普通人群和运动员2。对于发生在半月板内侧无血管区域（“白区”）的损伤，由于其愈合能力有限，半月板切除术仍是目前主要的治疗手段3。半月板切除会导致继发性软骨退变，甚至发展为骨关节炎（osteoarthritis，OA）4。然而，目前对半月板损伤的治疗理念是促进半月板愈合，保持结构完整性，防止继发性软骨退化和改善关节功能。因此，亟需开发新的治疗方法以促进半月板愈合。Kim等5采用兔内侧半月板“白区”缺损模型，利用液氮反复冻融的方式分别失活滑膜组织或残余的半月板组织，其研究结果表明，只有在滑膜保持活力的条件下，半月板才具有修复功能，从而间接证明滑膜组织参与半月板修复与再生，而非残余的半月板组织。此外，滑膜移植已被证明可以一定程度上促进半月板修复6-8。Cisa等9研究了带蒂滑膜瓣转移在修复兔半月板“白区”纵向撕裂模型中的有效性，其研究结果表明四分之三的标本在撕裂部位出现血管化，并且表现出一定程度的修复。Kimura等10开展了一项临床研究，在半月板“白区”撕裂部位进行缝合固定后，将带蒂滑膜瓣转移到撕裂缝合部位，结果表明7名患者均表现出明显的愈合。因此，滑膜移植对半月板“白区”损伤修复具有显著的促进作用。异体青少年软骨颗粒（particulated juvenile allograft cartilage，PJAC）已在临床上被用于修复关节软骨缺损。在临床上，PJAC颗粒一般取自13岁以下的捐赠者，并在低温下储存。在使用时，PJAC颗粒和纤维蛋白胶的混合物被填充到软骨缺损中11。PJAC已被用于修复多种关节上的软骨缺损，如膝、髋和踝关节，并获得了令人满意的修复效果12-14。因此，PJAC移植在产生透明软骨基质如型胶原蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）方面表现出巨 942中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12大的优势。此外，除型胶原蛋白外，半月板“白区”富含型胶原蛋白、GAG和蛋白聚糖，类似于关节透明软骨1。因此推测，PJAC在修复半月板“白区”缺损方面具有潜在的功效。然而，目前尚缺乏研究探讨滑膜和PJAC移植在半月板“白区”缺损修复上的协同作用。在常用的实验动物模型中，小型啮齿动物具有相对较强的自愈能力，在比较实验组和对照组疗效方面缺乏说服力15；大动物模型，如羊和猪，在生理条件和膝关节尺寸方面更接近于人类16，但是，由于其操作过程相对复杂，且饲养成本过高，难以保证足够的样本量，从而限制其使用。而与小型啮齿动物相比，兔愈合潜力相对较差17，并且与大动物模型相比，其饲养成本较低，这些使得兔成为评估半月板修复技术疗效的理想模型。因此，本研究采用新西兰大白兔作为实验模型，在内侧半月板“白区”制作全层缺损。本研究采用纤维蛋白胶包裹异体滑膜和PJAC，随后移植填充半月板缺损；本研究推测异体滑膜和PJAC移植可促进半月板缺损修复再生；此外，移植的滑膜细胞可分化为半月板纤维软骨细胞（图1）。图1异体滑膜和青少年软骨颗粒移植后半月板修复示意图本研究目的如下：（1）探讨异体滑膜和PJAC移植在半月板“白区”缺损修复上的协同作用；（2）研究移植细胞的转归（存活和分化）；（3）研究滑膜间充质干细胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）和软骨细胞之间的相互作用。1 研究对象与方法1.1 研究设计研究设计本研究得到了北京大学第三医院实验动物伦理委员会的批准，使用 24只成年雌性新西兰大白兔（共48个膝关节），分为以下几组：空白组（Blank组），半月板缺损无任何处理；单纯纤维蛋白胶组（FG组），在半月板缺损处填充单纯纤维蛋白胶；纤维蛋白胶+滑膜移植组（FG+synovium组），纤维蛋白胶包裹滑膜碎片填充到半月板缺损处；纤维蛋白胶+滑膜+异体青少年软骨颗粒移植组（FG+synovium+PJAC组），纤维蛋白胶包裹滑膜和PJAC颗粒填充到半月板缺损处。每组样本量为12个膝关节。分别在术后8周和16周取材，评估缺损修复情况，通过组织学和免疫组织化学染色评估半月板缺损修复程度，核酸原位杂交（in situ hybridization，ISH）结合sex determining region Y-box 9（SOX9）免疫荧光检测移植细胞的存活和分化。其次，建立体外兔滑膜间充质干细胞（SMSCs）和软骨细胞共培养系统，检测半月板纤维软骨细胞相关基因转录水平，并探索细胞间相互作用的可能机制。1.2 滑膜和滑膜和PJACPJAC的获取的获取、处理及移植处理及移植本研究使用的异体滑膜和PJAC颗粒均取自青少年雄性兔。首先，采用过量麻醉的方式处死两只青少年雄性兔，在无菌条件下分离膝关节，采用手术刀从股骨远端削下关节软骨，将削下的软骨块制备成体积约0.5 mm3的软骨颗粒，随后将软骨颗粒放入事先装有5ml细胞培养基的50 ml离心管中。其次，从髌上囊，关节内、外侧壁收集滑膜，滑膜颗粒的制备过程与PJAC的制备过程类似（图2A）。异体滑膜及PJAC颗粒在使滑膜细胞半月板纤维软骨细胞滑膜异体青少年软骨颗粒修复组织纤维蛋白胶 943中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12用前置于4 冰箱暂时保存。本研究采用的纤维蛋白胶为商品化的外用冻干人纤维蛋白粘合剂（护固莱士，上海），包含有纤维蛋白原、生理盐水、CaCl2溶液和凝血酶。在使用时，分别使用生理盐水溶解纤维蛋白原，CaCl2溶液溶解凝血酶，将两者以相同体积混合使用。对于纤维蛋白胶+滑膜组，随机选取2块滑膜组织（约0.5 mm3每块）放入直径2.0 mm、深度1.0 mm的模子中，2块滑膜组织约占1 mm3，随后注入纤维蛋白原和凝血酶的混合液，待纤维蛋白胶完全凝固后（约需30s），用镊子将纤维蛋白胶+滑膜组织移植到半月板缺损处；对于纤维蛋白胶+滑膜+PJAC组，随机选取2块滑膜组织和4块PJAC颗粒，放入直径2.0 mm、深度1.0 mm的模子中，注入纤维蛋白原和凝血酶的混合液，待纤维蛋白胶凝固后，使用镊子取出并填充至半月板缺损处。1.3 手术操作手术操作肌肉注射盐酸赛拉嗪（2 mg/kg）进行麻醉，并置于仰卧位，对膝关节常规备皮消毒后，采用膝关节正中切口，内侧髌旁入路，将髌骨外翻脱位，离断内侧副韧带，完全暴露内侧半月板前角，采用角膜环钻在双膝内侧半月板前角“白区”制备直径2.0 mm的圆柱形全层缺损（图2B）。针对各组采用相应的处理（参考2.1 研究设计），随后，采用2-0缝线固定内侧副韧带，并采用连续缝合方式缝合髌腱和皮肤切口。术后每天肌肉注射青霉素钠以预防感染，持续注射1周，允许动物自由活动。A：滑膜和PJAC颗粒制备；B：半月板缺损制备，黑色箭头指示全层缺损。图2异体滑膜和PJAC颗粒，半月板缺损制备1.4 样本采集与处理样本采集与处理分别在术后8周和16周获取半月板标本。首先，使用4%多聚甲醛固定2天；然后，沿原始缺损最大横径将新生组织切成两段；最后，梯度酒精脱水，石蜡包埋。使用石蜡切片机（Leica）制备3 m厚的石蜡切片，用于后续组织学分析。组织学评估包括苏木精-伊红（HE）、甲苯胺蓝、型和型胶原免疫组织化学染色。ISH结合SOX9免疫荧光检测移植细胞的存活和分化。使用数字切片扫描仪（NanoZoomer，Hamamatsu，日本）扫描HE、甲苯胺蓝、型和型胶原免疫组织化学染色切片，用于后续分析。使用共聚焦显微镜（Leica）扫描ISH、SOX9免疫荧光染色。1.5 半月板修复评分半月板修复评分半月板修复评分系统用于半定量评估半月板缺损修复结果。此评分系统包含有修复组织的宏观特征及组织学特征。宏观特征包括缺损的稳定性和填充程度；组织学特征包括：修复组织表面质量、整合程度、细胞化程度、细胞形态、蛋白多糖和II型胶原蛋白含量。此评分系统包括以上8项指标，每个指标评分范围为03，最终得分为0分（无修复）24 分（完全修复）。此评分系统详见文献18。1.6 免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用的一抗包括型胶原蛋白（Arigo，ARG-21965）、型胶原蛋白（Invitrogen，MA5-13026）；二抗为驴抗山羊IgG H&L（HRP）（Abcam，ab6885）和驴抗小鼠 IgG H&L（HRP）（Abcam，ab6789）。0.4%胃蛋白酶溶液（Aladdin，P110928，上海）在37条件下孵育切片1小时以修复抗原，采用3%H2O2处理15分钟以封闭内源性过氧化物酶；使用山羊血清（Boster，AR0009，中国）封闭1小时，然后分别孵育一抗2小时、二抗1小时，最后加入二氨基联苯胺（DAB）显色。1.7 核酸原位杂交核酸原位杂交（ISHISH）结合结合SOXSOX9 9免疫荧光免疫荧光根据兔 Y 染色体性别决定区基因（sex-determining region of Y，SRY）的特定基因片段设计特异性探滑膜滑膜颗粒异体青少年软骨异体青少年软骨颗粒AB2mm缺损 944中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12针（Qiagen），探针信息如下：SRY探针（5 和3 生物素标记）TGCAAGCAGCAAACTGTCGCT。为了防止核酸被降解，ISH期间使用的所有溶液均不含核糖核酸酶。主要操作步骤如下，将3 m厚石蜡切片依次浸入二甲苯、梯度酒精和磷酸盐缓冲液（PBS）中以脱蜡、复水，使用20 g/ml蛋白酶K溶液，37条件下处理15分钟，然后用 PBS 溶液洗涤，使用杂交混合物（带有SRY探针的杂交缓冲液，80 nM）在54条件下孵育组织切片1小时。杂交完成后，使用梯度柠檬酸钠缓冲液（5，1，0.2）和PBS溶液进行严格洗涤。随后，使用0.1%Triton X-100通透组织，1%牛血清白蛋白（BSA）室温条件下 封 闭 1 小 时；使 用 SOX9 一 抗（Millipore Sigma，HPA001758）室温孵育 2 小时；使用 0.1%PBS-Tween严格洗涤后，加入 FITC 标记的抗生物素抗体（MilliporeSigma，F6762）和驴抗兔二抗（abcam，ab150075），室温孵育1小时；使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）处理10分钟，洗涤后使用抗荧光淬灭封片剂封片。使用共聚焦显微镜（TCS-SP8，Leica）扫描切片。SRY阳性细胞比率计算公式如下：FITC染色阳性细胞数DAPI染色阳性细胞数。1.8 细胞外基质沉积半定量分析细胞外基质沉积半定量分析选择修复区域内的感兴趣区域（region of interest，ROI）（长300 m、宽200 m）进行后续分析。使用Image J软件（US，NIH）计算ROI内的平均光密度（average optical density，AOD）以评估新生细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积情况，使用甲苯胺蓝染色评估GAG含量，型和型胶原免疫组织化学染色按照同样的方法进行计算。1.9 细胞分离及培养细胞分离及培养对于滑膜间充质干细胞（SMSCs）的分离，首先将滑膜切碎，然后用 0.4%I 型胶原酶（Gibco，美国），37 条件下消化4小时。使用70 m尼龙网滤除未消化的碎片，PBS溶液洗涤细胞并离心两次，用含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL链霉素（Invitrogen，美国）的-MEM细胞培养基重悬细胞。将细胞接种于直径10 cm的细胞培养皿，允许细胞贴壁2天，随后每2天更换细胞培养基。培养14天后，使用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA；Hyclone，美国）消化细胞，以13比例传代，取第3代（P3）细胞用于后续实验。关节软骨细胞和半月板纤维软骨细胞的分离、培养同SMSCs。但是，采用型胶原酶消化软骨，采用型和型胶原酶消化半月板组织。将SMSC与软骨细胞按照11数量比例均匀混合后，接种在6孔板中，共培养1周后用于后续qPCR分析。1.10 实时荧光定量聚合酶链式反应实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCRqPCR）分析分析使用 TRIzol RNA 提取试剂盒（Invitrogen）分离RNA，将 mRNA 反转录成互补 DNA（cDNA）后，利用SYBR Green q-PCR Kit（Vazyme，南京，中国）试剂，采用 QuantStudio 3 PCR 系统（Thermo Fisher，美国）扩增cDNA。所用mRNA 引物序列见表1。表1引物序列基因COL1A1COL2A1TNCSOX9ITGA3ITGB1CXCR4GAPDH正向引物（5-3）TGGCAAGAACGGAGATGACGCCACGCTCAAGTCCCTCAACTCTCTGCACATAGTGAAAAACAATACCAGTACCCGCACCTGCACAACCCCCGACTACAGGCGGAACATACCAACCGTAGCAAAGGCACGATGATGGAGTAGATGGTGGGCCATCACCATCTTCCAGGAG反向引物（3-5）GCACCATCCAAACCACTGAAAGTCACCGCTCTTCCACTCGTCAAGGCAGTGGTGTCTGTGATACTTGTAGTCCGGGTGGTCTTTCAGAAGGAGCCGTGGAGGAGAGTGGGGTAGTCTTCAGCACGCACACTTCAGACAACTACACGGAGGATGATGACCCTTTTGGCTC1.11 滑膜细胞与软骨细胞相互作用分析滑膜细胞与软骨细胞相互作用分析首先，采用Dil荧光探针（5 m），按照106细胞/ml的浓度，在37条件下孵育SMSCs 20分钟，按照同样的方法采用Dio荧光探针孵育软骨细胞；随后使用PBS溶液洗涤并离心两次；最后将Dil标记的SMSCs和Dio标记的软骨细胞按照11数量比例均匀混合，接种在confocal玻璃小皿上，共培养1、3和5天；采用共聚焦荧光显微镜扫描评估两种细胞间细胞膜的交换。1.12 统计学分析统计学分析使用 G*Power 软件（G*Power，版本 3.1.9.2）进行先验分析，计算本研究所需最低样本量。在=0.05，效力=0.8，效应量=0.8的条件下，所需每组最低样本量为6个。数据以平均值 标准偏差（SD）表示，采用双因素方差分析结合Bonferroni事后多重检验进行分析，所 945中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12有统计分析均使用 GraphPad Prism 软件 8.0.1 版（GraphPad 软件）完成，当P0.05被认为差异具有统计学意义。2 结果空白组有1例膝关节在术后16周出现严重感染，因此这例膝关节无法用于后续分析。2.1 半月板修复评估半月板修复评估术后8周，空白组和FG组仅部分填充或由疏松结缔组织覆盖，修复组织表面粗糙，且与边缘正常组织整合较差，甚至观察到显著的半月板退变现象，组织学层面可见修复后的组织中仅有少量体积较小的细胞，表现为卵圆形或圆形的细胞核（图3A），并且半月板缺损区域内甲苯胺蓝和I、II型胶原免疫组织化学染色呈阴性或弱染色（图 4A、5A、6A）。FG+synovium 和 FG+synovium+PJAC组的缺损处填充有较厚的结缔组织。此外，FG+synovium+PJA组新生组织呈现出象牙白色的正常半月板外观，表面相对光滑，与周围正常半月板组织几乎完全整合，HE 染色中可观察到大量的圆形或卵圆形半月板样纤维软骨细胞（图3A），新生细胞周围基质甲苯胺蓝和胶原蛋白免疫组化染色强阳性（图4A、5A、6A）。半定量分析结果表明G+synovium+PJAC组GAG和胶原蛋白含量最高（图4C、5C、6C）。术后16周，FG+synovium和FG+synovium+PJAC组的缺损处被较厚的结缔组织完全填充，且FG+synovium+PJAC组表现出更好的结构完整性、表面光滑度和边缘整合度。此外，与术后8周相比，修复的组织中可观察到更多的纤维软骨细胞样细胞簇（图3B），细胞簇周围基质甲苯胺蓝和胶原蛋白免疫组化染色强阳性（图4B、5B、6B）。空白组和FG组缺损处填充组织尽管较术后8周有所增加，但与FG+synovium和FG+synovium+PJAC组相比，在缺损填充、表面光滑度和边缘整合度方面仍然有所欠缺，且修复组织中仅有一些体积较小的细胞，并且缺损界面周围的细胞数量明显减少（图3B），修复组织甲苯胺蓝和胶原蛋白免疫组化染色呈弱阳性（图4B、5B、6B）。半定量分析结果表明FG+synovium+PJAC 组 GAG 和胶原蛋白含量最高（图 4C、5C、6C）。术后 8 周，空白组和 FG 组的半月板修复评分较差。FG+synovium和FG+synovium+PJAC组的半月板修复评分显著高于空白组和 FG 组，且 FG+synovium+PJAC组评分最高。空白组、FG组与FG+synovium、FG+synovium+PJAC组之间有显著差异（P0.05）。术后16周，FG+synovium+PJAC组半月板修复评分显著高于其他处理组（P0.05）（图7）。2.2 移植细胞转归移植细胞转归SRY 基因 ISH 可反映移植细胞的存活情况（图8A），术后8周，FG+synovium和FG+synovium+PJAC组SRY 阳性率分别为 61.19%14.72%和 75.77%16.23%。术后 16 周，FG+synovium 和 FG+synovium+PJAC 组 SRY 阳 性 率 分 别 为 27.03%8.20%和46.81%15.73%（图8B）。如图9所示，SRY基因ISH结合SOX9免疫荧光结果表明移植的滑膜细胞表现为SOX9阳性。2.3 SMSCsSMSCs与软骨细胞间相互作用与软骨细胞间相互作用如图10所示，SMSCs与软骨细胞共培养后半月板基质相关基因转录水平与半月板纤维软骨细胞相似，例如型胶原（type 1 collagen，COL1A1）、型胶原（type 2 collagen，COL2A1）、sex determining region Y-box 9（SOX9）、腱调蛋白C（tenascin C，TNC）。此外，SMSCs与软骨细胞共培养后，整合素A3（ITGA3）表达显著上调。如图11所示，SMSC与软骨细胞可通过细胞外囊泡相互作用，共培养后第1天，可清晰分辨出Dil标记的SMSC和Dio标记的软骨细胞；并且，在Dio标记的软骨细胞中可检测到由Dil标记的SMSC分泌的细胞外囊泡；此外，Dio标记的软骨细胞分泌的细胞外囊泡在Dil标记的SMSCs中同样可被检测到。然而，在共培养后第3天和第5天，SMSCs和软骨细胞细胞膜全部被Dil和Dio荧光探针标记，并且无法区分开两种细胞。3 讨论本研究详细探讨了异体滑膜和PJAC颗粒移植在修复半月板“白区”缺损上的协同作用，并进一步验证移植细胞在受体内的转归。本研究表明，异体滑膜和PJAC颗粒移植在半月板“白区”缺损修复上具有积极的协同作用，新生半月板组织外观表面光滑，与边缘正常半月板组织整合良好，且组织学染色可见半月板样纤维软骨细胞及半月板基质填充。雄性特异性SRY基因原位杂交结果表明移植细胞在受体内至少可存活16周。此外，基于SRY基因原位杂交结合SOX9免疫荧光的结果，验证了移植的滑膜细胞在半月板缺损部位分化为半月板纤维软骨样细胞。SMSCs和软骨细胞体外共培养后半月板基质相关基因转录水平（COL1A1、COL2A1、SOX9、TNC）与半月板纤维软骨细胞较为相似。此外，本研究表明SMSCs和软骨细胞可通过分泌细胞外囊泡相互作用。本研究针对移植细胞在受体内的存活情况进行了详细探索。首先，为了将移植细胞与受体内细胞区分开，将取自雄性兔膝关节的滑膜和PJAC颗粒移植到雌性兔半月板缺损部位，随后采用雄性特异性SRY基因原位杂交技术检测供体移植细胞的存活情况，此细胞示踪技术已被多项研究采用19-22。雄性特异性SRY基 946中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12因是Y染色体中高度保守的基因序列，于1990年首被次报道23。SRY基因可以被视为雄性细胞的理想标记基因24。Pilichi等25利用此技术证实胚胎干细胞样细胞可在绵羊骨软骨缺损部位存活4年。Ostrander等26利用此项技术证实移植的软骨细胞在受体内至少可存活28天。此外，之前的另一项研究表明，PJAC移植物中的供体细胞在小型猪关节软骨缺损处至少可存活3个月27。此研究结果表明，无论在纤维蛋白胶+异体滑膜移植组，还是纤维蛋白胶+异体滑膜+PJAC颗粒移植组，在术后8周、16周均可观察到阳性的SRY杂交信号。并且，滑膜+PJAC颗粒共同移植组的SRY杂交信号明显强于单独滑膜移植组。但是，术后16周的SRY信号阳性率较术后8周明显减少，可能是由于迁入缺损处的细胞数量逐渐增加，导致细胞基数增加，或由于免疫排斥、细胞凋亡等原因导致移植细胞的数量减少所致。FG：纤维蛋白胶；synovium：滑膜；PJAC：异体青少年软骨颗粒。A：术后8周；B：术后16周。“大体”图采用黑色标尺，黑色标尺：2mm；“修复区域”及“修复界面”图采用蓝色标尺，蓝色标尺：200m。图3HE染色结果大体修复区域修复界面大体修复区域修复界面ABBlankFGFG+synoviumFG+synovium+PJACBlankFGFG+synoviumFG+synovium+PJAC 947中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12A：术后8周；B：术后16周；C：GAG半定量分析。AOD值采用平均值 标准差表示。n=6（空白组-16 w，n=5）。*P0.01，*P0.0005，*P0.0001。AOD：平均光密度；ROI：感兴趣区域；GAG：糖胺聚糖。“大体”图采用黑色标尺，黑色标尺：2 mm；“修复区域”及“修复界面”图采用蓝色标尺，蓝色标尺：200m。图4甲苯胺蓝染色结果大体修复区域修复界面大体修复区域修复界面ABBlankFGFG+synoviumFG+synovium+PJACFGBlankFG+synoviumFG+synovium+PJACC8w16wFG+synoviumFG+synovium+PJACFGBlankAverage Optical Density（AOD）of ROI*0.80.60.40.20.0 948中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12A：术后8周；B：术后16周；C：型胶原半定量分析。AOD值采用平均值标准差表示。n=6（空白组-16 w，n=5）。*P0.0005，*P0.0001。“大体”图采用黑色标尺，黑色标尺：2 mm；“修复区域”及“修复界面”图采用蓝色标尺，蓝色标尺：200m。图5型胶原免疫组化染色结果8w16wFG+synoviumFG+synovium+PJACFGBlankAverage Optical Density（AOD）of ROI*0.120.100.080.060.04C大体修复区域修复界面ABBlankFGFG+synoviumFG+synovium+PJACFGBlankFG+synoviumFG+synovium+PJAC大体修复区域修复界面 949中国运动医学杂志2022年12月第41卷第12期 Chin J Sports Med，Dec.2022，Vol.41，No.12A：术后8周；B：术后16周；C：型胶原半定量分析。AOD值采用平均值标准差表示。n=6（空白组-16 w，n=5）。*P0.01，*P0.0005，*P0.0001。图6型胶原免疫组化染色结果大体修复区域修复界面ABBlankFGFG+synoviumFG+synovium+PJACFGBlankFG+synoviumFG+synovium+PJACFG+synoviumFG+synovium+PJAC8w16wAverage Optical De