DB50∕T 1407-2023 新城疫病毒免疫层析（胶体金)检测技术规范.pdf

ICS 65.020CCS B 41DB50重庆市地方标准DB50/T 14072023新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范2023-05-25 发布2023-08-25 实施重庆市市场监督管理局 发 布DB50/T 14072023I前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市农业农村委员会提出、归口并组织实施。本文件起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心、重庆理工大学。本文件主要起草人：曹芸、董春霞、吴胜昔、黄恒、陈忠琼、姚璐、蔺露、凌洪权、向梦玲、向梦雪、孟丽娜。DB50/T 140720231新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范1范围本文件规定了新城疫病毒免疫层析（胶体金）的检测原理、仪器与耗材、材料、样品前处理、样品检测、结果判定、废弃物处理。本文件适用于检测泄殖腔拭子、咽拭子、组织样品、鸡胚尿囊液及细胞培养液中的新城疫病毒。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 39707医疗废物处理处置污染控制标准SN/T 2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4检测原理本文件采用双抗夹心法制备新城疫病毒胶体金试纸卡。在试纸卡的加样孔处加入待检样品，待检样品中的抗原先与胶体金标记的新城疫病毒单克隆抗体反应，形成肉眼可见的红色金标结合物。结合物通过毛细作用向前移动，抗原被包被于硝酸纤维膜（NC 膜）上的羊抗新城疫病毒抗体（多克隆抗体）捕获并截留，形成可见的紫红色检测线（简称 T 线）。如果样品中没有抗原，则不能形成红色的金标结合物，流过 T 线时不发生捕获截留，T 线保持白色。抗原抗体反应后未结合完的金标抗体继续层析与羊抗 Balb/C 小鼠免疫球蛋白抗体结合，形成第二条结合线（质控线，简称 C 线），若 C 线不显示红色，则检测结果无效。胶体金试纸卡结构如图 1 所示：图 1胶体金试纸卡结构示意图DB50/T 1407202325设备与耗材 级生物安全柜（洁净等级 100 级，对 0.3 m 颗粒过滤效率99.999%）、高速冷冻离心机（最高转速 22000 r/min，温度范围：20 40）、高压蒸汽灭菌器、电子天平（精确度 0.001 g）、玻璃匀浆器（5 mL）、移液器、棉拭子、塑料滴管、离心管。6材料胶体金试纸卡6.1.1可制备或采用商品化产品。试纸卡制备方法见附录 A。6.1.2应室温或冷藏保存。样品稀释液6.2.1可配制或采用商品化的 PBS 试剂（pH 7.2）。6.2.2配制按如下配方：氯化钠（NaCl）8 g、氯化钾（KCl）0.2 g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24 g，加蒸馏水至 1000 mL，将上述成分依次溶解，用盐酸（HCl）调 pH 至7.2，分装，121、15 min 高压灭菌。7样品前处理一般要求样品前处理应符合 SN/T 2984 的规定。泄殖腔和咽拭子将收集的泄殖腔和咽拭子插入盛有 0.8 mL1.0 mL 样品稀释液的离心管中，充分搅拌并反复挤压试管壁，使附着的分泌物充分洗脱，置 2 8，12,000 r/min 离心 10 min，取上清液待检。样品须立即进行检测，若无法立即检测应冷藏保存，超过 24 小时的，应冷冻保存。组织样品称取组织块 0.5 g，置于匀浆器中，加 pH 7.2 PBS 试剂 1 mL，研磨完全后取出组织匀浆液，置2 8，12,000 r/min 离心 10 min，取上清液待检。鸡胚尿囊液尿囊液样品置 2 8，12,000 r/min 离心 2 min，取上清液待检。细胞培养液反复冻融 3 次，将细胞培养液置 2 8，12,000 r/min 离心 2 min，取上清液待检。8样品检测取出胶体金试纸卡和样品恢复至室温，平放于桌面上，在试纸卡的加样孔中缓慢加入样品 23 滴（100 L150 L）。DB50/T 140720233水平放置 5 min10 min，观察结果。9结果判定阳性当试纸卡出现两条紫红色条带（T 线和 C 线），结果判为阳性，记为“”。阴性当试纸卡仅出现一条紫红色条带（C 线），结果判为阴性，记为“”。无效如试纸卡未出现 C 线，不论是否出现 T 线，结果均判为无效。10废弃物处理应符合 GB/T 39707 的规定。DB50/T 140720234AA附录A（资料性）新城疫病毒胶体金试纸卡的制备A.1单克隆抗体制备利用杂交瘤技术，通过细胞融合，筛选制成特异性新城疫病毒（NDV）单克隆抗体。该抗体针对NDV 血凝素，决定了试纸卡的特异性。A.2多克隆抗体制备A.2.1羊抗 NDV 抗体用纯化的 NDV 免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗 NDV抗体。该抗体可与金标抗体NDV 抗原抗体复合物结合，形成夹心抗原抗体复合物，用于胶体金试纸卡硝酸纤维膜（NC 膜）的捕获线。A.2.2羊抗 Balb/C 小鼠免疫球蛋白抗体用 Balb/C 小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗 Balb/C 小鼠免疫球蛋白抗体。该抗体用于硝酸纤维膜（NC 膜）的质控线，可与金标抗体结合，以此检验试纸卡的有效性。A.3金标抗体制备用氯金酸制备 30 nm 胶体金颗粒，将 NDV 单克隆抗体与胶体金颗粒按照 18 g/mL 进行标记，标记完后用牛血清白蛋白（BSA）进行封闭。标记好的金标抗体用高速离心法进行纯化，去除游离抗体和蛋白及其它小分子物质。采用 1 BSA 缓冲液将金标抗体悬浮保存。悬浮后的金标抗体在室温条件下能保存一年以上。A.4胶体金结合垫制备将玻璃纤维膜浸泡于 80 mM Na2B4O710H2O，0.1 PVA，0.1 Tween20，0.3 BSA 的处理液中，于 4 条件下浸泡 1012 h，37 烘干 45 h。将制备的金标抗体喷涂于处理过的玻璃纤维膜上，切成 50 mm 宽度，即制成胶体金结合垫。A.5胶体金样品垫制备样品垫浸泡于 80 mM Na2B4O710H2O，0.1 PVA，0.1 Tween20，0.3 BSA 的处理液中，在37 的温度下干燥 2 h 后，切成 40 mm 宽度，用于过滤样品中的有形成分，同时保证 NDV 抗原不变性。样品垫置于试纸卡的最前端，样品孔的下端。A.6试剂条板制备将处理好的胶体金样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC 膜）、吸水垫纸按顺序依次粘贴在试剂条板上。A.7NC 膜喷样在制备好的试剂条板的 NC 膜上分别喷涂捕获抗体（羊抗 NDV 抗体）和质控抗体（羊抗 Balb/C球蛋白抗体），线宽 1 mm，喷完后于 37 下干燥。A.8试剂条板切条和试纸卡组装DB50/T 140720235将 NC 膜喷有抗体的试剂条板切成 50 mm10 mm 的试纸条，立即放入内置干燥剂的铝箔袋内封口；或将试剂条板切成 30 mm10 mm 的试纸条放入塑料卡盒内，立即放入铝箔袋内封口。