一种基于光交联明胶-聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物_安玉川.pdf

第 卷第期 年月太原理工大学学报 引文格式：安玉川，成荣，孙蕾，等一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物太原理工大学学报，（）：，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（）；国家自然科学基金重点资助项目（）第一作者：安玉川（），硕士研究生，（）通信作者：桑胜波（），教授，博士生导师，主要从事皮肤组织工程再生方面的研究，（）一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物安玉川，成荣，孙蕾，桑胜波（太原理工大学 微纳传感与人工智能感知山西省重点实验室，新型传感器与智能控制教育部重点实验室，太原 ；山西省六维人工智能生物医学研究院，太原 ）摘要：从改善神经组织再生材料的理化性能角度出发，选择生物相容好的光交联明胶（）和亲水聚合物聚丙烯酰胺（）构建复合水凝胶支架，用于支持雪旺细胞生长。以纯 作为对照，分别测试不同浓度的光交联明胶聚丙烯酰胺复合水凝胶（）的形貌、理化性能和机械性能；观察雪旺细胞在支架上的生物相容性、增长情况以及分化程度。实验结果表明，可以改善 支架的机械性能，当 与 的质量分数分别为 和 时，该支架具有良好的生物相容性，可促进雪旺神经细胞分化。因此，开发基于 复合水凝胶支架可作为一种理想的神经组织工程构建物。关键词：光交联明胶；聚丙烯酰胺；雪旺细胞；神经组织工程中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（.，.，；.，）：，（）（），；，：；时至今日，神经损伤引发的神经功能障碍仍严重影响人类的健康与生活。在过去的几十年中，许多天然聚合物（如胶原、丝素蛋白）及合成聚合物被开发并成功用于周围神经损伤的修复。但效果仍然不如自体移植物，这是由于未达到周围神经修复的黄金标准。因此，开发用于神经再生的组织工程构建物仍具有很大的研究和临床价值。在 世纪 年代，有研究者将硅胶管成功应用于临床修复，但是它不可降解的特性，降低了神经修复效果，不利于神经组织的生长。因此，人们开始使用可降解的生物材料来制造神经组织工程构建物，如明胶、壳聚糖和海藻酸钠等，这类材料被广泛应用，但是其在机械性能方面仍有缺失。近年来，使用光固化明胶（）和甲基丙烯酰胺取代的弹性蛋白原（）的合成制备可调节的机械性能神经组织工程构建物，具有良好的实验结果，但该材料制作成本高，机械性能调节范围较小，仍具有一定的局限性。因此，研究可调节机械性能的复合生物材料仍有价值。是一种以明胶为基底，通过接枝反应使得甲基丙烯酸酐基团接入，进而生成可由蓝光引发聚合凝胶的生物合成材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，被广泛应用于生物组织再生，包括关节组织、心肌组织 等。但是，这种水凝胶在体内降解速率过快，且机械性能较弱，不利于神经组织细胞长期的黏附。聚丙烯酰胺（）是一种亲水性好且柔韧强的生物合成材料，具有良好的机械性能和可控的降解性能，现已广泛应用于生物化学及医药 领域。通过添加催化剂可激发 本身的光固化特性，提高复合水凝胶的可塑性，并且改变 的比例，可实现复合水凝胶的弹性调节 。然而，纯 水凝胶材料生物相容性较差，不适合作为组织工程神经构建物。综上所述，本文根据两种材料的特点，制备了 复合水凝胶作为雪旺细胞的体外三维生长环境，并表征了不同比例 复合水凝胶的形貌、理化性能和机械性能，同时测试了雪旺细胞在复合水凝胶上的体外生长状况，评估了支架对雪旺细胞生长、分化的影响，优化了复合水凝胶的混合比例，制备出机械性能强且生物相容性好的组织工程神经构建物。实验材料制备 制备由文献 可知，明胶与甲基丙烯酸酐（）能够发生接枝反应，将甲基丙烯基团引入到明胶上，得到可由紫光引发聚合的 具体操作方法如下：称取明胶加入到 磷酸缓冲盐溶液（溶液）中；将溶液整体移至 水浴锅中使明胶完全溶解，配成 的明胶溶液；将 的以 的速度加入到 的明胶溶液中，并且将上述溶液在 水浴锅中搅拌反应；随后加入 的 溶液（预热至），用于稀释 与明胶的反应溶液；后将反应液装入 的透析袋中；后将反应液离心，取上清液冷冻干燥得到 复合水凝胶制备首先将 蓝光引发剂溶于超纯水中配置成质量浓度为的溶液；加入 配置成 的光交联明胶溶液。然后向溶液加入预定比例的丙烯酰胺（）单体，搅拌均匀后，倒入直径为 的圆形模具中，在紫外灯下照射 ，固化聚合成 复合水凝胶支架。混合比例如表所示。表 和 的混合比例 样品 的混合比例 （：）（：）（：）复合水凝胶的性能测试傅里叶变换红外光谱使用红外光谱仪（德国，布 鲁 克光谱，）分析水凝胶的红外光谱。通过 压片法得到样品的傅里叶变换红外光谱（）在 分辨第期安玉川，等：一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物率下对每个样品在 范围内进行扫描，每个样品总共扫描了 次。溶胀率测试先将 复合水凝胶支架用天平称重（记为），再浸入 的 溶液中浸泡。分别在浸泡，后，将支架取出，吸出表面多余水分，测定此时的支架重量为，根据如下公式（）（）（）计算出不同时间间隔的溶胀率以及溶胀平衡状态下的溶胀率。机械性能测试通过电子材料试验机（美国，公司，）测定 复合支架的应力应变曲线。在室温下，以 的恒定速率压缩样品，采用变形 时的应力应变曲线斜率来计算杨氏模量，每个样品测量次取平均值。支架形貌分析用扫描电子显微镜（日本，高新公司，）分析不同混合浓度比例的复合水凝胶支架形貌。首先将复合材料支架冷冻干燥，再将支架进行喷金处理，最后在 加速电压下观察支架的微观形态。孔隙率表征首先制作不同比例的水凝胶支架各个，测量其体积；放入 溶液中浸泡至完全溶胀后测量重量记为；将水凝胶放入无水乙醇中，完全析出水分后，测量重量为；根据公式（）计算出孔隙率并取平均值，其中为酒精的密度。（）（）（）细胞活性检验在制作水凝胶支架时，将 溶液替换为 高糖培养基，同时通过培养液中的酚红指示剂来调节溶液的 值，增加材料支架富含的营养；将溶液经过滤头做除菌处理，制备成无菌的水凝胶支架；将水凝胶支架放入 孔板中用培养液浸泡，去除未交联的丙烯酰胺单体和催化剂；将第三代大鼠雪旺 细 胞以 的 密度 接 种在 混合支架上，置于培养箱中培养；分别在，进行细胞活性检测。细胞活性检测实验步骤如下：首先将支架用 冲洗两次，加入活细胞染色试剂（）染色孵育；用 清洗次，加入死细胞染料试剂（）染色；将支架用 溶液清洗次，放置于细胞成像多功能微孔板检测系统（美国，伯腾仪器有限公司，）中观察。细胞增殖检验细胞接种过程与细胞活性实验相同。在，分别检测了 的光度值，观察细胞增殖的情况。具体操作过程如下：首先将 孔板内的培养液吸出，同时用 溶液将细胞清洗次；将配置好的 染色剂加入 孔板中；将孔板重新放入培养箱中孵育；将孵育后的 染色剂移入 孔板内并除去气泡；放入细胞成像多功能微孔板检测系统中测量其吸光度。细胞形态检测将接种到支架上的细胞进行细胞骨架染色实验，观察不同比例支架上的细胞形态，统计细胞的伸长情况。具体实验步骤如下：将培养的水凝胶支架与细胞用 清洗预处理后待用；在 孔板中加入体积分数为的多聚甲醛将支架固定 ；加入 通透液通透 ；在避光条件下加入鬼闭环太染色试剂，并在室温条件下孵育 ；用 清洗后加入细胞核 染剂避光孵育 ；最后用 清洗干净，置于细胞成像多功能微孔板检测系统中拍照观察。细胞免疫检测将接种到支架上的细胞进行细胞免疫检测，观察不同比例支架上的细胞分化的形态。将培养后的复合材料支架进行预处理，过程如下：先用 清洗，再加入的多聚甲醛固定 ，最后加入 通透 细胞免疫检测实验过程如下：首先在室温条件下加入体积分数山羊血清封闭；在条件下加入 一抗溶液过夜；第二天在室温条件下加入羊抗兔二抗溶液孵育；用 清洗并加入 染剂避光孵育 ；最后用 清洗干净，置于细胞成像多功能微孔板检测系统中拍照观察。结果与讨论 水凝胶支架成分分析采用傅里叶变换红外光谱（）分析水凝胶的化学结构，笔者选取在 的范围内进行分析，如图所示。上酰胺与酰胺的特征峰分别处于 与 ，上酰胺的特征峰处于 ，水凝胶的红外光谱表现出酰胺键的特征峰为 （酰胺），（酰胺）和 （酰胺）这些呈掺杂状态下 键的拉伸，太 原 理 工 大 学 学 报第 卷图 、的红外光谱图 ，键的弯曲振动峰，和 的平面振动峰标志着两种物质已经充分交联，同时表明了光交联方法可以成功制备 水凝胶。复合水凝胶形貌分析通过扫描电子显微镜测试，观察复合水凝胶支架的内部结构以及孔隙的大小。如图所示，纯 与种不同比例的复合水凝胶都具有良好的通孔结构，这种通孔结构有利于细胞的黏附以及营养的交换，且孔径的大小随着 比例的增加而减小。纯 水凝胶的平均孔径约为 图 复合水凝胶支架不同比例的 图 ；而 与 比例为 时，水凝胶的平均孔径略有减小；当两者比例为时，水凝胶的平均孔径减小为 左右；当比例为时，水凝胶的平均孔径只有 左右。该现象是因为在 水凝胶交联的过程中，与 单体、自身以及 单体分别交联成孔，形成双网络结构，且该结构会随 质量浓度的增加而加强，从而减小复合水凝胶的平均孔径。水凝胶支架理化特性检测复合水凝胶的溶胀性和孔隙率，分析复合水凝胶的理化特性。图（）展示了不同时间段内水凝胶的溶胀率，在内，浓度比例越高的支架，溶胀的速率越快。从整个时间段来看，复合水凝胶的溶胀率一直高于纯 水凝胶的溶胀率。当浸泡至，所有水凝胶达到溶胀平衡保持不变。这表明了复合水凝胶支架对细胞营养液有较好的吸收作用。图（）记录了水凝胶在溶胀平衡时的溶胀率，纯 水凝胶的平衡溶胀比为，而 复合水凝胶的平衡溶胀比可达到，接近于纯 水凝胶的两倍，说明复合水凝胶具有更好的亲水性。这是因为 链具有良好的亲水性，而复合水凝胶中具有大量 链网络，从而提高了水凝胶的保水性，可以更好地储存细胞所需的培养液。不同浓度比例的复合水凝胶孔隙率如图所示。从图中可知纯 水凝胶的孔隙率为 左右，且随着 浓度的增加，水凝胶的孔隙率下降。这是因为 中 交联产生了 链网格，因此，水凝胶的交联密度随 浓度的增加而上升，从而导致孔隙直径的缩小以及孔隙率的减小，这与支架的微观内部结构分析结果相同。复合水凝胶机械性能纯 水凝胶与 复合水凝胶的压缩应力应变曲线如图所示。图（）为应力应变曲线，在应变 范围内应力曲线的斜率代表了复合水凝胶的韧性，斜率越大韧性越高。由此可以看出，混合比例为的 混合水凝胶韧性最强，且随着 比例下降，应力应变曲线斜率下降，证明了 的引入提高了第期安玉川，等：一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物图中表达 有显著的统计学差异图 复合水凝胶支架不同比例浓度 溶胀率及最终溶胀率 图中 表达 有显著的统计学差异图 复合水凝胶支架不同浓度比例的孔隙率 复合水凝胶的韧性。图（）为水凝胶的杨氏模量，通过对比，的 混合水凝胶表现了出了极高的强度，是纯 水凝胶的 倍以上。这是因为一方面 本身就具有良好的韧性与杨氏模量，它的加入使复合水凝胶机械性能提高；另一方面，根据的讨论可知，质量浓度增加，水凝胶孔径减小、孔壁增厚，从而提高了水凝胶图中 表达 有显著的统计学差异图 复合水凝胶支架不同浓度比例的应力应变曲线及杨氏模量 的抗压能力。这为神经细胞的黏附提供了良好的支撑环境。水凝胶支架生物相容性为了研究复合水凝胶支架的生物相容性，笔者对复合水凝胶进行了生物活性检测。图为细胞的活死染色图，绿色代表活性细胞，红色代表死细胞。笔者发现随着复合水凝胶中 浓度增加，细胞的总体数量与密度均下降。但当 质量浓度为时，支架的细胞活性检测与纯 水凝胶差距较小，这两组支架上的细胞分布均匀，细胞族群呈分散性分布。而 （）和 （）的支架都呈现出了雪旺细胞的聚集。通常均匀分散的细胞群有利于细胞生存功能的表达。因此，上述结果表明，适宜的 浓度并不会影响复合水凝胶的生物相容性，对雪旺细胞的生长行为无不良影响。细胞 的 活 性 图 如 图 所 示，这 是 通 过 测 量 吸光度量化细胞的数目。通过对比发现，随着培养时间的增加，除了 质量浓度 的复合水凝胶在第时细胞数量减少，其余比例水凝太 原 理 工 大 学 学 报第 卷图 复合水凝胶上细胞活死染色图 胶中细胞数量均增加。这一结果与细胞活性检测结果基本一致。综上，两组实验结果说明在当 的质量浓度为时，复合水凝胶支架生物兼容性良好，可以促进雪旺细胞的附着与生长。对 复合水凝胶支架上的细胞进行了细胞骨架染色，如图所示，绿色荧光代表了细胞骨架形态，蓝色荧光代表了细胞核的形态。由图可以看出，所有水凝胶支架上的细胞均有不同程度的伸展，大部分细胞的形态由圆形变成梭形，这是雪旺细胞分裂期生长的典型特征。尤其在 （）的支架上细胞的长度伸展到平均 左右，证明了该复合材料支架对雪旺细胞有很好的黏附和支撑作用。细胞的免疫荧光染色如图所示，通过 图 复合水凝胶上细胞活性 特定蛋白的染色表达，反映了雪旺细胞的分化蛋白表达情况。绿色荧光代表特定蛋白在细胞中的分布情况，蓝色为细胞核的位置。图中各比例支架上的细胞均有特定分化蛋白的表达，证明了复合材料支架能够支撑雪旺细胞的分化。对比不同比例的复合水凝胶支架，（）支架比其他支架的雪旺细胞轮廓清楚，蛋白染色表达清晰，说明该支架具有更好的雪旺细胞相容性。综上所述，与 比例为 的复合水凝胶在机械性能上优于纯 水凝胶，同时具有良好的细胞相容性，且雪旺细胞在该支架上的 增 殖 和 分 化 效 果 良 好。因 此，（）复合水凝胶可作为支撑雪旺神经细胞存活、生长、发育的基底材料。结论通过制备不同比例的 复合水凝胶支架，并对其形貌、理化特性、机械性能及体外的生物相容性、神经细胞轴突的分化情况进行了测试。结果表明当 与 比例为 时，复合水凝胶支架具有良好的理化性能和机械性能，同时支架上的雪旺细胞可以进行良好的生长与分化。因此，本文构建的 复合水凝胶材料兼顾了支架的机械性能和生物相容性，可作为一种理第期安玉川，等：一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物想的组织工程神经构建物。图 复合水凝胶上细胞骨架染色图 图 复合水凝胶上细胞的免疫荧光染色图 参考文献：，（）：，（）：，太 原 理 工 大 学 学 报第 卷 ，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：？，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：胥杰龙改性明胶聚丙稀酰胺复合水凝胶及其用于软骨缺损修复的研究成都：西南交通大学，：，（）：李媛媛，温瑜，李俊，等 复合水凝胶的制备与性能太原理工大学学报，（）：，（）：赵雅静，曹燕燕，申治中，等 基于胶原琼脂糖的组织工程表皮替代物构建研究 太原理工大学学报，（）：，（）：，（）：（编辑：朱倩）第期安玉川，等：一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物